索羅金小球藻異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中基因表達(dá)的全局調(diào)控

祝棉棉 趙 亮 張 虎 王紅霞 胡 強(qiáng) 韓丹翔

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所微藻生物能源與生物技術(shù)研發(fā)中心, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

近年來, 富含蛋白質(zhì)的微藻作為可持續(xù)供應(yīng)的食品和飼料原料引起全球的廣泛關(guān)注[1]。小球藻(Chlorellaspp.)是一類單細(xì)胞真核綠藻, 普遍生長快, 蛋白質(zhì)含量高, 同時含有多糖和維生素等多種營養(yǎng)活性成分[2,3], 在人類健康和動物營養(yǎng)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[4,5]。小球藻兼具光合自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)三種營養(yǎng)方式[6,7], 目前商業(yè)化的小球藻粉主要是采用異養(yǎng)培養(yǎng)方式生產(chǎn)獲得。與傳統(tǒng)光自養(yǎng)培養(yǎng)模式相比較, 微藻異養(yǎng)培養(yǎng)具有諸多優(yōu)勢。首先, 微藻異養(yǎng)培養(yǎng)時細(xì)胞生長速度快, 且不受光限制, 因此最終能夠達(dá)到較高的細(xì)胞密度。其次, 異養(yǎng)培養(yǎng)微藻一直處于無菌的培養(yǎng)環(huán)境中且培養(yǎng)條件高度可控, 更加有利于規(guī)?；a(chǎn)高品質(zhì)的微藻生物質(zhì)和其他產(chǎn)品[8]。

索羅金小球藻(Chlorella sorokiniana)廣泛分布于淡水環(huán)境, 具有生長快速且能夠直接食用等特點(diǎn),可用于規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)生物質(zhì)、油脂等大宗原料[9]。前期我們分離得到一株索羅金小球藻C. sorokinianaGT-1, 并對其異養(yǎng)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化, 發(fā)現(xiàn)該小球藻在發(fā)酵罐中異養(yǎng)培養(yǎng)最高細(xì)胞密度可達(dá)到220 g/L[9]。然而, 在異養(yǎng)培養(yǎng)下該小球藻蛋白質(zhì)含量顯著低于光自養(yǎng)藻細(xì)胞, 對小球藻藻粉的品質(zhì)造成較大的影響。

大量研究表明微藻的代謝網(wǎng)絡(luò)和生化組成具有極強(qiáng)的可塑性, 因此采用多種培養(yǎng)模式聯(lián)用可以發(fā)揮不同培養(yǎng)方式的優(yōu)勢, 從而同時實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的高產(chǎn)和目標(biāo)產(chǎn)物的積累。例如, Hata等[10]異養(yǎng)培養(yǎng)雨生紅球藻(Haematococcus pluvialisin)達(dá)到高細(xì)胞濃度后, 通過光自養(yǎng)培養(yǎng)誘導(dǎo)蝦青素的積累。Zheng等[11]采用異養(yǎng)-自養(yǎng)耦聯(lián)的混合培養(yǎng)模式提高了索羅金小球藻的生物量和油脂產(chǎn)量。Li等[12]通過異養(yǎng)發(fā)酵-藻液稀釋-光誘導(dǎo)串聯(lián)培養(yǎng)技術(shù)提高了小球藻細(xì)胞內(nèi)葉黃素的含量。盡管采用不同的培養(yǎng)模式來調(diào)控小球藻生化組成的技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用,但是其背后的生物學(xué)過程還有待深入的研究。

隨著組學(xué)分析方法的發(fā)展, 國內(nèi)外研究者鑒定了多個在異養(yǎng)自養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生顯著變化的關(guān)鍵代謝物及其相關(guān)代謝途徑。例如, Wu等[13]通過代謝組分析發(fā)現(xiàn), 當(dāng)索羅金小球藻從異養(yǎng)轉(zhuǎn)入高光缺氮的條件時, 細(xì)胞內(nèi)的糖酵解、氧化戊糖磷酸化及三羧酸循環(huán)等途徑顯著增強(qiáng)。這些途徑的增強(qiáng)能夠直接為油脂的積累提供前體化合物和還原能。Roth等[14]用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法揭示了佐夫色綠藻(Chromochloris zofingiensis)從自養(yǎng)轉(zhuǎn)異養(yǎng)的過程中在基因表達(dá)水平發(fā)生的變化, 為理解佐夫色綠藻在異養(yǎng)條件下積累大量的類胡蘿卜素和油脂提供了基礎(chǔ)。

