福建省261株非結核分枝桿菌的菌種鑒定分析

林建 趙永 戴志松 魏淑貞 林淑芳

分枝桿菌屬在許多環境相關的研究中均有報道，目前已經有將近200個已確認的種或亞種，從流行病學和疾病相關性的角度可以將分枝桿菌分為3大類：結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)、非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria, NTM)和麻風分枝桿菌[1]。NTM廣泛分布于環境當中，大多數NTM是條件性致病菌[2-4]。近年來，全球報告的NTM感染率在不斷提高[5]，在一些發達國家，比如美國和加拿大，從疑似結核病患者中分離出NTM的比例甚至可超過MTBC[3]，而中國的NTM分離率也已高達22.9%[6]。不同的NTM菌種對抗生素的反應各不相同[7-8]，此外，近期研究發現，NTM可能存在人與人之間的傳播[9]，因此，對NTM進行菌種鑒定有重要的意義。筆者通過對從福建省多個結核病耐藥監測點和地市級疾病預防控制中心(簡稱“疾控中心”)結核病實驗室收集的NTM菌株進行菌種鑒定和分析，從而為福建省的NTM菌種分布提供參考數據。

資料和方法

一、標本來源

菌株來源于2016年6月至2019年12月，從福建省9個省級結核病耐藥監測點(每個地市有1個縣作為監測點)和9個地市級疾控中心結核病實驗室常規培養的菌株中收集到分枝桿菌菌株3355株，經對硝基苯甲酸(P-Nitrobenzoic acid, PNB)生長試驗鑒定后，261株被初步鑒定為NTM菌株，占所有菌株的比例為7.78%(261/3355)。

二、試劑與儀器

含PNB(0.5 mg/ml)的改良羅氏培養基(珠海貝索生物技術有限公司)；Lab-Aid 824S 核酸自動提取儀和提取試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；GenoType Mycobacterium CM試劑盒(HAIN Lifescience公司，德國)；MeltPro Myco 試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；SLAN-96S型實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司)。

三、實驗方法

1. PNB鑒定方法：地市級疾控中心結核病防治科通過國家熟練度測試的專業操作人員對收集的菌株進行NTM初步鑒定。PNB鑒定方法的操作過程以及所使用溶液試劑的配制均按照《結核病實驗室診斷技術培訓教程》[10]：吸取2～3滴無菌生理鹽水于磨菌瓶中，使用接種環刮取2～3周的新鮮菌落于磨菌瓶底部，捻動并用無菌生理鹽水將其濁度調至與標準麥氏比濁管一致，使其菌液濃度為1 mg/ml，取0.5 ml菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至10-1mg/ml，用22 SWG接種環蘸取1環并均勻接種至含PNB的改良羅氏培養基表面，置于37 ℃恒溫培養，以堪薩斯分枝桿菌為陽性對照菌株和H37Rv為陰性對照菌株。接種后，每周記錄菌落的生長狀況，緩慢生長分枝桿菌一般需要4周可出現肉眼可見菌落，快速生長分枝桿菌僅需1周左右便可出現肉眼可見菌落。

2. 核酸提取：261株菌株的基因組DNA均采用Lab-Aid 824S核酸自動提取儀自動化提取，提取試劑盒的使用步驟按照說明書進行。

3. GenoType Mycobacterium CM試劑盒菌種鑒定：GenoType Mycobacterium CM試劑盒是目前國內外較常用的商業化分枝桿菌鑒定試劑盒。本試劑盒通過PCR擴增分枝桿菌23S rRNA 上的目的片段，在膜條上進行寡核苷酸探針雜交，通過線性條帶顯色來判斷結果，檢測可在5 h內完成。本試劑盒可區分14種臨床上常見的分枝桿菌，包括鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、居間分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌、外來分枝桿菌、MTBC、蟾蜍分枝桿菌[11]。

