GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測胃液標本對兒童肺結核的診斷價值

方敏 石艷 段莉 石小梅 全舒婷 王亞翠 彭小姍 郟繼航 綦輝 焦偉偉 朱渝 孫琳

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2020年全球結核病報告顯示，2019年全球兒童結核病患者約120萬例[1]。由于結核病患兒檢測標本采集困難、細菌載量低，難以獲得有效的實驗室證據(jù)，致早期快速診斷成為目前兒童結核病防控面臨的主要問題。因此，亟需建立更為敏感的檢測方法和技術，以提升兒童結核病的檢出率，及早有效管理。

分子生物學方法可以直接檢測標本中病原體核酸，具有較高的敏感度，可明顯提高結核病的診斷效率，已被《WS 288—2017肺結核診斷》[2]作為結核病確診的方法之一。超敏結核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測(GeneXpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)方法在成年人結核病診斷中表現(xiàn)出了較高的敏感度，能夠更快地為臨床提供早期診斷依據(jù)[3-6]，具有非常好的臨床應用前景。但其目前在兒童結核病診斷中的應用數(shù)據(jù)較少，這在一定程度上阻礙了其在臨床上的推廣。目前，用于結核病分子生物學診斷的標本類型多以呼吸道標本為主，包括咳出痰、誘導痰、鼻咽拭子和支氣管灌洗液等[7-10]，而對其他類型標本的研究數(shù)據(jù)尚少。胃液是檢測兒童患者病原學的重要標本類型，而應用Xpert Ultra檢測兒童結核病患者胃液的效能評價仍然較少。因此，筆者選取兒童肺結核患者和其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病患者的胃液標本，應用Xpert Ultra進行檢測，以評價該技術對兒童肺結核的診斷效能。

對象和方法

1.研究對象：采用回顧性研究方法選取2019年7月至2020年7月就診于四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院兒科且符合入組標準的173例患兒作為研究對象，年齡范圍為0.3～14歲，中位數(shù)(四分位數(shù))為8.0(4.0，11.0)歲；男84例(48.6%)，女89例(51.4%)。僅16例(9.3%)能夠提供明確的卡介苗接種史證據(jù)，86例(49.7%)接種史不明，71例(41.0%)無接種史。研究對象中，經(jīng)臨床綜合診斷為活動性肺結核患兒114例(觀察組)，其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病患兒59例(對照組)。觀察組中，胃液結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)培養(yǎng)(BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，簡稱“MGIT 960液體培養(yǎng)”)陽性23例(20.2%)，陰性91例(79.8%)。91例培養(yǎng)陰性患兒中，有活動性結核病臨床癥狀和體征，同時伴胸部影像學改變、結核菌素皮膚試驗和γ-干擾素釋放試驗陽性者65例(57.0%)；有活動性結核病臨床癥狀和體征，同時伴胸部影像學改變、結核菌素皮膚試驗陽性者9例(7.9%)；有活動性結核病的臨床癥狀和體征，同時伴胸部影像學改變、γ-干擾素釋放試驗陽性者17例(14.9%)。對照組中，支原體感染者32例(54.3%)，細菌性感染者15例(25.4%)，未查到明確病原體但常規(guī)抗感染治療后病情好轉或治愈者12例(20.3%)。

2.納入標準：(1)觀察組：所有患兒均評估活動性結核病相關臨床癥狀和體征，并進行胃液抗酸染色、胃液MTB培養(yǎng)、胸部影像學檢查、免疫學檢查[結核菌素皮膚試驗和(或)γ-干擾素釋放試驗]，如符合以下標準則診斷為活動性肺結核[11]：①涂片抗酸桿菌檢測陽性或MTB培養(yǎng)陽性；②有活動性結核病的臨床癥狀和體征，同時伴胸部影像學改變及免疫學檢查(結核菌素皮膚試驗或γ-干擾素釋放試驗)陽性；③經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病。(2)對照組：經(jīng)評估活動性結核病臨床癥狀和體征，并進行胃液抗酸染色、胃液MTB培養(yǎng)、胸部影像學檢查，均不提示活動性結核病；結合患兒存在的其他病原感染證據(jù)，以及常規(guī)抗感染治療后病情好轉或治愈的患兒。

3.排除標準：未行結核病相關檢查；未行Xpert Ultra檢測胃液；臨床資料不完全。

4.樣本采集：(1)胃液標本：患兒入院第2日晨起空腹采集。胃管經(jīng)鼻進入胃中，采用注射器抽取2～8 ml胃液，分裝后于-80 ℃保存。(2)痰液標本：患兒深吸氣2～3次，每次用力呼出，咳出痰液標本于痰盒中，于-80 ℃保存。后續(xù)分別對兩種標本進行MTB培養(yǎng)和Xpert Ultra檢測。

