恩格列凈改善高糖誘導HK-2細胞凋亡的機制探討

王美君?梁日英?徐芬?梁小奇?李綺芊?蔡夢茵

【摘要】目的 探討恩格列凈改善人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2細胞）凋亡的機制。方法 將HK-2細胞置于正常葡萄糖、高葡萄糖、高葡萄糖+不同濃度的恩格列凈共干預環境下培養48 h。采用蛋白免疫印跡法檢測腎臟沉默信息調節因子2相關酶1（SIRT1）、硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）以及裂解的半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）的表達水平。采用TUNEL染色評估HK-2細胞凋亡情況。結果 蛋白免疫印跡結果顯示，高葡萄糖培養48 h后HK-2細胞的TXNIP和cleaved Caspase-3表達水平均高于正常葡萄糖組，而SIRT1表達水平低于正常葡萄糖組（P均< 0.05）。1000 nmol/L恩格列凈和30 mmol/L葡萄糖共干預48 h后，HK-2細胞的TXNIP和cleaved Caspase-3的蛋白表達水平降低，SIRT1表達水平升高（P均< 0.001）。TUNEL染色結果顯示恩格列凈和30 mmol/L葡萄糖共干預組較30 mmol/L葡萄糖組TUNEL陽性細胞數少，且1000 nmol/L恩格列凈和30 mmol/L葡萄糖共干預組凋亡改善更明顯。結論 恩格列凈可能通過上調SIRT1的表達、抑制TXNIP表達，改善高糖誘導HK-2細胞凋亡。

【關鍵詞】恩格列凈;沉默信息調節因子2相關酶1;硫氧還蛋白互作蛋白;

糖尿病腎臟疾病;人腎皮質近曲小管上皮細胞

Mechanism of empagliflozin in mitigating HK-2 cells apoptosis induced by high glucose Wang Meijun， Liang Riying， Xu Fen， Liang Xiaoqi， Li Qiqian， Cai Mengyin. Department of Endocrinology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Cai Mengyin， E-mail： caimengyin@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the mechanism of empagliflozin in mitigating the apoptosis of human renal proximal tubule epithelial cells （HK-2 cells）. Methods HK-2 cells were incubated in normal glucose （NG） or high glucose （HG） combined without or with empagliflozin at different concentrations for 48 h. The expression levels of silent mating type information regulation 2 homolog 1（SIRT1）， thioredoxin-interacting protein （TXNIP） and cleaved Caspase-3 were determined by Western blot. The apoptosis of HK-2 cells was determined by TUNEL staining. Results Western blot demonstrated that the expression levels of TXNIP and cleaved Caspase-3 at 48 h in the HG group were significantly higher， whereas that of SIRT1 was remarkably lower compared with those in the NG group （all P < 0.05）. After combined interventions of 1000 nmol/L empagliflozin and 30 mmol/L glucose for 48 h， the expression levels of TXNIP and cleaved Caspase-3 were significantly down-regulated， whereas that of SIRT1 was considerably up-regulated （all P < 0.001）.TUNEL staining demonstrated that the number of TUNEL-positive cells in the empagliflozin combined with 30 mmol/L

glucose group was significantly less than that in the 30 mmol/L glucose group. In the 1000 nmol/L combined with 30 mmol/L glucose group， the cell apoptosis was more evident. Conclusion Empagliflozin can protect HK-2 cells from HG-mediated apoptosis probably by up-regulating the expression level of SIRT1 protein and down-regulating that of TXNIP protein.

【Key words】Empagliflozin;SIRT1;TXNIP;Diabetic kidney disease;

Human renal proximal tubule epithelial cells

中國 2型糖尿病（T2DM）患者中腎病患病率高達 30% ～ 50%，白蛋白尿和腎小球濾過率受損的患者10 年累積病死率達47%，給社會帶來極大的衛生經濟負擔[1]。強化降糖、降壓、ARB/ACEI雖可降低蛋白尿風險，但仍缺乏腎臟硬終點獲益的證據。恩格列凈心血管結局事件試驗（EMPA-REG OUTCOME）研究顯示恩格列凈治療組血清肌酐水平增加1倍的相對風險顯著降低44%、采用腎臟替代療法較安慰劑組的相對風險降低了55%[2-3]。鈉-葡萄糖共轉運蛋白2（SGLT2）抑制劑可改善腎小球血流動力學、腎小管能量代謝和腎臟疾病高危因素等，延緩糖尿病腎病的進展，但目前還不能完全解釋其腎臟保護機制。

