廣西壯族自治區(qū)結核分枝桿菌耐藥基因突變特征及其與基因型的相關性分析

羅丹 覃慧芳 葉婧 趙錦明 秦翊翔 藍如束

廣西壯族自治區(qū)結核病報告發(fā)病率盡管近年來以3.39%的年均遞減率逐年下降，但仍居于全國各省(市、自治區(qū))前列[1]。廣西壯族自治區(qū)結核分枝桿菌抗結核藥物耐藥率雖低于全國平均水平[2]，但是結核病患者基數(shù)大，結核病耐藥問題給本地區(qū)結核病防控帶來嚴峻挑戰(zhàn)。本研究運用全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)的方法，探討結核分枝桿菌耐藥相關基因突變情況及其與基因型的相關性，以期為耐藥結核病的早診斷、早治療提供科學參考。

資料和方法

一、菌株來源

對2017年廣西壯族自治區(qū)結核病耐藥監(jiān)測點的所有涂陽肺結核患者痰標本進行分離培養(yǎng)，獲得陽性培養(yǎng)物,最終獲得721株結核分枝桿菌。1株由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供的H37Rv結核分枝桿菌標準菌株作為對照。

二、實驗方法

1.菌株培養(yǎng)：將含有菌液的凍存管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中復蘇。吸取0.1～0.15 ml菌液均勻接種于培養(yǎng)管的羅氏培養(yǎng)基上，每株菌接種2支培養(yǎng)管，將培養(yǎng)管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。具體操作參考《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[3]。培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術有限公司。

2.DNA的提取：采用CTAB法進行DNA的提取[4]，提取的DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆茫鳛閃GS的DNA模板。

3.WGS：由北京諾禾致源生物科技股份有限公司完成檢測，利用高通量二代Illumina 測序技術平臺，進行DNA 片段文庫構建，雙端測序，PE150，深度至少200×，每個樣品總測序深度數(shù)據(jù)量≥1 G Clean Data。測序原始數(shù)據(jù)分別用Scythe (https://github.com/ucdavisbioinformatics/Scythe)和Sickle (https://github.com/najoshi/sickle)兩個軟件進行過濾處理，去除低質量堿基(質量值≤38)、N 堿基比例>10 bp、與Adapter 之間overlap 超過15 bp和可能來源于宿主的reads，得到的Clean Data用于后續(xù)分析。以H37Rv菌株的全基因組序列(NC_000962.2)作為參考模板，使用Samtools軟件進行比對獲得每株菌株單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[5]。將SNP數(shù)據(jù)與已報道結核分枝桿菌耐藥基因突變數(shù)據(jù)庫進行比對[6]，獲得每株菌株對一線抗結核藥品耐藥突變基因的類型。菌株分型是將每株菌株SNP與H37Rv(NC_000962.2)進行比對，獲得每株菌株的基因型[7]。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的整理與分析，計數(shù)資料采用“率或構成比(%)”表示， 組間差異的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

結 果

一、結核分枝桿菌臨床分離株耐藥基因突變類型

WGS結果顯示，721株結核分枝桿菌中，223株發(fā)生了5種抗結核藥品耐藥相關基因突變，總突變率為30.93%，其中單藥突變126株(56.50%，126/223)，多藥聯(lián)合突變97株(43.50%，97/223)。在5種抗結核藥品中，鏈霉素的單藥突變比例最高(44.00%)，其次是異煙肼(40.85%)、吡嗪酰胺(33.33%)、乙胺丁醇(17.19%)、利福平(17.05%)；多藥聯(lián)合突變中，利福平的多藥聯(lián)合突變比例(82.95%，73/88)高于其他藥品(χ2=25.660，P=0.000)(表1)。

二、結核分枝桿菌臨床分離株基因突變位點分布情況

分別對5種藥品的耐藥基因突變情況分析得出，突變率最高的基因為katG基因，突變率為16.09%(116/721)，其次由高到底依次為：rpoB(12.21%，88/721)、embB(8.46%，61/721)、rpsL(6.10%，44/721)、rrs(4.72%，34/721)、pncA(3.61%，26/721)(表2)。