另外, 多組學(xué)分析還可以服務(wù)于潛在代謝工程靶基因的鑒定, 為開發(fā)新的微藻藻種資源提供了基礎(chǔ)。例如, Liu等[15]運(yùn)用多組學(xué)分析工具揭示了佐夫氏球藻在缺氮條件下積累三酰甘油(Triacylglycerol, TAG)是多個生物學(xué)過程協(xié)同作用的結(jié)果, 并且鑒定出2個三磷酸?；D(zhuǎn)移酶作為后續(xù)功能驗(yàn)證的靶標(biāo)基因, 最終確定葉綠體外的三磷酸?；D(zhuǎn)移酶在TAG生物合成過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的功能。Ge等[16]對缺氮條件下的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)進(jìn)行蛋白組學(xué)分析, 細(xì)胞內(nèi)與支鏈氨基酸分解代謝、糖酵解及油脂代謝相關(guān)蛋白均有顯著變化, 將支鏈氨基酸分解途徑中上調(diào)最顯著的mcc2基因進(jìn)行敲將后, TAG合成途徑減弱并且生物量下降, 為后續(xù)產(chǎn)油微藻優(yōu)化提供了潛在靶基因。

本研究發(fā)現(xiàn)C. sorokinianaGT-1在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)含量僅為細(xì)胞干重的35%左右, 但是該藻株在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后蛋白質(zhì)含量顯著提高。為了揭示索羅金小球藻在營養(yǎng)轉(zhuǎn)換過程中代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控方式, 通過轉(zhuǎn)錄測序分析了異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中C. sorokinianaGT-1中主要涉及碳、氮代謝基因的表達(dá)全局變化, 為后續(xù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化及選擇合適的靶基因?qū)M(jìn)行代謝工程改造以提高蛋白質(zhì)含量提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)選用索羅金小球藻C. sorokinianaGT-1,來自中國科學(xué)院水生生物研究所微藻生物能源與生物技術(shù)研發(fā)中心。異養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)選用改良后的Endo培養(yǎng)基[13], 置于500 mL三角瓶(裝液量350 mL)中避光培養(yǎng), 轉(zhuǎn)速180 r/min, 培養(yǎng)溫度為30℃。異養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)至第4天后, 離心收集藻細(xì)胞(離心力2000×g, 2min, 室溫), 并用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行漂洗(離心力2000×g, 2min, 室溫)1次, 以0.2 g/L的初始接種濃度分別轉(zhuǎn)接到自養(yǎng)組培養(yǎng)基和自養(yǎng)對照組培養(yǎng)基中。自養(yǎng)組培養(yǎng)基選用BG11培養(yǎng)基[17], 置于柱狀光生物反應(yīng)器(φ=5 cm, 裝液量600 mL)中, 在24h連續(xù)光照100 μmol/(m2·s)下培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為(26±2)℃, 通含有2%(v/v)CO2的壓縮空氣。異養(yǎng)對照組培養(yǎng)基選用BG11培養(yǎng)基加入3 g/L葡萄糖, 置于光生物反應(yīng)器(φ=5 cm, 裝液量600 mL), 培養(yǎng)溫度為(26±2)℃, 避光, 通壓縮空氣。

1.2 蛋白質(zhì)含量的測定

改良的Bradford法[18]：稱取10 mg冷凍干燥的藻粉(每個樣品稱取兩份平行), 加入100 μL 1 mol/L NaOH, 振蕩混勻后, 80℃水浴10min; 在水浴結(jié)束后, 將樣品置于冰上, 再依次加入0.9 mL水, 16000×g離心10min, 收集上清。再次往沉淀中加入100 μL 1 mol/L NaOH, 并重復(fù)提取2次, 合并3次提取的上清。為了最大程度減少系統(tǒng)誤差, 本研究將1 mL配制好的3 mg/mL蛋白標(biāo)品溶液進(jìn)行冷凍干燥得到的固體蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品, 同樣用100 μL 1 mol/L NaOH溶解, 再用0.1 mol/L 的NaOH稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL稀釋后的上清和各濃度梯度的蛋白標(biāo)品依次加入1 mL Bradford工作液, 顛倒混勻; 在室溫下反應(yīng)10min后, 以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號做空白對照, 在分光光度計上測各管的A595值; 以標(biāo)樣組各管A595值的平均值為縱坐標(biāo), 對應(yīng)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo), 在Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)2個相同樣品稀釋液A595值的平均值, 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品經(jīng)過稀釋后的蛋白質(zhì)濃度, 再由稀釋倍數(shù)計算原樣品蛋白質(zhì)濃度。