2014年美國糖尿病協會（ADA）棄用糖尿病腎病名稱，改為糖尿病腎臟疾病（DKD），說明糖尿病腎功能損傷不僅僅與腎小球病變相關。據報道，腎小管變化與腎功能損傷緊密相關，比腎小球變化更能準確預測DKD的進展[4-5]。沉默信息調節因子2相關酶1（SIRT1）可調節特定賴氨酸殘基上的組蛋白，促進翻譯后修飾，從而導致染色質沉默和轉錄抑制[6]。激活SIRT1可改善部分代謝參數，如糖耐量、空腹血糖水平和胰島素抵抗，從而延長動物壽命[7]。SIRT1除了對代謝有益外，在DKD中還具有抑制足細胞和小管細胞損傷的保護作用[8-9]。很多研究已證實SIRT1與改善高糖誘導的腎臟細胞凋亡效應有關[10-11]。

基因芯片技術研究顯示硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）是高糖調節人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2細胞）基因中最顯著增加的基因，是葡萄糖毒性和細胞損傷之間的關鍵環節，提示抑制該蛋白可在DKD中發揮重要作用[12]。此外，敲除TXNIP基因已被證實可以限制系膜細胞和近端小管細胞葡萄糖誘導的膠原生成和氧化應激[12-13]。

有研究者用高糖誘導系膜細胞和小鼠腎臟組織 TXNIP 基因的乙酰化修飾上調蛋白的表達，發現TXNIP與小鼠的DKD相關[14]。這表明抑制TXNIP可能是一種治療DKD的新方法。本研究組旨在探討恩格列凈改善高糖誘導的HK-2細胞凋亡的作用以及SIRT1、TXNIP在其中的可能機制。

材料與方法

一、實驗材料

DMEM No Glucose培養基、Hams F-12 Nutrient

Mixture、澳洲胎牛血清 FBS QUALIFIED AUSTRALIA

ORIGIN購自英濰捷基（上海）貿易有限公司。葡萄糖粉末購自Sigma-Aldrich公司。恩格列凈購自Selleck生物科技有限公司。RIPA Lysis and Extraction Buffer、Halt? Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail購自美國Thermo Scientific公司。SIRT1抗體購自美國Merck Millipore公司。TXNIP抗體和裂解的半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3）抗體購自CST公司。TUNEL試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，Fluorescein）購自Roche公司。HK-2細胞購自中國科學院細胞庫。

二、實驗方法

1. HK-2細胞的培養和分組

單純給予不同濃度葡萄糖干預：取HK-2細胞種植于6孔板中分為3組并饑餓24 h，然后分別用5.5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖或50 mmol/L葡萄糖干預48 h，探討不同葡萄糖濃度對HK-2細胞SIRT1和TXNIP表達的影響。

給予30 mmol/L葡萄糖干預0、12、24 h：取HK-2細胞種植于6孔板中并饑餓24 h，然后用30 mmol/L葡萄糖干預0、12、24 h，探討30 mmol/L

葡萄糖在不同時間對HK-2細胞SIRT1和TXNIP表達的影響。

前2組僅單純給予葡萄糖干預，后3組給予不同濃度恩格列凈+高葡萄糖處理：取HK-2細胞種植于6孔板中分為5組并饑餓24 h，然后用5.5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖或用分別添加了250 nmol/L、500 nmol/L或1000 nmol/L恩格列凈工作液的30 mmol/L葡萄糖共干預48 h。

2.蛋白免疫印跡法檢測HK-2細胞各組蛋白相對表達水平

提取各組細胞蛋白，采用蛋白免疫印跡法檢測SIRT1、TXNIP和cleaved Caspase-3等蛋白的相對表達情況。

3.TUNEL染色法檢測細胞凋亡

將HK-2細胞培養在裝有細胞爬片的24孔板中并分為5組，正常糖組：葡萄糖量5.5 mmol/L;高糖組：葡萄糖量30 mmol/L;恩格列凈組：分別在30 mmol/L 高糖誘導時添加500 nmol/L、1000 nmol/L

