黃體生成素受體對睪丸間質干細胞增殖分化的影響

汪富林?夏凱?馮鑫?莊錦濤?周明寬?廖武源?雷振明?項鵬?鄧春華?涂響安

【摘要】目的 探討黃體生成素受體（LHCGR）對睪丸間質干細胞（SLC）增殖及分化能力的影響。方法 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）及免疫熒光染色比較LHCGR-/-小鼠與LHCGR+/+小鼠睪丸內SLC標志物的表達情況。通過流式細胞術分選出SLC，進行5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）及CCK-8增殖實驗。同時誘導SLC向睪丸間質細胞（LC）分化，14 d后檢測上清液睪酮水平。qRT-PCR及免疫熒光檢測誘導分化后LC標志物表達水平。結果 LHCGR-/-小鼠睪丸內存在SLC，應用CD51標記并通過流式分選可獲得SLC。LHCGR-/-小鼠SLC EdU+細胞比例和CCK-8增殖曲線與LHCGR+/+小鼠比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。LHCGR-/-小鼠SLC誘導分化后培養基上清液睪酮平均水平僅為0.01 ng/ml，低于LHCGR+/+對照組的2.71 ng/ml

（P < 0.001），其誘導分化后細胞LC標記物的表達也低于LHCGR+/+小鼠（P均< 0.001）。結論 敲除LHCGR基因后，睪丸內存在SLC且能維持正常的增殖活性，但是分化為LC受阻。

【關鍵詞】黃體生成素受體;睪丸間質干細胞;增殖分化;睪丸間質細胞發育不良

Effect of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor on the proliferation and differentiation of stem Leydig cells Wang Fulin， Xia Kai， Feng Xin， Zhuang Jintao， Zhou Mingkuan， Liao Wuyuan， Lei

Zhenming， Xiang Peng， Deng Chunhua， Tu Xiangan. Department of Urology and Andrology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China

Corresponding author， Tu Xiangan， E-mail： tuxiangan@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the effect of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor （LHCGR） on the proliferation and differentiation of stem Leydig cells （SLCs）. Methods The expression levels of SLC markers in the testes between the LHCGR-/- and LHCGR+/+ mice were statistically compared by quantitative RT-PCR （qRT-PCR） and immunofluorescent staining. The CD51+ SLCs were sorted by flow cytometry and then subject to 5-ethynyl-2-deoxyuridine （EdU） and CCK8 assay. The SLCs were induced to differentiate into the testicular Leydig cells （LCs）. The testosterone level in the supernatant was detected after 14 d. The expression levels of LC markers after induced differentiation were quantitatively measured by qRT-PCR and immunofluorescent staining. Results SLCs were found in the testis of LHCGR-/- mice and these cells could be sorted by CD51 labeling and flow cytometry. The proportion of EdU+ cells and CCK-8 proliferation curve did not significantly differ between the LHCGR-/- and LHCGR+/+ SLCs （both P > 0.05）. After the induced differentiation of LHCGR-/- SLCs， the average testosterone concentration in the culture supernatant was 0.01 ng/ml， significantly lower than 2.71 ng/ml in the LHCGR+/+ mice （P < 0.001）. The expression levels of LC markers in the LHCGR-/- mice were significantly lower compared with those in the LHCGR+/+ mice （all P < 0.001）. Conclusion After LHCGR knockout， SLCs exist in the testis of LHCGR-/- mice and maintain normal proliferative activity. Nevertheless， the differentiation from SLCs into LCs is suppressed.