1.3 用于轉(zhuǎn)錄組分析的樣品準(zhǔn)備及總RNA的提取

將小球藻異養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)至第4天, 離心收集藻細(xì)胞(離心力2000×g, 室溫), 并用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行漂洗(離心力2000×g, 2min, 室溫)1次, 以0.2 g/L的初始接種濃度分別轉(zhuǎn)接到自養(yǎng)組培養(yǎng)基和異養(yǎng)對照組培養(yǎng)基中, 各3個生物學(xué)平行, 在12h、24h、48h和72h四個時間點(diǎn)分別取樣后, 離心收集藻細(xì)胞, 用PBS(K2HPO47 g/L, KH2PO43 g/L, NaCl 0.5 g/L,4℃, pH 7.4)進(jìn)行漂洗(離心力2000×g, 2min, 4℃)1次, 離心棄去上清, 置于–80℃保存。按照TRIzol?Reagent提取試劑盒(Invitrogen, 美國)操作說明進(jìn)行總RNA抽提, 并進(jìn)行電泳質(zhì)檢。

1.4 文庫的構(gòu)建及測序

提取樣品總RNA并用DNase I(NEB, 美國)消化DNA后, 使用文庫試劑盒(NEB, 美國)提供的帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA; 在PCR儀中94℃孵育10min, 將mRNA打斷成短片段; 以打斷后的mRNA為模板通過反轉(zhuǎn)錄酶(NEB, 美國)合成一鏈cDNA, 然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA。隨后分別進(jìn)行純化回收、末端修復(fù)、連接接頭、片段篩選和PCR 擴(kuò)增; 構(gòu)建好的文庫用Nano-Drop 8000(Thermo Scientific, 美國)質(zhì)檢, 合格后使用HiSeq 2500測序儀(Illumina, 美國)進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理及de novo拼接

通過Trimmomatic(version 0.35)對獲得的33881432個raw reads進(jìn)行去除接頭、不確定堿基及低質(zhì)量的堿基等操作后, 獲得32864692個clean reads[19]。利用Trinity(version 2.5.1)軟件對clean reads進(jìn)行組裝和質(zhì)量評估[20], 其中一個基因最長的轉(zhuǎn)錄本視為一個Unigene。通過Trinotate (https://github.com/Trinotate/Trinotate.github.io.wiki.git)將組裝得到的Unigene分別于NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG及GO等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對和注釋[21]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過Salmon基于唯一映射的reads的數(shù)量對RNA-seq數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄本豐度進(jìn)行了量化, 并將其標(biāo)準(zhǔn)化為TPM(Transcripts per million transcripts)[22]。Bioconductor packages DESeq2鑒定表達(dá)譜中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本和聚類轉(zhuǎn)錄本[23]。最后采用差值倍數(shù)log2FC(Fold change, FC)和錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate, FDR)假設(shè)檢驗(yàn)篩選顯著差異基因。利用ggplot2 R包, 根據(jù)差異表達(dá)基因在每個樣品里的表達(dá)量(TPM值), 取以2為底的對數(shù)后, 計算歐氏距離, 進(jìn)行系統(tǒng)聚類法。并應(yīng)用超幾何分布檢驗(yàn)對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和 Pathway功能分析[24]。

2 結(jié)果

2.1 C. sorokiniana GT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后蛋白質(zhì)含量提高

C. sorokinianaGT-1能夠在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下快速生長, 在搖瓶培養(yǎng)第5天即可達(dá)到生長平臺期, 最高細(xì)胞濃度可達(dá)到8.185 g/L(圖 1A), 但是在整個培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)含量僅為細(xì)胞干重的35%左右(圖 1B)。將異養(yǎng)培養(yǎng)4d的小球藻轉(zhuǎn)入光自養(yǎng)培養(yǎng)條件后, 藻細(xì)胞生長速度明顯放緩, 培養(yǎng)8d細(xì)胞干重為0.7 g/L, 顯著低于同期的異養(yǎng)培養(yǎng)對照(圖 1C)。蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果表明, 培養(yǎng)4d的異養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入光自養(yǎng)條件下1d后, 蛋白質(zhì)含量由33.63%提高至47.56%, 比同期的異養(yǎng)對照細(xì)胞(33.56%)提高了41.72%(圖 1D)。此后, 蛋白質(zhì)含量維持在最高水平, 于異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)的第3天后逐漸下降到36.44%。與此同時異養(yǎng)對照培養(yǎng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量無明顯變化, 一直維持在35%左右。