GenoType Mycobacterium CM試劑盒的反應總體系為50 μl，其中包含PNM(引物/核苷酸混合物)35 μl，10×聚合酶緩沖液5 μl，25 mmol MgCl2溶液2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，滅菌水3 μl，DNA模板5 μl。使用GT-Blot 48儀進行自動化雜交顯色，結果判讀按照說明書進行。

4. DNA測序:對GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為分枝桿菌屬的6株菌株進行測序，以分枝桿菌的ITS序列作為測序的靶標，將每株菌株測序所得到的核酸序列進行NCBI BLASTn比對，在NCBI數據庫中找到最匹配的菌種，作為該菌株的菌種鑒定結果。

5. MeltPro Myco試劑盒鑒定混合感染：對GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為混合感染的9株菌株，用MeltPro Myco試劑盒進一步鑒定具體菌種。

結 果

一、GenoType Mycobacterium CM 試劑盒菌種鑒定結果

GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定261株菌株的結果見表1。鑒定出219株試劑盒覆蓋范圍內的9種分枝桿菌，分別為MTBC 21株、胞內分枝桿菌132株、膿腫分枝桿菌37株、堪薩斯分枝桿菌9株、偶然分枝桿菌8株、鳥分枝桿菌4株、戈登分枝桿菌3株、龜分枝桿菌3株、瘰疬分枝桿菌2株。此外，還鑒定出9株混合感染菌株，即1株菌株同時感染2種或2種以上的分枝桿菌，但是無法鑒定出含有的具體菌種；6株菌株只能鑒定至分枝桿菌屬的水平，無法鑒定出具體菌種；18株菌株檢測出革蘭陽性菌，且不含分枝桿菌；其余9株檢測為陰性。

表1 GenoType Mycobacterium CM試劑盒

二、DNA測序結果

經過ITS序列測序，進一步將GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定至分枝桿菌屬的6株菌株進行了驗證，這6株菌株分別為1株M.arupense、1株M.peregrinum、1株M.phocaicum、1株M.sinense、1株M.vanbaalenii、1株M.dioxanotrophicus。

三、MeltPro Myco試劑盒檢測9株混合感染菌株的結果

9株經GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為混合感染的菌株，通過MeltPro Myco試劑盒鑒定后，證實了這9株菌株均為混合感染兩種分枝桿菌，其中，8株混合感染MTBC和胞內分枝桿菌，1株混合感染MTBC和鳥分枝桿菌。

四、NTM菌株的菌種分布

經過3種鑒定方法的聯合檢測，從261株分析菌株中檢測出213株NTM，占81.61%(213/261)，NTM的分離率為6.35%(213/3355)。在213株NTM菌株中，204株為單一NTM感染菌株，9株NTM與MTBC混合感染菌株，菌種分布情況見表2，140株(65.73%，140/213)胞內分枝桿菌(包括132株單一胞內分枝桿菌感染，以及8株MTBC和胞內分枝桿菌混合感染)，37株(17.37%，37/213)膿腫分枝桿菌，9株(4.22%，9/213)堪薩斯分枝桿菌，8株(3.75%，8/213)偶然分枝桿菌，5株(2.35%，5/213)鳥分枝桿菌(包括4株單獨胞內分枝桿菌感染，以及1株MTBC和胞內分枝桿菌混合感染)，3株(1.41%，3/213)戈登分枝桿菌，3株(1.41%，3/213)龜分枝桿菌，2株(0.94%，2/213)瘰疬分枝桿菌，M.arupense、M.peregrinum、M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus各1株(0.47%，1/213)。在48株不含NTM的菌株中，有21株單一MTBC感染，27株分枝桿菌陰性。

討 論

NTM是一種環境中普遍存在的微生物，大多數為條件致病菌，在免疫力功能正常和免疫功能低下的人群中均有可能發生感染，可引起局部(如皮膚和軟組織、淋巴結、骨骼和肺等)或全身播散性感染[12-13]。根據NTM病相關治療研究的報道，不同菌種的NTM對同一藥品的抗性也有所差別[13-14]。不同地理位置NTM菌種的多樣性有所差別，福建省位于中國東南沿海地區，當地的亞熱帶氣候可能會影響NTM菌種分布的多樣性[15-16]。

