抗耐藥結核病新藥吡法齊明通過醌氧化還原酶介導發揮作用的機制研究

張蕾 李媛媛 陳曦 劉海婷 徐建 王寧 丁楊明 陸宇

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的，嚴重危害人類健康的呼吸道傳染性疾病，至今仍是造成死亡人數最多的單一傳染病之一[1]。隨著耐多藥結核病(MDR-TB)的傳播和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的出現，強效的一線抗結核藥品作用受限，而二線抗結核藥品又存在費用高、療程長、治愈率低、不良反應大等問題。目前全球結核病的治愈率為83%，而MDR-TB和XDR-TB的治愈率則僅有54%(中國為41%)和30%[2]。現有抗結核藥物不能滿足臨床治療需求，迫切需要具有新作用機制的抗結核藥物。

近年來氯法齊明(clofazimine，Cfz)的抗結核活性已得到證實，多項含Cfz的短程化療方案均取得了令人矚目的治療效果，2019年的WHO耐多藥或利福平耐藥結核病治療指南[3]和《中國耐多藥和利福平耐藥結核病治療專家共識(2019年版)》[4]都把Cfz作為治療耐藥結核病的核心藥品。但是，Cfz導致的皮膚紅染等不良反應使得Cfz的廣泛應用受到限制。吡法齊明(pyrifazimine，TBI-166)是在Cfz結構基礎上改造獲得的新型亞胺吩嗪類抗結核藥品，是中國第一個擁有自主知識產權的抗結核新藥。TBI-166的體外活性更高，且對藥物敏感結核分枝桿菌、耐藥結核分枝桿菌、胞內結核分枝桿菌和非復制期結核分枝桿菌均有效[5]。最重要的是，其引起的皮膚染色卻比Cfz少，目前已開展Ⅱ期臨床試驗(登記號：CTR20202345)，具有臨床應用價值。

本課題組對TBI-166的作用機制進行初步的探討，證實了TBI-166可能與Cfz有相似的作用機制，通過累積活性氧(reactive oxygen species，ROS)發揮殺菌作用[6]。并且利用蛋白質組學技術量化分析結核分枝桿菌受到TBI-166作用后蛋白表達的改變，發現差異蛋白醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase, QOR；A0A045HJH7)在TBI-166處理組各樣本中均有顯著變化。本研究是利用分子生物學的方法對MtbQOR蛋白進行表達純化，鑒定TBI-166對MtbQOR介導的氧化還原反應的影響，同時研究了TBI-166處理結核分枝桿菌后NADPH/NADP+比值的變化以及結核分枝桿菌標準菌株及臨床分離菌株內ROS含量的變化。對TBI-166的抗結核作用機制開展進一步的探索。

資料和方法

一、實驗菌株

結核分枝桿菌標準株H37Rv(ATCC 27294)，MDR-TB 患者的結核分枝桿菌臨床分離株菌株號為11195及11492(對TBI-166及Cfz耐藥)、12897(對TBI-166及Cfz敏感)、15171(對TBI-166敏感，對Cfz耐藥)由首都醫科大學附屬北京胸科醫院/北京市耐藥結核病重點實驗室保存并提供，對TBI-166及Cfz的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)通過微孔培養顯色法(microplate alamar blue assay，MABA)進行測定。

二、實驗藥物

TBI-166[純度≥99.0%，由中國醫學科學院藥物研究所(北京)黃海洪教授課題組提供]、異煙肼(美國Sigma公司；批號：060M0090；質量：50 g；純度≥99.0%)、利福平(RFP；美國Sigma公司；批號：WXBB7288V；質量：5 g；純度≥97.0%)。

三、儀器與試劑

1.儀器：Infinite 200多功能酶標儀(瑞士Tecan 公司)、Nuaire701二氧化碳恒溫培養箱(美國Nuaire 公司)、GENEPRO多功能基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)、DS-11FX超微量分光光度計(美國DeNovix公司)、Tanon-4200全自動數碼凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)、AKTA pure 25蛋白純化系統(美國Gene公司)、SYNERGY酶標儀(美國 BIOTEK 公司)、1730R微量高速冷凍離心機(美國Gene公司)、Max-Q8000低溫搖床(美國Thermo公司)。