恩格列凈工作液;陽性對照組：葡萄糖5.5 mmol/L+脫氧核糖核酸酶（DNase）。上述各組經干預48 h

后，使用4%多聚甲醛固定細胞，按照TUNEL染色試劑盒的方法進行染色，制片完成后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各組細胞的凋亡情況以及恩格列凈對高糖誘導HK-2細胞凋亡的影響。

三、統計學處理

采用SPSS 25.0進行統計分析，正態分布的計量資料以表示，符合正態分布和方差齊性的多組定量資料比較用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，否則采用Kruskal-Waillis秩和檢驗。藥物干預實驗計量資料只進行高糖組與其他組比較，其余實驗計量資料均進行兩兩比較。

α= 0.05。

結果

一、HK-2細胞在不同葡萄糖濃度下SIRT1和TXNIP相對表達水平

蛋白免疫印跡結果顯示，使用不同葡萄糖濃度培養48 h后，5.5、30、50 mmol/L葡萄糖組SIRT1/β-actin分別為1.000±0.243、0.129±0.030、

0.227±0.099，TXNIP/β-actin分別為1.000±0.502、46.852±11.646、56.585±22.095，3組SIRT1和TXNIP的表達水平比較差異均有統計學意

義（FSIRT1 = 28.631，PSIRT1 = 0.001;FTXNIP = 12.708，PTXNIP = 0.007）。與5.5 mmol/L葡萄糖組相比，30、50 mmol/L葡萄糖組SIRT1表達均下降（P30 < 0.001，P50 = 0.001），TXNIP均上升（P30 = 0.008，P50 = 0.003）。30 mmol/L葡萄糖組與50 mmol/L葡萄糖組相比，SIRT1和TXNIP差異均無統計學意義（PSIRT1 = 0.470，PTXNIP = 0.440），見圖1。

二、HK-2細胞用30 mmol/L葡萄糖干預不同時間后SIRT1和TXNIP蛋白相對表達水平

蛋白免疫印跡結果顯示，使用30 mmol/L

葡萄糖干預0、12、24 h，SIRT1/β-actin分別為

1.000±0.287、1.212±0.292、1.626±0.825，TXNIP/β-actin分別為1.000±0.917、0.341± 0.054、0.620±0.552。3組SIRT1和TXNIP的蛋白水平比較差異無統計學意義（FSIRT1 = 1.074，PSIRT1 = 0.399;FTXNIP = 1.206，PTXNIP = 0.363），見圖2。因此，可選擇30 mmol/L葡萄糖干預48 h進行高糖干預HK-2細胞的實驗條件。

三、恩格列凈改善高糖誘導HK-2細胞的凋亡

蛋白質免疫印跡結果顯示，培養48 h后，5.5 mmol/L葡萄糖組cleaved Caspase-3/β-actin為

1.000±0.297，高糖組（30 mmol/L）cleaved Caspase

-3/β-actin為9.263±0.791;分別給予250、500、1000 nmol/L的恩格列凈干預的高糖組cleaved Caspase-3/β-actin依次為8.686±1.005、5.967±0.458、1.083± 0.800。5組cleaved Caspase-3的蛋白水平比較差異有統計學意義（H = 12.300，P = 0.015）。高糖組的cleaved Caspase-3水平均高于5.5 mmol/L糖組（P < 0.001）和500、1000 nmol/L恩格列凈與高糖共干預組（P500 = 0.001，P1000 < 0.001）;高糖組的cleaved Caspase-3水平與250 nmol/L恩格列凈與高糖共干預組比較差異無統計學（P = 0.348），見圖3。

TUNEL染色結果顯示，30 mmol/L葡萄糖組較5.5 mmol/L 葡萄糖組調亡細胞數多;經恩格列凈干預后，500 nmol/L、1000 nmol/L恩格列凈與30 mmol/L葡萄糖共干預組較30 mmol/L 葡萄糖組凋亡細胞數少，見圖4。蛋白免疫印跡結果和TUNEL染色結果均顯示500 nmol/L和1000 nmol/L