5.Xpert Ultra檢測：根據(jù)產(chǎn)品說明書進行操作。取胃液2 ml于無菌離心管中，加入NaOH溶液進行中和，直至NaOH終濃度為1.5%。充分振蕩10～15 s后室溫放置15 min，期間每5 min再充分振蕩混勻1次。置于離心機中4000×g離心15 min。棄上清，離心管中加入2 ml處理液，將剩余的沉淀吹打混勻后加入檢測盒中上機檢測。取痰液1 ml加入2 ml處理液，充分振蕩后室溫放置15 min，取2 ml處理后的樣本上機檢測。當MTB DNA檢測陽性時，依據(jù)MTB的Ct值間接反映所檢測樣本中MTB的菌載量，分為高、中、低、非常低、微量；同時對MTB菌株利福平耐藥位點進行藥物敏感性試驗，結果分別為利福平耐藥、敏感和不確定。

6.MGIT 960液體培養(yǎng)：取1～2 ml胃液或痰液置50 ml離心管，加入等量N-乙酰-L半胱氨酸碳酸氫鈉(NaOH-NALC)前處理液振蕩1 min后靜置15～20 min。加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)至45 ml，置于離心機中3000×g4 ℃離心15 min。棄上清，加1 ml PBS混勻后進行MTB培養(yǎng)。

7.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用“百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以臨床綜合診斷為參照標準，評價Xpert Ultra 檢測胃液標本對兒童肺結核的診斷效能，各指標計算公式如下：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%。各方法間的一致性檢測采用Kappa檢驗，其中，Kappa≥0.75，說明兩種方法診斷一致性較好；0.4≤Kappa<0.75，說明兩種方法診斷一致性一般；Kappa<0.4，說明兩種方法診斷一致性較差。

結 果

1.Xpert Ultra檢測胃液標本的診斷價值：以臨床綜合診斷為參照標準，Xpert Ultra診斷兒童肺結核的敏感度為53.5%(61/114)。根據(jù)患兒的年齡分為學齡前患兒(0～6歲組)和學齡期患兒(6～14歲組)，分別為57例和116例。Xpert Ultra檢測兩組患兒胃液標本診斷肺結核的敏感度分別為66.7%(26/39)和46.7%(35/75)，前者敏感度明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.126，P=0.042)。而MTB培養(yǎng)診斷兒童肺結核的敏感度為20.2%(23/114)。具體見表1。

2.Xpert Ultra檢測胃液和痰液標本診斷價值的比較：研究對象中，僅65例采集到痰液標本，其中，觀察組采集46例，對照組采集19例。以臨床綜合診斷為參照標準，Xpert Ultra檢測胃液和痰液標本診斷兒童肺結核的敏感度分別為52.2%(24/46)和43.5%(20/46)，二者間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.697，P=0.404)。具體見表2。

3.Xpert Ultra對胃液培養(yǎng)陽性標本菌載量的檢測：在胃液標本MTB培養(yǎng)陽性的23例患兒中，21例(91.3%)經(jīng)Xpert Ultra檢測陽性，其菌載量分別為微量3例(14.3%)、極低載量4例(19.1%)、低載量10例(47.6%)、中等載量2例(9.5%)、高載量2例(9.5%)。在胃液MTB培養(yǎng)陰性的150例患兒中，40例經(jīng)Xpert Ultra檢測陽性，其菌載量結果分別為微量15例(37.5%)、極低載量7例(17.5%)、低載量14例(35.0%)、中等載量1例(2.5%)、高載量3例(7.5%)。

表2 Xpert Ultra以臨床綜合診斷為參照標準檢測胃液和痰液標本對兒童肺結核的診斷效能

4.Xpert Ultra對兒童肺結核的耐藥檢測：Xpert Ultra檢測胃液陽性的61例患兒中，18例(29.5%)為微量菌載量，無法判斷其耐藥結果；5例為利福平耐藥，其中3例為MTB培養(yǎng)陽性，但僅1例獲得 MGIT 960藥物敏感性試驗結果，且為異煙肼和利福平均耐藥。

