福建省261株非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定分析

林建 趙永 戴志松 魏淑貞 林淑芳

分枝桿菌屬在許多環(huán)境相關(guān)的研究中均有報(bào)道，目前已經(jīng)有將近200個已確認(rèn)的種或亞種，從流行病學(xué)和疾病相關(guān)性的角度可以將分枝桿菌分為3大類：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)、非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria, NTM)和麻風(fēng)分枝桿菌[1]。NTM廣泛分布于環(huán)境當(dāng)中，大多數(shù)NTM是條件性致病菌[2-4]。近年來，全球報(bào)告的NTM感染率在不斷提高[5]，在一些發(fā)達(dá)國家，比如美國和加拿大，從疑似結(jié)核病患者中分離出NTM的比例甚至可超過MTBC[3]，而中國的NTM分離率也已高達(dá)22.9%[6]。不同的NTM菌種對抗生素的反應(yīng)各不相同[7-8]，此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，NTM可能存在人與人之間的傳播[9]，因此，對NTM進(jìn)行菌種鑒定有重要的意義。筆者通過對從福建省多個結(jié)核病耐藥監(jiān)測點(diǎn)和地市級疾病預(yù)防控制中心(簡稱“疾控中心”)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室收集的NTM菌株進(jìn)行菌種鑒定和分析，從而為福建省的NTM菌種分布提供參考數(shù)據(jù)。

資料和方法

一、標(biāo)本來源

菌株來源于2016年6月至2019年12月，從福建省9個省級結(jié)核病耐藥監(jiān)測點(diǎn)(每個地市有1個縣作為監(jiān)測點(diǎn))和9個地市級疾控中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)的菌株中收集到分枝桿菌菌株3355株，經(jīng)對硝基苯甲酸(P-Nitrobenzoic acid, PNB)生長試驗(yàn)鑒定后，261株被初步鑒定為NTM菌株，占所有菌株的比例為7.78%(261/3355)。

二、試劑與儀器

含PNB(0.5 mg/ml)的改良羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；Lab-Aid 824S 核酸自動提取儀和提取試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；GenoType Mycobacterium CM試劑盒(HAIN Lifescience公司，德國)；MeltPro Myco 試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；SLAN-96S型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. PNB鑒定方法：地市級疾控中心結(jié)核病防治科通過國家熟練度測試的專業(yè)操作人員對收集的菌株進(jìn)行NTM初步鑒定。PNB鑒定方法的操作過程以及所使用溶液試劑的配制均按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[10]：吸取2～3滴無菌生理鹽水于磨菌瓶中，使用接種環(huán)刮取2～3周的新鮮菌落于磨菌瓶底部，捻動并用無菌生理鹽水將其濁度調(diào)至與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢拢蛊渚簼舛葹? mg/ml，取0.5 ml菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至10-1mg/ml，用22 SWG接種環(huán)蘸取1環(huán)并均勻接種至含PNB的改良羅氏培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，以堪薩斯分枝桿菌為陽性對照菌株和H37Rv為陰性對照菌株。接種后，每周記錄菌落的生長狀況，緩慢生長分枝桿菌一般需要4周可出現(xiàn)肉眼可見菌落，快速生長分枝桿菌僅需1周左右便可出現(xiàn)肉眼可見菌落。

2. 核酸提取：261株菌株的基因組DNA均采用Lab-Aid 824S核酸自動提取儀自動化提取，提取試劑盒的使用步驟按照說明書進(jìn)行。

3. GenoType Mycobacterium CM試劑盒菌種鑒定：GenoType Mycobacterium CM試劑盒是目前國內(nèi)外較常用的商業(yè)化分枝桿菌鑒定試劑盒。本試劑盒通過PCR擴(kuò)增分枝桿菌23S rRNA 上的目的片段，在膜條上進(jìn)行寡核苷酸探針雜交，通過線性條帶顯色來判斷結(jié)果，檢測可在5 h內(nèi)完成。本試劑盒可區(qū)分14種臨床上常見的分枝桿菌，包括鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、居間分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌、外來分枝桿菌、MTBC、蟾蜍分枝桿菌[11]。

GenoType Mycobacterium CM試劑盒的反應(yīng)總體系為50 μl，其中包含PNM(引物/核苷酸混合物)35 μl，10×聚合酶緩沖液5 μl，25 mmol MgCl2溶液2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，滅菌水3 μl，DNA模板5 μl。使用GT-Blot 48儀進(jìn)行自動化雜交顯色，結(jié)果判讀按照說明書進(jìn)行。