【Key words】Luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor;Stem Leydig cell;

Proliferation and differentiation;Leydig cell hypoplasia

黃體生成素受體（LHCGR）失活型突變是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病。男性患者可表現為小陰莖，尿道下裂甚至外生殖器完全女性化，嚴重影響男性性征發育、損害男性生育功能，給患者及家庭帶來嚴重的心理負擔[1]。其主要的發病機制是LHCGR失活引起睪丸間質細胞（LC）發育不良，導致睪酮合成不足，繼而引起生精阻滯[2]。目前臨床上睪酮替代療法對生育力的改善極其有限，而且長期激素替代會抑制精子產生[3-4]。針對該類患者，迫切需要新療法以恢復睪酮水平及重建生育力。

睪丸間質干細胞（SLC）是LC的前體細胞，能夠通過增殖及分化過程轉變為LC[5]。筆者團隊所進行的前期研究顯示，自體SLC移植能夠恢復老年食蟹猴的睪酮水平、促進精子發生，是睪酮缺乏相關疾病的理想治療方法[6]。另一方面，干細胞介導的基因修復在治療基因突變型疾病中發揮重要作用，如基因編輯后造血干細胞移植已經被歐盟批準用于治療β-珠蛋白生成障礙性貧血以及重癥聯合免疫缺陷病[7-8]。上述研究提示，經基因修復自體的SLC可能是治療LHCGR缺陷疾病的理想的種子細胞;但是LHCGR基因突變后，睪丸內是否存在SLC及其增殖和分化能力如何，筆者尚未見有相關報道。因此，本研究探究LHCGR敲除后，小鼠睪丸內SLC數量和增殖分化能力的變化，以探討自體SLC移植治療該類患者的可行性。

材料與方法

一、實驗動物

LHCGR+/-小鼠由雷振明教授惠贈，由LHCGR+/-小鼠繁育得到LHCGR-/-以及LHCGR+/+小鼠。分別選用7 ～ 14 d齡、體質量（5±2）g的LHCGR-/-以及LHCGR+/+雄性小鼠各10只;21 d齡（青春期）且體質量（10±2）g、56 d齡（成年期）且體質量（22±2）g的LHCGR-/-以及LHCGR+/+雄性小鼠各5只[9]。小鼠飼養在12 h光照/黑暗交替、溫度22～24 ℃、濕度50%～70%的SPF級飼養環境，自由采食、飲水。本實驗動物處理均符合中山大學附屬第一醫院倫理規范，動物倫理審批號為2020-003。

二、主要試劑

包括：TritonX-100（Sigma-Aldrich公司），DMEM/ F12培養基、牛血清白蛋白（BSA）、DAPI、防熒光淬滅劑（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），4%多聚甲醛（Phygene公司），OCT冷凍包埋劑（Sakura公司）;鼠抗Nestin（Arigo公司），兔抗血小板源性生長因子α（PDGFRα，Abcam公司），兔抗類固醇生成因子-1（SF-1）、鼠抗LHCGR（Novusbio公司），兔抗類固醇激素合成急性調節蛋白（STAR）、兔抗胰島素樣因子3（INSL3，Cell signaling Technology公司），鼠抗CD51-PE（R&D公司），羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（Invitrogen公司）。

三、方 法

1. 小鼠SLC原代細胞的分離及培養

無菌條件下分離小鼠雙側睪丸，剝離睪丸白膜，加入消化液，置于37 ℃搖床中以100轉/分消化15 min，然后用DMEM/F12終止消化，過濾，1100轉/分離心4 min，棄上清。使用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸并經濾網過濾后，1100轉/分離心4 min，棄上清。加入適量的1%BSA重懸細胞，分為染色組及同型對照組;染色組中按照1∶50的比例加入鼠抗CD51-PE，對照組加入相應的同型對照，常溫避光孵育20 min，加入PBS洗滌多余的抗體，1100轉/分離心4 min，棄上清。將細胞沉淀用PBS重懸至流式上樣管中，通過MoFloAstrios EQs流式細胞分選儀獲得SLC，SLC于前述報道SLC培養基中培養[10]。分選獲得的細胞記為P0，以后每傳一代細胞記為Pn。