2.試劑：pET32a質粒(重慶優寶生物技術股份有限公司；批號：y32014)、BamHⅠ[寶生物工程(大連)有限公司；批號：AHG2027A]、XhoⅠ[寶生物工程(大連)有限公司；批號：AG60621A]、E.coli BL21(DE3)(北京全式金生物技術有限公司；批號：O20811)、細菌ROS檢測試劑盒(上海貝博公司；批號：BB20081)、叔丁基過氧化氫(TBHP；美國Sigma公司；批號：SHBB7856V)、輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司；批號：20191223)、菲醌(上海麥克林生化科技有限公司；批號：C10005539)、NADPH(還原型輔酶Ⅱ；上海碧云天生物技術有限公司；批號：091919201106)。

四、MtbQOR蛋白表達與純化

采用PCR方法從滅活的H37Rv菌株中擴增MtbQOR(Rv1454c)基因，并克隆至BamHⅠ和XhoⅠ限制位點之間的pET32a質粒，得到的蛋白在MtbQOR的N-末端含有硫氧還蛋白/His6標簽，相對分子質量約為53 000。MtbQOR在Luria-Bertani培養基(含100 μg/ml氨芐青霉素)大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。當生長至對數生長期(A600 nm達到0.6)，用0.5 mmol/L IPTG誘導培養18 h。細胞在室溫下8000×g離心機離心15 min，然后在含有25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、pH 8.0的裂解緩沖液中再懸浮和裂解。上清液在12 000×g離心機離心40 min，得到含有可溶性靶蛋白的上清液加載到Ni柱。靶蛋白使用含有25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH值 8.0的洗脫緩沖液進行洗脫。將含有蛋白質的組分匯集在一起，進行濃縮除鹽，并在-80 ℃下儲存至進一步使用。通過SDS-PAGE估計蛋白質的純度>95%。

五、TBI-166對MtbQOR介導的氧化還原反應影響

MtbQOR介導的氧化還原反應特異的以NADPH為H+供體，NADPH在波長340 nm下有特異吸收峰，通過酶標儀檢測吸光度值(A340 nm)下NADPH下降程度(ΔA)可以反映MtbQOR介導的氧化還原反應發生程度。反應在25 ℃，150 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.0，0.12 mmol/L NADPH，0.05 mg/ml MtbQOR，25 μmol/L底物混合體系中測定。通過添加含有MtbQOR蛋白質的相同緩沖溶液作為反應開始，立即測定波長340 nm下的初始吸光度值A1，在不加入TBI-166或加入不同濃度的TBI-166情況下測定20 min后波長340 nm下的吸光度值A2，計算ΔA=A1-A2[7-8]。

六、結核分枝桿菌ROS含量測定

H37Rv菌株和各臨床分離菌株生長至對數生長期，對H37Rv菌株設置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)、加RFP組(0.025、0.25、2.5 μg/ml)、空白對照組及陽性對照組；對各臨床分離菌株設置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)、空白對照組及陽性對照組，陽性對照組為TBHP處理組，在藥物作用24 h后進行取樣[9]。通過8000×g離心機離心10 min獲得細菌培養物并重新懸浮，在O11探針中37 ℃避光孵育30 min。8000×g離心機離心10 min收集菌體，在磷酸鹽緩沖液中洗滌，并在測量前再次重懸，將200 μl每個樣品裝入黑色底部透明96孔板中。設置激發波長488 nm，發射波長526 nm檢測熒光值。

七、結核分枝桿菌NADPH/NADP+比值測定

采用輔酶Ⅱ NADP(H)含量檢測試劑盒對結核分枝桿菌NADPH/NADP+比值進行測定。H37Rv菌株生長至對數生長期，設置加TBI-166組(0.03、0.3、3 μg/ml)及空白對照組，在藥物作用6、12、24、48、96 h后進行取樣。通過8000×g離心機離心10 min 獲得細菌培養物，分別用酸性和堿性提取液提取結核分枝桿菌中的NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，可以使氧化型噻唑藍(MTT)還原為甲瓚，使用酶標儀在波長570 nm下檢測吸光度值。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH，從而檢測NADP+含量。進而計算兩者比值。