表2 213株NTM的菌種分布

一、NTM的菌種多樣性分布

在PNB鑒定方法初步鑒定為NTM的261株菌株中，有81.61%的菌株被鑒定為NTM，共包含14個菌種。在所有NTM菌株當中，胞內分枝桿菌(65.73%)、膿腫分枝桿菌(17.37%)和堪薩斯分枝桿菌(4.22%)分離率排在前3位，為福建省的優勢菌種。與中國其他地區相比，例如，在中國西南地區重慶市，膿腫分枝桿菌復合群(36.3%，53/146)、胞內分枝桿菌(26.0%，38/146)和偶然分枝桿菌(11.7%，17/146)是主要優勢菌種[17]；在中國南部地區廣東省，膿腫分枝桿菌(48.8%，458/938)、戈登分枝桿菌(22.5%，211/938)和胞內分枝桿菌(9.7%，91/938)是主要優勢菌種[18]；在中國中部地區長沙市，胞內分枝桿菌(43.9%，381/867)、鳥分枝桿菌(24.1%，209/867)和龜-膿腫分枝桿菌復合群(21.7%，188/867)是主要優勢菌種[19]；在中國北部地區北京市，胞內分枝桿菌(39.2%，51/130)、堪薩斯分枝桿菌(37.7%，49/130)和鳥分枝桿菌(6.9%，9/130)是主要優勢菌種[20]，以上這些地區的NTM分布，無論是在優勢菌種方面，還是在所有NTM當中的占比方面，均與福建省有很大的差別。此外，中國東部地區上海市的優勢菌種為胞內分枝桿菌(31.3%，160/512)、膿腫分枝桿菌(28.3%，145/512)和堪薩斯分枝桿菌(18.6%，95/512)[21]，雖然優勢菌種與福建地區一樣，但是在所有NTM當中的占比差別顯著。不同NTM菌種的分布可能具有明顯的區域特征，即使在同一國家，在不同地理位置上NTM的菌種多樣性分布會有所不同。

黃明翔等[22]分析了福州肺科醫院2009年到2012年NTM的分離情況，在其研究數據中，NTM的臨床分離率為10.20%(649/6362)，NTM中分離率排前3位的分別是胞內分枝桿菌(46.53%，302/649)，鳥分枝桿菌(21.26%，138/649)和膿腫分枝桿菌(12.48%，81/649)。本研究與其數據存在一定的差異：第一，本研究的NTM分離率為6.35%(213/3355)，明顯低于上述研究的10.20%；第二，本研究的胞內分枝桿菌占比為65.73%(140/213)，明顯高于上述研究的46.53%；第三，本研究NTM分離率排位前三的分別是胞內分枝桿菌(65.73%，140/213)、膿腫分枝桿菌(17.37%，37/213)和堪薩斯分枝桿菌(4.23%，9/213)，與上述研究中排位前三的NTM菌種存在明顯差異。對于以上兩者之間的差異，筆者認為可能的主要原因是菌株來源存在差異：本研究的菌株來源于福建省9個省級結核病耐藥監測點和9個地市級疾控中心結核病實驗室，而上述研究的菌株來源于福州肺科醫院，福州肺科醫院作為福建省最大的結核病診治醫院，所收治的患者情況比較復雜，復治或難治患者相對較多，因此，所分離的菌株分布可能會與本次研究有所差異。當然，以上猜測需要后續更多的研究進一步分析。