討 論

2014年WHO頒布的《國家結核病規(guī)劃關于兒童結核病處理指南(第2版)》強烈推薦GeneXpert MTB/RIF方法可用于兒童結核病的診斷[11]。然而，該方法對MTB低菌載量標本的檢出率仍有待提高。隨著敏感度明顯提高的新一代Xpert Ultra方法的研發(fā)，其可將檢出下限由原來的112.6 CFU/ml降為15.6 CFU/ml[12-13]，檢出時間由GeneXpert MTB/RIF所需的112 min縮短至84 min。因此，Xpert Ultra在診斷兒童等少菌結核病患者中的應用價值更大。本研究結果顯示，Xpert Ultra檢測胃液對MTB培養(yǎng)陽性的結核病患兒的敏感度達到了91.3%。以臨床綜合診斷為參考標準，Xpert Ultra檢測胃液對所有結核病患兒的敏感度也達到了53.5%，說明當傳統(tǒng)細菌學方法難以獲得MTB感染證據(jù)時，仍有相當比例的患兒可以通過Xpert Ultra 方法得以確診。因此，采用高敏感度的分子生物學方法可以有效提高兒童結核病的確診率。同時，該方法操作簡單，采樣1～2 h即可得到檢測結果，這對于兒童結核病的早期診斷、早期治療也具有重要作用。

由于兒童本身的特點，尤其是嬰幼兒，往往難以取得合格的痰液標本。本研究納入的173例患兒中，僅65例患兒可以采集到痰液標本。同時，嬰幼兒也是結核病發(fā)病的高危人群，在其感染MTB后，很容易發(fā)展為重癥結核病。因此，尋找更適合嬰幼兒診斷的標本類型具有實際的臨床應用價值。

胃液是兒童感染性疾病患者病原學檢測的重要標本類型，特別是5歲以下兒童的呼吸道分泌物更多的被吞咽到胃里，尤其是經(jīng)過一夜的睡眠，含MTB的分泌物在胃內(nèi)富集，更容易檢出MTB。另外，在一些咳痰困難的成年人患者中，胃液也被用于病原學的檢測[14-15]。本研究結果顯示，Xpert Ultra檢測胃液中MTB的敏感度略高于痰液，說明Xpert Ultra對兒童肺結核具有較好的診斷價值。同時，Xpert Ultra檢測學齡前患兒胃液標本診斷肺結核的敏感度明顯高于學齡期患兒，提示Xpert Ultra對于學齡前患兒肺結核診斷的臨床應用價值更高。一項德國的研究分析了2002—2010年間采用胃液標本確診兒童肺結核的情況，結果顯示59%的肺結核患兒可通過胃液標本檢測得以確診，且有34.7%的患兒只檢測了胃液標本；同時，結果還顯示小于1歲患兒的檢出率最高，4歲以內(nèi)患兒的檢出率在68%左右，而10歲以上患兒的檢出率只有37%，提示檢測胃液的陽性率隨年齡的增長而逐漸下降[16]，與本研究結果一致。

胃液的采集和保存方式也對檢出率有一定影響。有研究對比分析了標準化胃液采集流程建立前后，結核病患兒胃液標本MTB培養(yǎng)的陽性率，盡管患者例數(shù)較少，但仍可認為嚴格的操作者培訓、采集時間短、吸出物標本盡快中和并處理可有效提高病原學檢出率[17]。標本的儲存時間是否會影響胃液標本的MTB檢出率也存在不一致的結論。例如，Singh等[18]檢測冷凍儲存650～849 d內(nèi)胃液標本的MTB陽性率為77.1%，而超過1050 d后的檢測陽性率則降至50%，說明隨著胃液標本儲存時間的延長，Xpert檢測的陽性率也下降；但該研究也發(fā)現(xiàn)，即使檢測冷凍存放4年以上的胃液標本，其檢出率也可以達到50%。此外，胃液采集需患兒嚴格禁食至少4 h，故最好晨起空腹取胃液，以避免食物殘渣對檢測結果的影響。

隨著近年來耐藥細菌的流行，耐多藥結核病和利福平耐藥結核病的患者數(shù)居高不下。由于Xpert Ultra方法可以同時檢出利福平耐藥，因此，其在兒童耐藥結核病的早期快速診斷也具有很好的應用價值。而傳統(tǒng)藥物敏感性試驗需要在獲得細菌菌株后才能進行，往往需要1個月以上的時間，遠滯后于臨床需求。本研究中，61例Xpert Ultra檢測陽性患兒中，5例檢測出利福平耐藥，但僅1例獲得了MGIT 960藥物敏感性試驗結果，且與Xpert Ultra檢測耐藥結果一致。這提示Xpert Ultra 檢測有助于臨床醫(yī)師快速獲得患兒利福平耐藥結果，為及時選擇合適的抗結核藥品提供了依據(jù)。

綜上，Xpert Ultra檢測胃液標本對兒童肺結核診斷具有較好的敏感度和特異度，有助于兒童結核病的早期診斷。對于無法咳痰或者難以取得痰液標本的學齡前患兒來說，胃液標本是很有價值的替代標本類型。