八、統計學處理

結 果

一、MtbQOR蛋白表達、純化

對經IPTG誘導的重組菌株BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c進行SDS-PAGE分析，在相對分子質量約53 000處出現目的蛋白條帶，而菌株BL21(DE3)及空載菌株BL21(DE3)-pET32a無此條帶(圖1)，表明Rv1454c基因在大腸桿菌中得到了成功表達。目的蛋白在細菌裂解上清和包涵體均有表達，收集上清用Ni-NTA親和純化柱純化目的蛋白，通過Western Blot確定是目的蛋白(圖2)并且通過SDS-PAGE確定得到的蛋白純度>95%(圖3)。

注 M：蛋白質相對分子質量標準；l：BL21(DE3)全菌；2:不含目的蛋白重組BL21(DE3)-pET32a全菌；3：上樣緩沖液；4：未誘導重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；5：誘導2 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；6：誘導4 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；7：誘導16 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌；8: 誘導18 h重組BL21(DE3)-pET32a-Rv1454c全菌圖1 重組蛋白Rv1454c的SDS-PAGE電泳分析

注 M:蛋白質相對分子質量標準；1:Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白圖2 Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白Western Blot驗證

注 M:蛋白質相對分子質量標準；1:Ni-NTA純化后的Rv1454c蛋白圖3 純化的重組蛋白Rv1454c SDS-PAGE電泳分析

二、MtbQOR介導的氧化還原反應監測

隨著加入TBI-166濃度的增高，NADPH下降的程度(ΔA)更大。與空白對照組ΔA(0.316±0.032)比較，0.03、0.3、3 μg/ml TBI-166組ΔA(0.506±0.107、0.531±0.054、0.801±0.079)差異有統計學意義(t=-3.799，P<0.05；t=-7.634，P<0.01；t=-12.683，P<0.01) (圖4)。

注 ΔA為波長340 nm下NADPH吸光度的下降程度， a：P<0.05，b：P<0.001圖4 不同濃度TBI-166對MtbQOR介導的氧化還原反應影響

注 A～E圖分別是不同濃度TBI-166作用6、12、24、48及96 h的NADPH/NADP+比值圖5 不同濃度TBI-166作用H37Rv不同時間NADPH/NADP+比值

三、不同濃度TBI-166作用H37Rv標準株后NADPH/NADP+比值測定

不同濃度TBI-166作用H37Rv標準株后分別對作用6、12、24、48、96 h的NADPH/NADP+的比值進行檢測，結果顯示(圖5)，在6、12、24及48 h與同一檢測時間點空白對照組相比，加入TBI-166藥物的各處理組NADPH/NADP+的比值均降低，空白組的NADPH/NADP+的比值為1.728±0.384，而加TBI-166組的NADPH/NADP+比值為0.847±0.229。并且，隨著作用時間的延長，NADPH/NADP+的比值逐漸降低，在TBI-166作用48 h之后，NADPH/NADP+的比值達到最低，而在96 h，各TBI-166組的NADPH/NADP+的比值上升接近空白對照組的比值(圖6)。

圖6 不同濃度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+比值隨時間變化曲線

注 A：不同濃度TBI-166作用H37Rv 24 h后ROS熒光值；B：不同濃度RFP作用H37Rv 24 h后ROS熒光值；C：不同濃度TBI-166作用菌株12897 24 h后ROS熒光值；D：不同濃度TBI-166作用菌株15171 24 h后ROS熒光值；E：不同濃度TBI-166作用菌株11492 24 h后ROS熒光值；F：不同濃度TBI-166作用菌株11195 24 h后ROS熒光值，a:P<0.05，b:P<0.01，c:P<0.001圖7 不同濃度TBI-166刺激各菌株24 h菌體ROS熒光值