4. DNA測序:對GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為分枝桿菌屬的6株菌株進(jìn)行測序，以分枝桿菌的ITS序列作為測序的靶標(biāo)，將每株菌株測序所得到的核酸序列進(jìn)行NCBI BLASTn比對，在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到最匹配的菌種，作為該菌株的菌種鑒定結(jié)果。

5. MeltPro Myco試劑盒鑒定混合感染：對GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為混合感染的9株菌株，用MeltPro Myco試劑盒進(jìn)一步鑒定具體菌種。

結(jié) 果

一、GenoType Mycobacterium CM 試劑盒菌種鑒定結(jié)果

GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定261株菌株的結(jié)果見表1。鑒定出219株試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的9種分枝桿菌，分別為MTBC 21株、胞內(nèi)分枝桿菌132株、膿腫分枝桿菌37株、堪薩斯分枝桿菌9株、偶然分枝桿菌8株、鳥分枝桿菌4株、戈登分枝桿菌3株、龜分枝桿菌3株、瘰疬分枝桿菌2株。此外，還鑒定出9株混合感染菌株，即1株菌株同時(shí)感染2種或2種以上的分枝桿菌，但是無法鑒定出含有的具體菌種；6株菌株只能鑒定至分枝桿菌屬的水平，無法鑒定出具體菌種；18株菌株檢測出革蘭陽性菌，且不含分枝桿菌；其余9株檢測為陰性。

表1 GenoType Mycobacterium CM試劑盒

二、DNA測序結(jié)果

經(jīng)過ITS序列測序，進(jìn)一步將GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定至分枝桿菌屬的6株菌株進(jìn)行了驗(yàn)證，這6株菌株分別為1株M.arupense、1株M.peregrinum、1株M.phocaicum、1株M.sinense、1株M.vanbaalenii、1株M.dioxanotrophicus。

三、MeltPro Myco試劑盒檢測9株混合感染菌株的結(jié)果

9株經(jīng)GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為混合感染的菌株，通過MeltPro Myco試劑盒鑒定后，證實(shí)了這9株菌株均為混合感染兩種分枝桿菌，其中，8株混合感染MTBC和胞內(nèi)分枝桿菌，1株混合感染MTBC和鳥分枝桿菌。

四、NTM菌株的菌種分布

經(jīng)過3種鑒定方法的聯(lián)合檢測，從261株分析菌株中檢測出213株NTM，占81.61%(213/261)，NTM的分離率為6.35%(213/3355)。在213株NTM菌株中，204株為單一NTM感染菌株，9株NTM與MTBC混合感染菌株，菌種分布情況見表2，140株(65.73%，140/213)胞內(nèi)分枝桿菌(包括132株單一胞內(nèi)分枝桿菌感染，以及8株MTBC和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染)，37株(17.37%，37/213)膿腫分枝桿菌，9株(4.22%，9/213)堪薩斯分枝桿菌，8株(3.75%，8/213)偶然分枝桿菌，5株(2.35%，5/213)鳥分枝桿菌(包括4株單獨(dú)胞內(nèi)分枝桿菌感染，以及1株MTBC和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染)，3株(1.41%，3/213)戈登分枝桿菌，3株(1.41%，3/213)龜分枝桿菌，2株(0.94%，2/213)瘰疬分枝桿菌，M.arupense、M.peregrinum、M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus各1株(0.47%，1/213)。在48株不含NTM的菌株中，有21株單一MTBC感染，27株分枝桿菌陰性。

討 論

NTM是一種環(huán)境中普遍存在的微生物，大多數(shù)為條件致病菌，在免疫力功能正常和免疫功能低下的人群中均有可能發(fā)生感染，可引起局部(如皮膚和軟組織、淋巴結(jié)、骨骼和肺等)或全身播散性感染[12-13]。根據(jù)NTM病相關(guān)治療研究的報(bào)道，不同菌種的NTM對同一藥品的抗性也有所差別[13-14]。不同地理位置NTM菌種的多樣性有所差別，福建省位于中國東南沿海地區(qū)，當(dāng)?shù)氐膩啛釒夂蚩赡軙绊慛TM菌種分布的多樣性[15-16]。