2. 免疫熒光染色

使用LHCGR-/-以及同窩的LHCGR+/+雄性小鼠睪丸，置于4%多聚甲醛中浸泡2 h，換高糖（30%）浸泡過夜，然后用OCT包埋睪丸，冰切機切成10 μm厚組織于載玻片上。組織染色時取組織切片于56 ℃烤箱中孵育15 min后，用PBS洗3次。0.2%Triton穿透15 min后，PBS洗1遍，10%山羊血清、2%BSA于PBS中封閉45 min，加一抗孵育過夜;PBS洗5次，加相應的二抗孵育45 min后，PBS洗5次。滴加DAPI，PBS洗2次。使用防熒光淬滅劑封片。用LSM800或Leica DMi8拍照。細胞染色時，取培養好的細胞，PBS清洗1次;甲醛固定15 min后PBS洗2次。0.2%Triton穿透

15 min，后續步驟同組織切片染色。

3. 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

為了探究LHCGR敲除之后，睪丸內是否還存在SLC。首先通過qRT-PCR檢測了青春期及成年期小鼠睪丸組織SLC標記物CD51、巢蛋白（Nestin）、PDGFRα以及無芒相關同源異型盒基因（ARX）的表達水平[5， 11-14]。從睪丸組織或細胞中抽提RNA。RNA濃度及純度由紫外分光光度計（NanoDrop 1000）測定。使用模板DNA合成試劑盒（Novoprotein）進行逆轉錄。PCR程序按照廠家推薦的方案進行，使用羅氏LightCycle 480 qRT-PCR儀檢測。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物合成序列見表1。以β-actin為內參，根據△Ct計算靶基因表達水平，并以相對表達量的形式報告結果。每組測量3個樣品，每個樣品均重復測量3次后取平均值。

4. 睪丸SLC增殖能力檢測

取P2代的LHCGR-/-及LHCGR+/+小鼠SLC用于增殖實驗。5-乙炔基-2-脫氧尿苷（EdU）增殖實驗具體步驟為：將P2代SLC消化之后，種植于24孔板中，種植密度為105個/孔。培養箱中過夜后，用培養基將EdU稀釋至2倍工作液，半量換液加入到孔中2 h后染色，染色按照試劑盒說明書步驟進行。用Leica DMi8顯微鏡進行拍照，每組設8孔，每孔隨機取3個視野計算EdU+細胞比例平均值。細胞CCK-8實驗按標準操作程序進行：將細胞種植在96孔板中，種植細胞量為2×103

個/孔。待細胞貼壁后，連續5 d用Infinite F200 Pro酶標儀檢測吸光度并記錄。每組設20孔，重復測量3次吸光度值后取平均值。

5. 睪丸SLC分化能力檢測

睪丸SLC分化液的配制和先前報道的類似[15]。具體為：DMEM/F12培養基中加入2%胎牛血清、10 ng/ml黃體生成素（LH）、1 nmol/L甲狀腺激素、1 ng/ml白血病抑制因子、10 ng/ml血小板源性生長因子AA、50 ng/ml胰島素樣生長因子1和1%胰島素-轉鐵蛋白-硒。將P2代SLC傳至6孔板，待細胞長至50%左右時，半換液加誘導分化培養基。每2 d換液，誘導14 d后，取24 h上清液用化學發光法檢測睪酮（金域公司），每組測量6孔。誘導分化后細胞qRT-PCR及免疫熒光檢測如前所述。每組測量3個樣品，每個樣品均重復測量3次后取平均值。

四、統計學處理

利用GraphPad Prism 8.2.1制圖，使用SPSS 25.0分析數據。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，重復測量資料采用重復測量方差分析。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、LHCGR-/-小鼠睪丸內存在SLC

qRT-PCR檢測結果顯示，青春期LHCGR-/-小鼠SLC標記物表達水平與LHCGR+/+小鼠比較差異無統計學意義（CD51 t = 0.392、P = 0.714，Nestin t = 0.009、P = 0.993，PDGFRα t = 0.594、P = 0.584，ARX t = 1.185、P = 0.301），見圖1A。成年期LHCGR-/-小鼠睪丸內SLC數量比青春期時減少，但LHCGR-/-小鼠SLC標記物ARX、Nestin表達高于LHCGR+/+小鼠（ARX t = 3.196、P = 0.033，Nestin t = 3.947、P = 0.017），CD51、PDGFRα表達呈升高趨勢但組間比較差異無統計學意義（CD51 t = 2.326、P = 0.081，PDGFRα t = 1.968、P = 0.120），見圖1A。免疫熒光檢測結果顯示，無論是青春期還是成年期的 LHCGR-/-小鼠，SLC標記物Nestin和PDGFRα的表達均高于LHCGR+/+小鼠（青春期Nestin t = 9.865、P < 0.001，PDGFRα t = 14.640、P < 0.001;成年期Nestin t = 21.170、