恩格列凈能改善高糖誘導HK-2細胞的凋亡，且1000 nmol/L恩格列凈的效果更顯著。

4.不同濃度恩格列凈干預HK-2細胞后SIRT1、TXNIP的相對表達水平

蛋白免疫印跡結果顯示，干預48 h后，5.5 mmol/L葡萄糖組SIRT1/β-actin為1.000±0.034，高糖組（30 mmol/L）SIRT1/β-actin為0.318± 0.225，分別給予250、500、1000 nmol/L恩格列凈干預的高糖組的SIRT1/β-actin分別為0.316±0.117、0.774±0.117、1.660±0.576。5.5 mmol/L葡萄糖組

TXNIP/β-actin為1.000±0.294，高糖組（30 mmol/L）TXNIP/β-actin為63.257±15.802，分別給予250、500、1000 nmol/L恩格列凈干預的高糖組的TXNIP/

β-actin分別為51.954±10.264、47.105±9.828、25.163± 3.363。5組SIRT1和TXNIP的蛋白水平比較差異均有統計學意義（HSIRT1 = 11.551，PSIRT1 = 0.021;HTXNIP = 11.633，PTXNIP = 0.020）。高糖組與5.5 mmol/L葡萄糖組相比，SIRT1表達水平下降（P = 0.024），TXNIP表達水平升高（P < 0.001）。與高糖組相比，1000 nmol/L恩格列凈與高糖共干預組SIRT1表達水平升高，TXNIP表達水平下降（P均= 0.001）;高糖組與250、500 nmol/L恩格列凈與高糖共干預組SIRT1表達水平（P250 = 0.995，P500 = 0.158）和TXNIP表達水平（P250 = 0.181，P500 = 0.067）比較差異均無統計學意義，見圖5。由此可見，30 mmol/L 葡萄糖與1000 nmol/L 恩格列凈共干預48 h時可促進SIRT1表達和抑制TXNIP表達。

討論

2019年美國和歐洲糖尿病協會共識推薦對T2DM伴發慢性腎臟病患者在二甲雙胍基礎上加用SGLT2抑制劑。既往研究表明，高糖會引起腎小管細胞的凋亡[15]。本研究證實恩格列凈可改善高糖誘導HK-2細胞凋亡，與既往研究結果一致[16]。進一步研究顯示，恩格列凈可降低30 mmol/L葡萄糖誘導HK-2細胞TXNIP表達水平。以往的研究者發現，在糖尿病患者腎臟組織和糖尿病小鼠腎臟組織中TXNIP的mRNA水平均升高，TXNIP蛋白水平在腎臟結構異常之前已上調[17-18]。上述均提示腎靶向抑制TXNIP可能是預防和治療DKD的新策略。

ANDIS（All New Diabetics In Scania）是由瑞典Leif團隊創始于2008年的大型糖尿病隊列，目的是研究糖尿病的異質性，該團隊發現DKD在嚴重胰島素抵抗糖尿病（SIRD）患者中發病率最高，強調了胰島素抵抗對DKD的重要性;SIRD患者在診斷時腎小球濾過率已較低，表明腎臟損傷的病理過程在糖尿病診斷前就已開始[19]。增強胰島素敏感性或許可以預防這類患者的DKD。SIRT1與胰島素敏感性和糖脂代謝密切相關，研究證實SIRT1對糖尿病患者的腎臟起保護作用，能延緩糖尿病的發生及發展[20-21]。本研究中高糖培養的HK-2細胞SIRT1表達水平降低，予以恩格列凈治療后SIRT1表達水平升高，而TXNIP表達趨勢與之相反。亦有研究者發現SIRT1和TXNIP在抗衰老方面存在負相關關系，但是它們之間的調控方式尚未清楚[22]。TXNIP是能量平衡和營養感知的重要中介;TXNIP可以抑制脂肪過量誘導的胰島素抵抗，同時增加脂肪細胞的儲存能力[23]。SIRT1與TXNIP是否共同調節胰島素抵抗，改善腎臟細胞的凋亡也需要作進一步探討。

綜上所述，恩格列凈可能通過上調SIRT1表達及下調TXNIP表達來改善HK-2細胞凋亡。然而具體的調控機制，需分別沉默HK-2細胞目的基因SIRT1和TXNIP后再進行實驗以進一步證實。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-12-08）

（本文編輯：洪悅民）