表2 213株NTM的菌種分布

一、NTM的菌種多樣性分布

在PNB鑒定方法初步鑒定為NTM的261株菌株中，有81.61%的菌株被鑒定為NTM，共包含14個菌種。在所有NTM菌株當(dāng)中，胞內(nèi)分枝桿菌(65.73%)、膿腫分枝桿菌(17.37%)和堪薩斯分枝桿菌(4.22%)分離率排在前3位，為福建省的優(yōu)勢菌種。與中國其他地區(qū)相比，例如，在中國西南地區(qū)重慶市，膿腫分枝桿菌復(fù)合群(36.3%，53/146)、胞內(nèi)分枝桿菌(26.0%，38/146)和偶然分枝桿菌(11.7%，17/146)是主要優(yōu)勢菌種[17]；在中國南部地區(qū)廣東省，膿腫分枝桿菌(48.8%，458/938)、戈登分枝桿菌(22.5%，211/938)和胞內(nèi)分枝桿菌(9.7%，91/938)是主要優(yōu)勢菌種[18]；在中國中部地區(qū)長沙市，胞內(nèi)分枝桿菌(43.9%，381/867)、鳥分枝桿菌(24.1%，209/867)和龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群(21.7%，188/867)是主要優(yōu)勢菌種[19]；在中國北部地區(qū)北京市，胞內(nèi)分枝桿菌(39.2%，51/130)、堪薩斯分枝桿菌(37.7%，49/130)和鳥分枝桿菌(6.9%，9/130)是主要優(yōu)勢菌種[20]，以上這些地區(qū)的NTM分布，無論是在優(yōu)勢菌種方面，還是在所有NTM當(dāng)中的占比方面，均與福建省有很大的差別。此外，中國東部地區(qū)上海市的優(yōu)勢菌種為胞內(nèi)分枝桿菌(31.3%，160/512)、膿腫分枝桿菌(28.3%，145/512)和堪薩斯分枝桿菌(18.6%，95/512)[21]，雖然優(yōu)勢菌種與福建地區(qū)一樣，但是在所有NTM當(dāng)中的占比差別顯著。不同NTM菌種的分布可能具有明顯的區(qū)域特征，即使在同一國家，在不同地理位置上NTM的菌種多樣性分布會有所不同。

黃明翔等[22]分析了福州肺科醫(yī)院2009年到2012年NTM的分離情況，在其研究數(shù)據(jù)中，NTM的臨床分離率為10.20%(649/6362)，NTM中分離率排前3位的分別是胞內(nèi)分枝桿菌(46.53%，302/649)，鳥分枝桿菌(21.26%，138/649)和膿腫分枝桿菌(12.48%，81/649)。本研究與其數(shù)據(jù)存在一定的差異：第一，本研究的NTM分離率為6.35%(213/3355)，明顯低于上述研究的10.20%；第二，本研究的胞內(nèi)分枝桿菌占比為65.73%(140/213)，明顯高于上述研究的46.53%；第三，本研究NTM分離率排位前三的分別是胞內(nèi)分枝桿菌(65.73%，140/213)、膿腫分枝桿菌(17.37%，37/213)和堪薩斯分枝桿菌(4.23%，9/213)，與上述研究中排位前三的NTM菌種存在明顯差異。對于以上兩者之間的差異，筆者認(rèn)為可能的主要原因是菌株來源存在差異：本研究的菌株來源于福建省9個省級結(jié)核病耐藥監(jiān)測點(diǎn)和9個地市級疾控中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，而上述研究的菌株來源于福州肺科醫(yī)院，福州肺科醫(yī)院作為福建省最大的結(jié)核病診治醫(yī)院，所收治的患者情況比較復(fù)雜，復(fù)治或難治患者相對較多，因此，所分離的菌株分布可能會與本次研究有所差異。當(dāng)然，以上猜測需要后續(xù)更多的研究進(jìn)一步分析。

二、PNB鑒定方法與GenoType Mycobacterium CM試劑盒在NTM鑒定方面存在差異

本研究中，GenoType Mycobacterium CM 試劑盒總共檢測到204株單一NTM感染菌株，9株混合感染菌株，以及48株菌株不含NTM(包含21株MTBC和27株分枝桿菌陰性)，而PNB鑒定方法將本研究的261株菌株全部鑒別為NTM，48株菌株試劑盒鑒定結(jié)果與PNB鑒定方法不一致，一方面的原因可能是PNB鑒定方法鑒定NTM存在假陽性，若與GenoType Mycobacterium CM 試劑盒作對比，PNB鑒定方法的假陽性率為18.39%(48/261)，與王建等[23]研究中的假陽性率15.05%(14/93)相近；另一方面的原因可能是GenoType Mycobacterium CM 試劑盒靶基因選擇的問題，導(dǎo)致有些菌種的靶基因不易被擴(kuò)增，造成假陰性的結(jié)果[11]。