圖 1 小球藻在異養(yǎng)與自養(yǎng)條件下的生長及蛋白質(zhì)含量的變化Fig. 1 The growth and protein contents of the Chlorella sorokiniana GT-1 cells under heterotrophic and photoautotrophic conditions

2.2 轉(zhuǎn)錄組序列拼接和組裝

小球藻轉(zhuǎn)錄組測序后進(jìn)行序列拼接和組裝, 對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余后得到72818個Unigene, 總長度、N50、平均長度和GC含量分別為55.214142 M、954 bp、659.28 bp和66.13% (表 1)。通過 BUSCO軟件將轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果與OrthoDB 數(shù)據(jù)庫中幾個大的進(jìn)化分支的單拷貝基因集進(jìn)行比較, 根據(jù)比對上的比例和完整性來評價拼接組裝結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。如表 1顯示, 全轉(zhuǎn)錄組中能夠完全被覆蓋的基因占總數(shù)的77.3%(包括50.2%的單拷貝基因,27.1%的多拷貝基因), 覆蓋不完全的基因占總基因數(shù)的9.5%, 沒有任何比對結(jié)果的基因占基因總數(shù)的13.2%。上述結(jié)果表明組裝的質(zhì)量較好, 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以用于下一步研究。

表 1 小球藻轉(zhuǎn)錄組序列組裝信息和質(zhì)量評估Tab. 1 Assembly statistics and assessment of transcriptome quality in de novo assembly of Chlorella sorokiniana GT-1

2.3 差異表達(dá)基因宏觀分析

如圖 2A所示, 12h、24h、48h和72h四個比較組樣本(即不同時間點(diǎn)下自養(yǎng)組比異養(yǎng)對照組樣本)分別檢測到11256、11299、11795和11049個基因, 其中有9244個共有基因, 4個比較組樣本分別有366、397、257和411個特有基因。根據(jù)基因表達(dá)的差異倍數(shù)(log2FC)大于等于1.5,P-value(Student’st-test)小于等于0.001為標(biāo)準(zhǔn), 通過火山圖可篩選顯著差異表達(dá)基因。如圖 2B所示, 12h、24h、48h和72h四個比較組樣本分別篩選到1305(其中上調(diào)854個, 下調(diào)451個)、3571(上調(diào)1839個, 下調(diào)1732個)、3745(上調(diào)1789個, 下調(diào)1956個)和1314(上調(diào)851個, 下調(diào)463個)個顯著差異表達(dá)基因。這一結(jié)果表明在C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)的過程中, 基因表達(dá)水平發(fā)生了全局的顯著變化。

圖 2 小球藻在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后12h、24h、48h、72h四個比較組樣本差異基因韋恩圖(A)及差異基因火山圖(B)Fig. 2 Venn map (A) and volcanic map (B) for the differential expressed genes in 12h, 24h, 48h and 72h groups of Chlorella sorokiniana GT-1 during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

2.4 差異基因GO與KEGG分類

對12h、24h、48h和72h四個比較組樣本的差異基因進(jìn)行GO功能分類注釋(圖 3)和KEGG功能分類注釋(圖 4)。GO數(shù)據(jù)庫二級條目統(tǒng)計結(jié)果顯示,12h、24h、48h和72h四個比較組樣本的差異基因分別注釋上711、1155、1060和592種功能。對4個比較組差異基因進(jìn)行KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫比對和注釋, 分別注釋上91條、115條、106條和73條代謝途徑, 其中有關(guān)糖代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、能量代謝、核苷酸代謝及油脂代謝的差異基因較多, 而其他有關(guān)細(xì)胞過程、環(huán)境信息加工和組織系統(tǒng)的差異基因相對較少。