P < 0.001，PDGFRα t = 4.176、P = 0.006），見圖1B～E。

二、LHCGR-/-小鼠SLC的分離及鑒定

通過用SLC特異性標記物CD51的流式抗體，從LHCGR-/-小鼠中分離出一群CD51+的細胞，見圖2A;分選下來的細胞在鏡下呈典型的長梭形的干細胞形態，見圖2B。進一步對SLC的純度進行了鑒定。通過細胞免疫熒光檢測Nestin、PDGFRα的表達，發現99.0%的CD51+細胞表達Nestin，93.1%的CD51+細胞表達PDGFRα，進一步證實了LHCGR-/-小鼠分選獲得的細胞為高純度的SLC，見圖2C、D。

三、LHCGR-/-小鼠SLC的增殖能力分析

P2代LHCGR-/-小鼠SLC與EdU共孵育2 h后，其EdU+細胞比例為14.57%;與LHCGR+/+小鼠（陽性細胞比例為14.63%）比較差異無統計學意義（t = 0.025，P = 0.980），見圖3A、B。SLC與CCK-8共孵育1 h后，2組SLC的吸光度值均隨時間升高，且LHCGR-/-小鼠與LHCGR+/+小鼠CCK-8增殖曲線比較差異無統計學意義（F處理=0.331，P = 0.569;F時間=33.015，P < 0.001;F交互=0.143，P = 0.966），見圖3C。

四、LHCGR-/-小鼠SLC分化成LC受阻

使用誘導分化培養基誘導小鼠SLC分化后14 d，LHCGR+/+小鼠細胞培養基中睪酮平均水平達2.71 ng/ml，與之相對應的分化后LHCGR-/-小鼠細胞培養基中睪酮平均水平僅為0.01 ng/ml （t = 6.768，P < 0.001），提示LHCGR-/-小鼠SLC不能分化為具有產睪酮能力的LC，見圖4A。qRT-PCR檢測結果顯示，LHCGR-/-小鼠SLC經過誘導后LC標記物STAR、SF-1、INSL3的mRNA表達低于LHCGR+/+小鼠（STAR t = 26.847、P < 0.001，SF-1 t = 36.956、P < 0.001，INSL3 t = 27.823，P < 0.001），見圖4B。免疫熒光染色檢測結果顯示，LHCGR-/-小鼠SLC誘導分化后不表達LHCGR、STAR、SF-1、INSL3等LC標志蛋白，進一步提示LHCGR-/-小鼠SLC分化受阻，見圖4C。

討論

人LHCGR位于2號染色體短臂上，具有12個外顯子，其編碼的蛋白是具有7次跨膜結構的G蛋白耦聯受體。LHCGR失活型突變是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病。目前已有多例報道LHCGR失活型突變引起的男性性腺發育不良[16-18]。其主要的發病機制是LC發育不良導致睪酮合成不足[2]。Lei等（2004年）利用超生理劑量（4 ～ 8倍生理劑量）的睪酮可以部分重建LHCGR-/-小鼠生育力。但是超生理劑量的睪酮會引起睪丸變小、抑制生精、情緒改變、頭痛等不良反應，無法應用于臨床[3]。SLC是LC的前體細胞，研究發現SLC移植能恢復衰老以及損傷引起的睪酮低下小鼠模型的睪酮水平[6]。Lo等（2004年）也發現睪丸側群細胞移植可以恢復LHCGR-/-小鼠的睪酮水平以及改善生精功能。但是異體的SLC移植可能會引起免疫排斥，阻礙細胞療法的臨床轉化。筆者前期研究發現，自體SLC移植可恢復衰老食蟹猴的睪酮水平，減輕睪酮缺乏相關癥狀[6]。因此針對LHCGR失活型突變來說，自體SLC移植可能是潛在的解決方案。而LHCGR失活型突變個體中是否存在SLC及其增殖和分化能力如何，筆者尚未見有相關報道。