四、不同濃度TBI-166刺激結核分枝桿菌各菌株后的菌體細胞ROS含量測定

TBI-166刺激H37Rv標準株及各臨床分離株后的菌體細胞熒光強度值在刺激24 h后達到最大，記錄數據并進行單因素ANOVA檢驗。在H37Rv標準株中，TBI-166刺激組ROS熒光值為23 072±2584，明顯高于空白對照組(8282±448)，差異有統計學意義(F=33.334，P<0.01)。不同濃度的RFP刺激均不能引起ROS的上升(圖7A～B)，與空白對照組相比差異無統計學意義(F=261.392，P>0.05)。在菌株號為12897菌株中，TBI-166刺激組ROS熒光值為18 369±3118，明顯高于空白對照組(12 268±2735)(圖7C)，差異有統計學意義(F=5.026，P<0.05)。在菌株號為15171菌株中，0.03、0.3 μg/ml TBI-166刺激菌體ROS含量與空白對照組比較差異無統計學意義 (F=122.601，P>0.05)，3 μg/ml TBI-166刺激組ROS熒光值為17 572±249，明顯高于空白對照組(11 109±343)(圖7D)，差異有統計學意義(F=122.601，P<0.01)。菌株號為11492及11195菌株，在這兩株菌中，TBI-166刺激組與空白對照組相比熒光值接近，差異無統計學意義(F=161.440，P>0.05；F=44.788，P>0.05)，而陽性對照TBHP組可以明顯刺激菌體產生ROS(圖7E～F)，差異有統計學意義(F=161.440，P<0.01；F=44.788，P<0.01)。

討 論

TBI-166是Cfz的結構改造物，在臨床前研究中，展現了與Cfz相當的抗結核活性，并且降低皮膚紅染不良反應[10]。在比格犬體內的藥代動力學研究表明其屬于低清除率藥物[11]。在BALB/c小鼠中，與對照方案INH+RFP+PZA相比，5種含TBI-166的方案在治療4周后顯示出更好的療效[12]。最新一項研究表明，每日一次給予TBI-166比間歇給藥方案更有效[13]，TBI-166擁有替代Cfz進入臨床治療的潛能。本研究對抗耐藥結核新藥TBI-166通過MtbQOR介導，累積ROS的機制進行探討，為TBI-166 Ⅱb期臨床試驗的組合方案提供合理充分的理論依據。

MtbQOR為醌氧化還原酶，以NADPH為H+供體，介導的氧化還原反應過程中會生成活性氧自由基，包括超氧陰離子、過氧化物和羥自由基[14]。本研究發現加入不同濃度的TBI-166均可以增強MtbQOR介導的還原反應，3 μg/ml TBI-166對MtbQOR介導的氧化還原中NADPH下降程度是空白對照組的2.5倍，0.03、0.3 μg/ml TBI-166對MtbQOR介導的氧化還原中NADPH下降程度是空白對照組的1.6、1.7倍。Cfz是具有氧化還原活性的分子，其可在NDH-2醌氧化還原酶的作用下被還原，生成活性還原型Cfz，接著還原型Cfz在O2的作用下生成活性氧物質，通過累積ROS發揮抗結核作用[15]。在本研究中，我們發現TBI-166可以增強MtbQOR介導的氧化還原反應，因此推測，TBI-166 與MtbQOR的底物醌競爭電子被還原，被還原后的TBI-166隨后氧化并產生超氧化物和過氧化氫之類的ROS發揮作用。

NADPH是細胞內抗氧化防御系統的重要組成成分，在細胞防御ROS損傷方面起著重要的作用，NADPH的氧化形式是NADP+，測定結核分枝桿菌菌體內的NADPH/NADP+比值一方面可以反映菌體內氧化應激狀態[16]，另一方面代表MtbQOR催化反應的發生方向。在本研究中，測定不同濃度TBI-166處理H37Rv標準株后顯示TBI-166可以降低結核分枝桿菌內NADPH/NADP+的比值，證實結核分枝桿菌內反應向著消耗NADPH，生成NADP+的方向進行，結核分枝桿菌受到TBI-166作用后，菌體內氧化還原水平活躍，提示MtbQOR的還原反應活躍，這與TBI-166增強MtbQOR介導的氧化還原反應研究結果一致。并且我們發現在96 h NADPH/NADP+比值在TBI-166處理組與空白對照組接近，這可能與TBI-166作用后結核分枝桿菌的代謝代償有關，經過藥物處理后的結核分枝桿菌為了抵抗TBI-166的作用，經過代償活動，產生更多的NADPH，在96 h使得NADPH/NADP+的比值恢復到正常水平。