二、PNB鑒定方法與GenoType Mycobacterium CM試劑盒在NTM鑒定方面存在差異

本研究中，GenoType Mycobacterium CM 試劑盒總共檢測到204株單一NTM感染菌株，9株混合感染菌株，以及48株菌株不含NTM(包含21株MTBC和27株分枝桿菌陰性)，而PNB鑒定方法將本研究的261株菌株全部鑒別為NTM，48株菌株試劑盒鑒定結果與PNB鑒定方法不一致，一方面的原因可能是PNB鑒定方法鑒定NTM存在假陽性，若與GenoType Mycobacterium CM 試劑盒作對比，PNB鑒定方法的假陽性率為18.39%(48/261)，與王建等[23]研究中的假陽性率15.05%(14/93)相近；另一方面的原因可能是GenoType Mycobacterium CM 試劑盒靶基因選擇的問題，導致有些菌種的靶基因不易被擴增，造成假陰性的結果[11]。

三、罕見NTM菌種

本研究中，GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為分枝桿菌屬的6株菌株經過測序驗證，鑒定它們分別為M.arupense、M.peregrinum、M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus各1株，這6個菌種均為罕見NTM。其中，M.arupense和M.peregrinum這2個菌種被相關研究人員從國內的水源環境中分離出來[24]，M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus在國內還未見報道。國外有關報道認為M.arupense、M.peregrinum和M.phocaicum這3個菌種可能會造成肺部感染疾病[25-27]，而M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus在國外也還未見與人類疾病相關的報道。

四、混合感染菌株

除了上述情況外， 9株菌株GenoType Mycobacterium CM 試劑盒檢測為混合感染，但無法鑒定至具體菌種，而DNA測序也無法鑒定混合感染菌株中的菌種。近期有研究報道，MeltPro Myco試劑盒能夠鑒定MTBC和17種臨床常見的NTM菌種，并且可以準確鑒定出混合感染菌株中含有的菌種[15]。上述9株菌株經過MeltPro Myco試劑盒檢測， 8株為同時感染MTBC和胞內分枝桿菌，1株為同時感染MTBC和鳥分枝桿菌。該結果說明了在同一菌株中可能會存在兩種或者兩種以上菌的感染，這種菌株在本研究中的比例為3.45%(9/261)。因此，混合感染菌株的正確鑒定不容忽視，否則將導致患者的治療出現延誤。

綜上所述，本研究結合了多種分子鑒定手段來進行分枝桿菌菌種的鑒定，以保證菌種鑒定的準確性，結果表明，胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌的分離率排在福建省NTM的前3位，為福建省的優勢菌種，與中國其他地區有明顯差別。本研究還鑒定出了6種罕見的NTM，這為國內罕見分枝桿菌的流行情況及其致病性研究提供了線索。此外，本研究也進一步揭示了分枝桿菌混合感染的現象時有發生，基于治療的角度來看，混合感染菌株的準確鑒定不容忽視。然而，本研究納入的菌株數量相對有限，菌株信息統計還不夠完善，后續將開展更為廣泛的研究，為我國NTM流行病學研究提供更多基礎數據。

志謝福州市疾病預防控制中心(潘潔茹、劉杰)、福州市連江縣醫院(王志衛)、廈門市疾病預防控制中心(洪超)、廈門大學附屬第一醫院(馬曉波)、福建省寧德市疾病預防控制中心(董其英)、福建省寧德市福鼎市醫院(李步任)、福建省莆田市疾病預防控制中心(黃麗凡)、福建省莆田市仙游縣醫院(林晶)、福建省泉州市疾病預防控制中心(黃曉偉)、福建省泉州市晉江市醫院(董芬芳)、福建省漳州市疾病預防控制中心(張添林)、福建省漳州市南靖縣疾病預防控制中心(戴清全)、福建省龍巖市疾病預防控制中心(鄭建莉)、福建省龍巖市武平縣醫院(鄭才祥)、福建省三明市疾病預防控制中心(羅宏活)、福建省三明市尤溪縣總醫院(鄭艷艷)、福建省南平市疾病預防控制中心(黃火壽)、福建省南平市邵武縣疾病預防控制中心(魏文)在本研究菌株收集方面提供了幫助與指導。