表1 2017年廣西分離結核分枝桿菌對5種抗結核藥品耐藥基因突變類型

對突變率前5位的耐藥基因katG、rpoB、embB、rpsL、rrsL進行突變位點分析顯示，在katG基因突變的116株菌株中，單位點突變占94.83%(110/116)，多位點聯(lián)合突變占5.17%(6/116)。突變率最高的位點為katG315，突變率12.34%，占katG基因總突變的85.34%(99/116)，其中以AGC→ACC堿基突變?yōu)橹鳎糼atG315位點突變的89.90%(89/99)。在rpoB基因突變的88株菌株中，單位點突變與聯(lián)合突變之比為3:1(66/22),突變率最高的位點為rpoB450，突變率4.85%，占rpoB基因總突變的39.77%(35/88)，突變堿基均為TCG→TTG，其次的突變位點為rpoB445(占23.86%，21/88)，rpoB452(占5.68%，5/88)，發(fā)生前 3 個位點突變的菌株數(shù)占rpoB總突變菌株數(shù)的69.32%。在embB基因突變的61株菌株中,單位點突變31株(50.82%)，聯(lián)合突變30株(49.18%)；embB306位點突變率最高(4.02%，29/721)，占embB基因總突變的50.82%，多位點聯(lián)合突變以embB378+embC270突變?yōu)橹?60.00%，18/30)。在rpsL基因突變的44株菌株中,單位點突變41株，占93.18%；以rpsL43位點突變?yōu)橹鳎蛔兟蕿?.27%，占rpsL總突變的86.36%(38/44)。在rrs基因突變的31株菌株中,以rrs462單位點突變和rrs516單位點突變?yōu)橹?67.74%，21/31)。突變率前5位的位點分布情況見表3。

吡嗪酰胺耐藥基因突變率為3.74%(27/721)。在27株發(fā)生吡嗪酰胺耐藥基因突變的菌株中，26株(96.30%)發(fā)生pncA基因突變，僅有1株(3.70%)發(fā)生pnaD基因突變。突變形式以單位點突變?yōu)橹?92.59%，25/27)。

表3 721株結核分枝桿菌臨床分離株基因突變位點分布情況

表4 721株結核分枝桿菌耐藥基因突變在不同基因型中的分布

表5 721株結核分枝桿菌耐藥基因突變位點在不同基因型中的分布

三、結核分枝桿菌耐藥基因突變與基因型的相關性

721株結核分枝桿菌中，北京基因型菌株409株(56.73%)，非北京基因型菌株312株(43.27%)。對突變率較高的5個耐藥基因katG、rpoB、embB、rpsL、rrs的突變情況在不同基因型中的分布進行分析發(fā)現(xiàn)，rpsL基因突變在2種基因型中分布的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=32.090，P=0.000)(表4)。

對突變率前5位的耐藥基因位點katG315、rpoB450、rpsL43、embB306、rpoB445在不同基因型中的分布進行分析顯示，rpsL43位點和rpoB445位點在北京基因型中的突變率高于非北京基因型(χ2=26.992，P=0.000；χ2=7.404，P=0.007)(表5)。

討 論

國內外對一線抗結核藥品耐藥基因突變的研究較為廣泛。相關研究表明，不同地區(qū)結核分枝桿菌耐藥基因是否突變以及突變位點均存在較大差異[8]。廣西壯族自治區(qū)地處祖國西南邊陲，結核病疫情嚴重，耐藥結核病給本地區(qū)結核病控制帶來嚴峻挑戰(zhàn)。基因突變是結核分枝桿菌耐藥的主要機制，而目前尚未有關于廣西壯族自治區(qū)結核分枝桿菌耐藥基因突變情況的研究報道，本地區(qū)結核分枝桿菌相關耐藥基因突變與結核分枝桿菌基因型是否相關亦未得知。本研究采用WGS的方法，探討了廣西壯族自治區(qū)結核分枝桿菌對5種一線抗結核藥品異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇耐藥相關基因突變情況及其與基因型的相關性，為耐藥結核病的早診斷、早治療提供技術依據(jù)。

本研究的5種一線抗結核藥品中，鏈霉素和異煙肼發(fā)生單藥突變的比例較大，分別占總突變的44.00%和40.85%，而利福平和乙胺丁醇則以與其他藥品發(fā)生聯(lián)合突變?yōu)橹鳎謩e占82.95%和82.81%。因此，在發(fā)生利福平和乙胺丁醇耐藥基因突變的菌株中，應警惕其他藥品相關基因同時發(fā)生突變的存在，為臨床用藥提供參考。對各藥品相關耐藥基因的分析顯示，突變率在前5位的基因分別是異煙肼katG、利福平rpoB、乙胺丁醇embB、鏈霉素rpsL和rrs基因，與國內外相關研究基本相同[9-10]。值得注意的是，本研究rpoB基因突變率為12.21%，與國內數(shù)據(jù)相比較高[11]，然而，前期在本地區(qū)開展的結核病耐藥性監(jiān)測結果并未顯示本地區(qū)利福平耐藥表型水平高于全國平均水平，考慮可能與本地區(qū)rpoB基因突變的位點以rpoB450和rpoB445為主有關，相關研究表明絕大多數(shù)rpoB耐藥相關突變發(fā)生于利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)，即密碼子507～533這一81 bp區(qū)域，占全部rpoB耐藥相關突變的95%～97%，其中最常見的是密碼子516、526、531[12-13]，而本地區(qū)rpoB突變位點位于RRDR區(qū)以外，此外，耐藥的產(chǎn)生不僅與突變位點有關，不同堿基突變類型導致的耐藥水平也不同。對各基因發(fā)生突變位點的進一步分析發(fā)現(xiàn)，katG、rpoB、rpsL和rrsL基因均以單位點突變?yōu)橹鳎鴈mbB基因約50%發(fā)生多位點聯(lián)合突變，尤其以embB378+embC270聯(lián)合突變?yōu)橹鳌Ｌ崾驹谶M行耐藥結核病分子診斷方法的制定時應充分考慮各位點突變的特征，本結果可為耐藥分子診斷制劑的研發(fā)提供一定的參考。