結核分枝桿菌H37Rv菌體內ROS的含量在TBI-166作用24 h后有顯著的變化，與空白對照組相比有2倍左右的上升，這與文獻報道一致[6]。本研究發現不同濃度的RFP作用H37Rv菌株后并不能引起ROS含量的變化，這與RFP可能具有抗氧化應激能力有關[17]，提示結核分枝桿菌內ROS的累積可能是TBI-166特異性發揮作用的途徑。此結論在結核分枝桿菌臨床株中得到證實，對TBI-166 耐藥的菌株(11492、11195)中均不能觀察到ROS含量的上升，而TBI-166敏感的菌株中(12897)觀察到與H37Rv相似的結果。

值的注意的是，本研究發現3 μg/ml TBI-166增強MtbQOR介導的氧化還原反應明顯高于0.03、0.3 μg/ml TBI-166，而不同濃度TBI-166作用H37Rv后NADPH/NADP+的比值接近，提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166作用結核分枝桿菌后可能不僅通過MtbQOR途徑消耗NADPH，還存在其他消耗NADPH的方式。在ROS實驗中，筆者觀察到菌株15171中，0.03、0.3 μg/ml TBI-166對菌體ROS的刺激作用較3 μg/ml TBI-166弱，進一步分析菌株15171對Cfz耐藥，提示0.03、0.3 μg/ml TBI-166與Cfz的作用機制存在交叉部分。NDH-2貢獻電子是結核分枝桿菌呼吸鏈的起始，Cfz通過競爭NDH-2貢獻電子累積ROS而影響結核分枝桿菌呼吸鏈[15, 18]，NADPH可以提供H給NAD+生成NADH參與氧化呼吸鏈的H傳遞[9]。因此推測0.03、0.3 μg/ml TBI-166可能通過降低NADPH的相對含量，使得NADPH提供給NAD+的H變少，進而使進入氧化呼吸鏈的NADH含量變少，發揮抗結核作用。

根據本研究結果，發現TBI-166增強MtbQOR 介導的氧化還原反應，累積ROS發揮抗結核作用，并且可能通過降低NADPH/NADP+的比值，降低NADPH的相對含量影響結核分枝桿菌呼吸鏈(圖8)。TBI-166的抗結核作用機制研究，將進一步充實和豐富吩嗪類藥物抗結核作用機制的理論依據；為其后期的臨床合理組合用藥提供理論依據；對新型藥物靶標的發現及新型抗生素的研發具有一定的潛在借鑒和應用價值，對將來臨床分子診斷等具有重要的潛在應用價值。

注 O2：氧；ROS：活性氧；QOR：醌氧化還原酶；TBI-166red：還原型TBI-166；TBI-166ox：氧化型TBI-166；NADPH：還原型輔酶Ⅱ；NADP+：氧化型輔酶Ⅱ；Electron Transport Chain：電子呼吸鏈；NADH：還原型輔酶Ⅰ；NAD+：氧化型輔酶Ⅰ；ADP：二磷酸腺苷；ATP：三磷酸腺苷；Pi：磷酸基團圖8 TBI-166發揮抗結核作用的可能機制

本研究局限性在于：(1)TBI-166增強MtbQOR 介導的氧化還原反應，可能包含兩個作用途徑，TBI-166可能被MtbQOR還原，消耗更多的NADPH；也有可能是通過TBI-166與MtbQOR蛋白的活性位點結合，增強QOR蛋白的活性從而增強MtbQOR介導氧化還原反應，但具體的機制尚需進一步的探討。(2)結核分枝桿菌菌體內累積一定含量的ROS，可能導致結核分枝桿菌DNA損傷，氧化應激異常，代謝紊亂，從而導致結核分枝桿菌死亡[19]，需要進一步研究ROS的累積是如何造成結核分枝桿菌死亡的。