三、罕見NTM菌種

本研究中，GenoType Mycobacterium CM試劑盒鑒定為分枝桿菌屬的6株菌株經(jīng)過測序驗(yàn)證，鑒定它們分別為M.arupense、M.peregrinum、M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus各1株，這6個菌種均為罕見NTM。其中，M.arupense和M.peregrinum這2個菌種被相關(guān)研究人員從國內(nèi)的水源環(huán)境中分離出來[24]，M.phocaicum、M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus在國內(nèi)還未見報(bào)道。國外有關(guān)報(bào)道認(rèn)為M.arupense、M.peregrinum和M.phocaicum這3個菌種可能會造成肺部感染疾病[25-27]，而M.sinense、M.vanbaalenii和M.dioxanotrophicus在國外也還未見與人類疾病相關(guān)的報(bào)道。

四、混合感染菌株

除了上述情況外， 9株菌株GenoType Mycobacterium CM 試劑盒檢測為混合感染，但無法鑒定至具體菌種，而DNA測序也無法鑒定混合感染菌株中的菌種。近期有研究報(bào)道，MeltPro Myco試劑盒能夠鑒定MTBC和17種臨床常見的NTM菌種，并且可以準(zhǔn)確鑒定出混合感染菌株中含有的菌種[15]。上述9株菌株經(jīng)過MeltPro Myco試劑盒檢測， 8株為同時(shí)感染MTBC和胞內(nèi)分枝桿菌，1株為同時(shí)感染MTBC和鳥分枝桿菌。該結(jié)果說明了在同一菌株中可能會存在兩種或者兩種以上菌的感染，這種菌株在本研究中的比例為3.45%(9/261)。因此，混合感染菌株的正確鑒定不容忽視，否則將導(dǎo)致患者的治療出現(xiàn)延誤。

綜上所述，本研究結(jié)合了多種分子鑒定手段來進(jìn)行分枝桿菌菌種的鑒定，以保證菌種鑒定的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌的分離率排在福建省NTM的前3位，為福建省的優(yōu)勢菌種，與中國其他地區(qū)有明顯差別。本研究還鑒定出了6種罕見的NTM，這為國內(nèi)罕見分枝桿菌的流行情況及其致病性研究提供了線索。此外，本研究也進(jìn)一步揭示了分枝桿菌混合感染的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，基于治療的角度來看，混合感染菌株的準(zhǔn)確鑒定不容忽視。然而，本研究納入的菌株數(shù)量相對有限，菌株信息統(tǒng)計(jì)還不夠完善，后續(xù)將開展更為廣泛的研究，為我國NTM流行病學(xué)研究提供更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

志謝福州市疾病預(yù)防控制中心(潘潔茹、劉杰)、福州市連江縣醫(yī)院(王志衛(wèi))、廈門市疾病預(yù)防控制中心(洪超)、廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院(馬曉波)、福建省寧德市疾病預(yù)防控制中心(董其英)、福建省寧德市福鼎市醫(yī)院(李步任)、福建省莆田市疾病預(yù)防控制中心(黃麗凡)、福建省莆田市仙游縣醫(yī)院(林晶)、福建省泉州市疾病預(yù)防控制中心(黃曉偉)、福建省泉州市晉江市醫(yī)院(董芬芳)、福建省漳州市疾病預(yù)防控制中心(張?zhí)砹?、福建省漳州市南靖縣疾病預(yù)防控制中心(戴清全)、福建省龍巖市疾病預(yù)防控制中心(鄭建莉)、福建省龍巖市武平縣醫(yī)院(鄭才祥)、福建省三明市疾病預(yù)防控制中心(羅宏活)、福建省三明市尤溪縣總醫(yī)院(鄭艷艷)、福建省南平市疾病預(yù)防控制中心(黃火壽)、福建省南平市邵武縣疾病預(yù)防控制中心(魏文)在本研究菌株收集方面提供了幫助與指導(dǎo)。