2.5 重要代謝通路分析

中心碳代謝糖酵解途徑(Glycolysis)是指1分子葡萄糖生成2分子丙酮酸(Pyruvate), 并產(chǎn)生2分子ATP和2分子NADH的過程, 該途徑分為“準(zhǔn)備階段”和“放能階段”：在準(zhǔn)備階段, 葡萄糖經(jīng)過磷酸化和異構(gòu)化裂解為甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde 3-phosphate, G3P); 在放能階段, 甘油醛-3-磷酸在一系列酶的作用下形成丙酮酸, 并產(chǎn)生NADH和ATP[25]。為探究小球藻異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中糖酵解途徑相關(guān)酶編碼基因的變化, 繪制了富集在該途徑上的差異基因的動態(tài)變化(圖 5A)。醛糖1-差向(異構(gòu))酶(Aldose 1-epimerase, GALM)、葡萄糖-6-磷酸差向異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate 1-epimerase,GPE)和果糖激酶(Fructokinase, FK)的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下12h均無變化, 24h后開始持續(xù)上調(diào),其中果糖激酶的編碼基因自養(yǎng)24h和48h均上調(diào)了300%(P≤0.001)。催化果糖-6-磷酸(Fructose-6-phosphate)生成果糖-1, 6-二磷酸(Fructose-1,6-phosphate)的磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK)在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后快速上調(diào), 之后24h下調(diào)了110%倍(P≤0.001), 然后繼續(xù)上調(diào)。在糖酵解途徑的放能階段, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GPDH)能夠催化甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-phosphate)氧化脫氫, 生成高能磷酸化合物即甘油酸-1, 3-二磷酸(Glycerate-1,3-phosphate)[25]。如圖 5A所示, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下72h前沒有變化,而在72h上調(diào)250%(P≤0.001)。另外, 催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate)轉(zhuǎn)化為丙酮酸的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中持續(xù)上調(diào)。綜上所述, 在C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后, 糖酵解途徑上調(diào), 生成大量的丙酮酸, 并為機(jī)體提供了還原能。糖酵解途徑生成的丙酮酸在有氧條件下會進(jìn)入三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle, TCA cycle), 三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物可以作為其他物質(zhì)合成的碳骨架來源[26]。如圖5A所示, 三羧酸循環(huán)途徑相關(guān)酶的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件均下調(diào)。

圖 3 小球藻在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后12h、24h、48h和72h四個比較組樣本差異基因的GO功能分類Fig. 3 GO functional classification of differential expressed genes in 12h, 24h, 48h and 72h of groups of Chlorella sorokiniana GT-1 during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

除了糖酵解途徑以外, 1分子葡萄糖還可以在磷酸戊糖途徑(Pentose Phosphate Pathway)中進(jìn)行氧化分解, 并且產(chǎn)生12個具有強(qiáng)還原力的NADPH分子[27]。該途徑分為氧化階段和非氧化階段。在氧化階段, 葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate)經(jīng)過2次脫氫生成核酮糖5磷酸(Ribulose-5-Phosphate),同時生成NADPH[27]。如圖 5B所示, 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase, PGDH)在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后持續(xù)上調(diào),并且在自養(yǎng)48h分別上調(diào)200%和160%(P≤0.001);而6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase, PGLS)在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后略微下調(diào), 在自養(yǎng)48h時開始輕微上調(diào)64%(P≤0.001)。在非氧化階段, 核酮糖5磷酸通過一系列反應(yīng)形成果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸, 將磷酸戊糖途徑與糖酵解途徑聯(lián)系起來[27]。如圖 5B所示, 核酮糖-磷酸異構(gòu)酶(Ribulose-phosphate 3-epimerase, RPE)及核糖-磷酸異構(gòu)酶(Ribose 5-phosphate isomerase, RPI)的編碼基因均有2個拷貝, 其中核糖-磷酸異構(gòu)酶的編碼基因在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中持續(xù)下調(diào), 并在自養(yǎng)48h下調(diào)320%(P≤0.001); 核酮糖-磷酸異構(gòu)酶的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后均下調(diào), 其中1個拷貝在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)24h時有輕微上調(diào)后。轉(zhuǎn)酮醇酶(Transketolase,TKT)的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后持續(xù)下調(diào)。轉(zhuǎn)醛醇酶(Transaldolase, TAL)的編碼基因有3個拷貝,其中1個在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后持續(xù)下調(diào), 在自養(yǎng)48h下調(diào)了170%(P≤0.001); 另外在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中持續(xù)上調(diào), 在自養(yǎng)24h分別上調(diào)了230%和450%(P≤0.001)。這說明C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后磷酸戊糖途徑的氧化階段在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)而非氧化階段在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