本研究通過檢測睪丸內SLC標記物mRNA及蛋白的表達，結果顯示LHCGR-/-小鼠睪丸內存在SLC，且與LHCGR+/+小鼠相比，成年時睪丸中SLC比例更高，這可能與生精細胞比例較低有關。本研究進一步根據既往文獻使用CD51作為標志物，通過流式細胞分選技術獲得了SLC[19]。結果顯示，原代SLC呈典型的長梭形的干細胞形態。盡管Chen等[20]報道成年小鼠CD51強陽性的細胞為巨噬細胞，但是本研究分離獲得SLC的小鼠日齡為7 ～ 14 d，相對而言，巨噬細胞含量較少，流式細胞分選也并未看到明顯的分群。另外，本研究的免疫熒光染色結果顯示，99.0%的CD51+的細胞表達SLC標記物Nestin，進一步提示分選后細胞為高純度的SLC。

增殖和分化是干細胞最重要的特性。本研究顯示，LHCGR-/-小鼠SLC具有正常的增殖能力，但是不能分化為具有產睪酮能力的LC，提示LHCGR失活型突變會引起SLC分化受阻。與之相對應地，文獻報道LHCGR-/-小鼠和LHCGR失活型突變患者睪丸內僅有極少數發育不良的睪丸間質細胞[9]。但是目前尚不清楚LHCGR突變之后引起SLC分化受阻的原因?？赡芘cSLC細胞分化需要LH的刺激，而LHCGR突變之后，細胞喪失了對LH的反應性有關。LH作用于LHCGR可激活下游信號分子環磷酸腺苷，因此直接的環磷酸腺苷刺激能否促進LHCGR-/-小鼠SLC分化仍待進一步研究闡明。

總之，LHCGR基因敲除小鼠睪丸內存在SLC，且能使用CD51標記細胞通過流式分選出該群細胞。該類小鼠的SLC增殖能力正常，但是不能分化為具有產睪酮能力的LC。提示直接的SLC自體移植可能不適用于該類患者，文獻報道LHCGR突變往往是由點突變引起，通過基因編輯體外修復SLC后移植可能是該類疾病的解決方案[21]。

參 考 文 獻

[1] Wisniewski AB， Batista RL， Costa EMF， Finlayson C， Sircili MHP， Dénes FT， Domenice S， Mendonca BB. Management of 46，XY differences/disorders of sex development （DSD） throughout life. Endocr Rev，2019，40（6）：1547-1572.

[2] Teerds KJ， Huhtaniemi IT. Morphological and functional maturation of Leydig cells： from rodent models to primates. Hum Reprod Update， 2015， 21（3）：310-328.

[3] Halpern JA， Brannigan RE. Testosterone deficiency. JAMA， 2019， 322（11）：1116.

[4] 羅道升，鄧春華. 遲發性性腺功能低下的研究進展. 新醫學， 2007， 38（12）：821-822.

[5] Jiang MH， Cai B， Tuo Y， Wang J， Zang ZJ， Tu X， Gao Y， Su Z， Li W， Li G， Zhang M， Jiao J， Wan Z， Deng C， Lahn BT， Xiang AP. Characterization of Nestin-positive stem Leydig cells as a potential source for the treatment of testicular Leydig cell dysfunction. Cell Res， 2014， 24（12）：1466-1485.

[6] Xia K， Chen H， Wang J， Feng X， Gao Y， Wang Y， Deng R， Wu C， Luo P， Zhang M， Wang C， Zhang Y， Zhang Y， Liu G， Tu X， Sun X， Li W， Ke Q， Deng C， Xiang AP. Restorative functions of autologous stem leydig cell transplantation in a testosterone-deficient non-human primate model. Theranostics， 2020， 10（19）：8705-8720.