本研究異煙肼耐藥基因katG突變位點、氨基酸變化與相關研究結果一致[14-15]。katG基因突變導致異煙肼耐藥的原因主要是315位點的絲氨酸轉變成蘇氨酸，使得katG編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性下降或喪失，導致異煙肼無法活化為異煙酸，致使結核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)了異煙肼fabG1和ahpC基因發(fā)生了突變，值得注意的是，在6株異煙肼耐藥基因聯(lián)合突變的菌株中，均有fabG1基因突變的發(fā)生，這對廣西壯族自治區(qū)耐藥結核病的基因診斷有一定的參考意義。利福平耐藥基因rpoB突變率最高的位點為450，堿基由TCG 突變?yōu)門TG，氨基酸由絲氨酸轉變成亮氨酸，此外，rpoB445位點突變率也較高，這與Nwofor 等[17]的研究結果不相同，可能與研究的地區(qū)、民族差異性有關，結核分枝桿菌耐藥率及耐藥基因突變特征在不同民族中可能存在差異[18-19]。乙胺丁醇耐藥基因embB突變位點為406，堿基主要由 ATG 轉換為 GTG、ATA、ATC、ATT，氨基酸由甲硫氨酸轉變成纈氨酸和異亮氨酸。這與相關報道[20-21]相符。鏈霉素耐藥基因rpsL和rrs的突變最常見的位點分別是43、1401[22]。本研究中rpsL與rrs的突變位點及氨基酸變化與相關研究結果一致[23-24]。rpsL和rrs的突變分別導致糖體蛋白S12與核糖體16S RNA的編碼發(fā)生障礙，從而使結核分枝桿菌對鏈霉素產(chǎn)生耐藥[25]。本研究在721株結核分枝桿菌中僅發(fā)現(xiàn)有27株發(fā)生了吡嗪酰胺耐藥相關基因突變，突變率不高，突變基因也僅有pncA和pnaD2個，突變形式也比較單一，以單位點突變?yōu)橹鳌１狙芯拷Y果一定程度上反映了本地區(qū)吡嗪酰胺的耐藥水平，說明一線抗結核藥品吡嗪酰胺在本地區(qū)仍具有較高的應用價值。

本研究在探討耐藥基因突變與基因型的相關性中發(fā)現(xiàn)，突變率前五位的5個基因中，鏈霉素rpsL基因突變在北京基因型中的發(fā)生率高于非北京基因型；在突變率前五位的5個耐藥基因位點中，鏈霉素rpsL43位點和利福平rpoB445位點突變率在北京基因型中也高于非北京基因型，這與北京基因型更容易傳播耐藥菌株的結論具有一定的一致性，本研究未發(fā)現(xiàn)異煙肼和利福平耐藥基因突變與基因型有相關性，考慮有可能與樣本的局限性有關，可進一步增大樣本含量進行研究。然而，北京基因型是否更容易發(fā)生上述相關耐藥基因的突變，仍需要進一步研究證實。

本研究通過WGS揭示了廣西壯族自治區(qū)結核分枝桿菌對5種一線抗結核藥品利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥相關基因突變的分子特征，在分子水平上快速確定其對一線抗結核藥品基因型耐藥情況，與傳統(tǒng)藥物敏感性試驗6～10周的檢測時間相比，極大縮短了檢測報告時間，大大縮短了耐藥結核病患者的確診周期，具有較高的臨床應用以及推廣價值。隨著分子檢測技術的日趨完善，其在結核病耐藥篩查、相關耐藥基因的分子快速診斷試劑盒的研發(fā)與應用方面具有重要的應用前景。