圖 4 小球藻在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后12h、24h、48h和72h四個比較組樣本差異基因的KEGG功能分類Fig. 4 KEGG functional classification of differential expressed genes in 12h, 24h, 48h and 72h of groups of Chlorella sorokiniana GT-1 during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

主要氮代謝和尿素循環(huán)氮代謝(Nitrogen metabolism)主要是氮的吸收、同化和再利用等過程[28]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Nitrate transporter, NRT)首先將胞外硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi), 使其被還原為NH4+[28]。如圖 6A所示, 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下先下調(diào)再上調(diào), 自養(yǎng)24h時下調(diào)220%,自養(yǎng)72h時上調(diào)160%(P≤0.001), 說明小球藻在自養(yǎng)一段時間后開始大量轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中的硝酸鹽, 用于自身氮同化。谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)途徑是NH4+同化過程中非常重要的酶[29,30]。如圖 6A所示, 在谷氨酸合成酶的編碼基因中, 依賴NADH的谷氨酸合成酶在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下48h上調(diào)180%(P≤0.001)而依賴Ferredoxin的谷氨酸合成酶在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h下調(diào)180%(P≤0.001)。除此之外, 在維持細(xì)胞內(nèi)的C/N平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用的谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下瞬時上調(diào)180%(P≤0.001, 圖 6A)。尿素循環(huán)(Urea cycle)是多余的氨從細(xì)胞內(nèi)排出的一條途徑[29], 該途徑相關(guān)酶的編碼基因在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中均是持續(xù)下調(diào)(圖 6A)。這說明C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后氮代謝增強(qiáng), 并且谷氨酸脫氫酶的編碼基因上調(diào)以維持細(xì)胞內(nèi)C/N平衡。同時, 我們也觀察到異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)后尿素循環(huán)途徑在轉(zhuǎn)錄水平普遍減弱(圖 6B)。

圖 5 中心碳代謝途徑在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)變化Fig. 5 Fold-changes of the transcripts involved in the central carbon metabolism during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

氨基酸的生物合成途徑三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)轉(zhuǎn)化為谷氨酸(Glutamate)后通過特定途徑可以合成鳥氨酸(Ornithine)、精氨酸(Arginine)、脯氨酸(Proline)及羥脯氨酸(4-hydoxyproline)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示鳥氨酸合成途徑中θ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)的編碼基因轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下略微下調(diào)后持續(xù)上調(diào), 鳥氨酸-氧酸轉(zhuǎn)氨酶(Ornithine-oxo-acid transaminase, OAT)的編碼基因轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下下調(diào), 自養(yǎng)24h下調(diào)170%(P≤0.001), 而自養(yǎng)72h后上調(diào)230%(P≤0.001)。脯氨酸合成途徑中脯氨酸4-羥化酶(Prolyl 4-hydroxylase, P4HA)的編碼基因在C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中持續(xù)上調(diào), 分別在自養(yǎng)12h上調(diào)100%和自養(yǎng)48h上調(diào)120%(P≤0.001; 圖 7)。糖酵解途徑的產(chǎn)物丙酮酸可以作為異亮氨酸(Isoleucine)、纈氨酸(Valine)和亮氨酸(Leucine)合成途徑的共同碳骨架來源。轉(zhuǎn)錄組分析顯示丙酮酸族氨基酸合成途徑相關(guān)酶的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下前24h均下調(diào), 而在48h后開始持續(xù)上調(diào)(圖 7)。

圖 6 氮代謝與尿素循環(huán)途徑在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)變化Fig. 6 Fold-changes of the transcripts involved in the nitrogen metabolism and urea cycle during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

此外, 三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸(Oxaloacetate)轉(zhuǎn)化為天冬氨酸(Aspartate)后通過一系列反應(yīng)可以合成天冬酰胺(Asparagine)、賴氨酸(Lysine)、高絲氨酸(Homoserine)、蘇氨酸(Threonine)、高半胱氨酸(Homocysteine)和甲硫氨酸(Methionine)。糖酵解途徑的中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate)能夠生成莽草酸(Shikimate), 其可作為芳香族氨基酸合成途徑的碳骨架來源。糖酵解中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸可以作為甘氨酸(Glycine)和絲氨酸(Serine)生物合成途徑的碳骨架來源。本研究中轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示, 上述途徑相關(guān)酶的編碼基因在C.sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中均是持續(xù)下調(diào)。