[7] Aiuti A， Roncarolo MG， Naldini L. Gene therapy for ADA-SCID， the first marketing approval of an ex vivo gene therapy in Europe： paving the road for the next generation of advanced therapy medicinal products. EMBO Mol Med， 2017， 9（6）：737-740.

[8] Schuessler-Lenz M， Enzmann H， Vamvakas S. Regulators advice can make a difference： european medicines agency approval of zynteglo for beta thalassemia. Clin Pharmacol Ther， 2020， 107（3）：492-494.

[9] Lei ZM， Mishra S， Zou W， Xu B， Foltz M， Li X， Rao CV. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Mol Endocrinol， 2001， 15（1）：184-200.

[10] Feng X， Xia K， Ke Q， Deng R， Zhuang J， Wan Z， Luo P， Wang F， Zang Z， Sun X， Xiang AP， Tu X， Gao Y， Deng C. Transplantation of encapsulated human Leydig-like cells： a novel option for the treatment of testosterone deficiency. Mol Cell Endocrinol， 2021， 519：111039.

[11] Guan X， Chen P， Zhao X， Hao X， Chen F， Ji M， Wen X， Lin H， Ye L， Chen H. Characterization of stem cells associated with seminiferous tubule of adult rat testis for their potential to form Leydig cells. Stem Cell Res， 2019， 41：101593.

[12] Stanley E， Lin CY， Jin S， Liu J， Sottas CM， Ge R， Zirkin BR， Chen H. Identification， proliferation， and differentiation of adult Leydig stem cells. Endocrinology， 2012， 153（10）：5002-5010.

[13] Miyabayashi K， Katoh-Fukui Y， Ogawa H， Baba T， Shima Y， Sugiyama N， Kitamura K， Morohashi K. Aristaless related homeobox gene， Arx， is implicated in mouse fetal Leydig cell differentiation possibly through expressing in the progenitor cells. PLoS One， 2013， 8（6）：e68050.

[14] Ge RS， Dong Q， Sottas CM， Papadopoulos V， Zirkin BR， Hardy MP. In search of rat stem Leydig cells： identification， isolation， and lineage-specific development. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（8）：2719-2724.

[15] Xia K， Ma Y， Feng X， Deng R， Ke Q， Xiang AP， Deng C. Endosialin defines human stem Leydig cells with regenerative potential. Hum Reprod， 2020， 35（10）：2197-2212.

[16] Aktar Karakaya A， Unal E， Be?ta? A， Ta? F， Onay H， Haspolat YK. A novel variant in? LCHGR gene in 3 siblings with type 1 Leydig cell hypoplasia. Gynecol Endocrinol， 2020， 36（12）：1136-1139.

[17] Hassan HA， Essawi ML， Mekkawy MK， Mazen I. Novel mutations of the LHCGR gene in two families with 46，XY DSD causing Leydig cell hypoplasia I. Hormones （Athens）， 2020 ， 19（4）：573-579.

[18] Yu BQ， Liu ZX， Gao YJ， Wang X， Mao JF， Nie M， Wu XY. Prevalence of gene mutations in a Chinese 46，XY disorders of sex development cohort detected by targeted next-generation sequencing. Asian J Androl， 2021， 23（1）：69-73.

[19] Zang ZJ， Wang J， Chen Z， Zhang Y， Gao Y， Su Z， Tuo Y， Liao Y， Zhang M， Yuan Q， Deng C， Jiang MH， Xiang AP. Transplantation of CD51+ stem leydig cells： a new strategy for the treatment of testosterone deficiency. Stem Cells， 2017， 35（5）：1222-1232.

[20] Chen P， Guan X， Zhao X， Chen F， Yang J， Wang Y， Hu Y， Lian Q， Chen H. Characterization and differentiation of CD51+ stem leydig cells in adult mouse testes. Mol Cell Endocrinol， 2019， 493：110449.

[21] Qiao J， Han B. Diseases caused by mutations in luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor. Prog Mol Biol Transl Sci， 2019，161：69-89.

（收稿日期：2021-03-08）

（本文編輯：林燕薇）