光合作用藻類含有兩個作用中心(P700和P680)和兩個光系統(tǒng)(PSⅠ和PSⅡ)[32]。PSⅡ光解水和放氧, 并把釋放的電子送入光合電子傳遞鏈,PSI通過合成NADPH給細(xì)胞生長與代謝提供還原力[32]。轉(zhuǎn)錄組分析顯示光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ及光捕獲復(fù)合體(Light-harvesting complex, LHC)相關(guān)基因在C. sorokinianaGT-1轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下均上調(diào),自養(yǎng)48h后開始下調(diào), 其中光系統(tǒng)Ⅰ亞基PsaO編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h上調(diào)430%(P≤0.001),光系統(tǒng)Ⅱ蛋白PsbW和光系統(tǒng)Ⅰ亞基Ⅴ編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h上調(diào)308%(P≤0.001), 光捕獲復(fù)合體LHCA4、LHCA5和LHCB2的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h分別上調(diào)390%(P≤0.001)、337%(P≤0.001)和304%(P≤0.001), 其他光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ及光捕獲復(fù)合體相關(guān)基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h均上調(diào)了100%以上(P≤0.001), 說明C. sorokinianaGT-1轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h即適應(yīng)光照。除此之外, 鐵氧還原蛋白(Ferredoxin)的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下24h上調(diào)240%(P≤0.001), 并持續(xù)上調(diào)。

圖 7 谷氨酸族和丙酮酸族氨基酸生物合成途徑在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)變化Fig. 7 Fold-changes of the transcripts involved in the biosynthetic pathways of glutamate amino acids and pyruvate amino acids during the transition from heterotrophic to photoautotrophic culturing conditions

與此同時, 我們也觀察到部分和光合作用相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)入異養(yǎng)條件后呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢。例如,細(xì)胞色素(Cytochrome)在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下48h和72h分別下調(diào)485%(P≤0.001)和164%(P≤0.001)。質(zhì)體藍(lán)素(Plastocyanin)編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下48h和72h分別下調(diào)190%(P≤0.001)和118%(P≤0.001)。F型運(yùn)輸ATPase(F-type H+-transporting ATPase)的編碼基因在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后持續(xù)下調(diào)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)C. sorokinianaGT-1在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著提升, 并借助轉(zhuǎn)錄測序分析了此過程中C. sorokinianaGT-1基因表達(dá)的全局變化, 重點(diǎn)分析了碳、氮代謝相關(guān)的代謝途徑在轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化, 試圖為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和設(shè)計代謝工程策略提供理論基礎(chǔ)。

3.1 C. sorokiniana GT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中心碳代謝途徑在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化

對C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中心碳代謝相關(guān)基因進(jìn)行分析, 我們發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑上調(diào),磷酸戊糖途徑上調(diào), 同時三羧酸循環(huán)途徑下調(diào)(圖 8)。這一現(xiàn)象與尖狀柵藻(Scenedesmus acuminatus)異養(yǎng)轉(zhuǎn)光自養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致[33]。糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑均是產(chǎn)生還原能的途徑[25,27]。我們推測, 在高密度異養(yǎng)條件下, 以小球藻和柵藻為代表的綠藻能將吸收的葡萄糖大量用于合成淀粉, 儲存于細(xì)胞中; 當(dāng)藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件后, 伴隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重塑, 藻細(xì)胞需要合成蛋白質(zhì)和脂類分子, 因此需要大量還原能。目前也有研究表明當(dāng)微藻細(xì)胞大量積累油脂時, 葡萄糖分解代謝會更加活躍[34]。例如, 萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和單針藻(Monoraphidium dybowskii)在高光條件下積累油脂的過程中糖酵解途徑關(guān)鍵酶的編碼基因表達(dá)也呈現(xiàn)顯著上調(diào)的趨勢[35,36]。上述結(jié)果表明異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)條件后蛋白質(zhì)含量提高的原因可能與細(xì)胞內(nèi)還原能供應(yīng)顯著提高有關(guān)。因此, 提高細(xì)胞內(nèi)葡萄糖分解代謝, 或阻斷其進(jìn)入淀粉合成途徑, 可作為提高異養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)含量的策略之一。

3.2 C. sorokiniana GT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程氮的吸收同化作用明顯增強(qiáng)

對C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程氮代謝相關(guān)基因進(jìn)行分析, 我們發(fā)現(xiàn)氮的吸收同化作用明顯增強(qiáng)(圖 8)。這一現(xiàn)象說明在自養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)含量提高的原因可能與自養(yǎng)細(xì)胞氮代謝(包括氮的吸收及同化)增強(qiáng)有關(guān)。值得注意的是, 本研究采用的是硝酸鹽作為氮源, 而硝酸鹽通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入胞內(nèi), 首先需要在硝酸還原酶和亞硝酸還原酶作用下還原成銨根離子, 之后才能經(jīng)過氨同化途徑成為生物體可利用的有機(jī)氮, 這一過程需要大量還原能[30]。如前文所述,C. sorokinianaGT-1在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下可能優(yōu)先將吸收的葡萄糖用于淀粉合成, 產(chǎn)能途徑并不活躍, 這也將間接影響硝酸鹽的還原過程?；谏鲜龇治? 我們認(rèn)為如果采取銨鹽作為氮源, 在氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同化, 該途徑從能量角度將更加經(jīng)濟(jì), 有可能克服異養(yǎng)條件下產(chǎn)能不足的瓶頸, 因此可作為提高異養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)的含量和產(chǎn)量的策略之一。目前也有研究證實(shí)了此猜想, Xu等[37]使用銨鹽氯化銨和氨水作為異養(yǎng)發(fā)酵的氮源, 成功提高了小球藻蛋白質(zhì)含量。

3.3 C. sorokiniana GT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程氨基酸生物合成途徑在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化

對C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程氨基酸生物合成途徑進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)不同類型的氨基酸生物合成的基因在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)的過程中呈現(xiàn)不同的響應(yīng)模式, 例如谷氨酸族氨基酸和丙酮酸族氨基酸生物生物合成途徑上調(diào), 而芳香族氨基酸、天冬氨酸族氨基酸和絲氨酸族氨基酸生物合成途徑下調(diào)(圖 7和圖 8)。這說明營養(yǎng)方式不僅可以改變蛋白質(zhì)的含量, 也會對蛋白質(zhì)的氨基酸組成帶來顯著的影響。在本研究中, 丙酮酸族氨基酸的積累可能是C. sorokinianaGT-1在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中糖酵解途徑上調(diào)丙酮酸積累的結(jié)果。在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中糖酵解途徑增強(qiáng)生成了大量的丙酮酸, 丙酮酸既可作為其他物質(zhì)(氨基酸和乙酰輔酶A)合成的前體,也可進(jìn)入三羧酸循環(huán)[25,26]。丙酮酸流向了氨基酸合成途徑, 這也間接反映了異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程氮同化途徑的增強(qiáng)及三羧酸循環(huán)的減弱。

在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中增加的氨基酸可能在細(xì)胞適應(yīng)變化的環(huán)境及不同營養(yǎng)模式的過程中扮演特殊的生理功能。精氨酸主要由鳥氨酸轉(zhuǎn)化而來,是其他氨基酸代謝的前體, 也是細(xì)胞內(nèi)有機(jī)氮的主要儲存和運(yùn)輸形式[38]。另外有研究表明精氨酸的積累還可以維持逆境細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài), 幫助細(xì)胞快速從脅迫狀態(tài)中恢復(fù)[39]。本研究中鳥氨酸合成途徑在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)條件下48h后開始上調(diào), 進(jìn)一步反映了細(xì)胞內(nèi)氮代謝增強(qiáng), 有機(jī)氮以氨基酸形式儲存在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的羥脯氨酸主要是與阿拉伯糖的糖苷鍵連接, 形成糖蛋白, 作為細(xì)胞壁的成分[40]。在自養(yǎng)條件下羥脯氨酸的積累說明了在不同培養(yǎng)條件下, 微藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變。這一現(xiàn)象可以在未來的研究中進(jìn)行探究。羥脯氨酸除了可作為細(xì)胞壁組成外, 還可以在脯氨酰基水解酶的作用下生成脯氨酸[41]。脯氨酸的積累通常發(fā)生在脅迫條件下, 脯氨酸可以維持細(xì)胞滲透壓和穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu), 消除自由基, 減輕細(xì)胞質(zhì)酸中毒, 緩沖細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位及調(diào)節(jié)合適的NADP+/NADPH比例等[41—43]。并且有研究表明耐壓植物的脯氨酸含量明顯高于普通植物[44]。在本研究中脯氨酸合成途徑相關(guān)酶的編碼基因在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程中均上調(diào),這可能是細(xì)胞為了適應(yīng)營養(yǎng)模式轉(zhuǎn)變發(fā)生了內(nèi)在調(diào)節(jié), 同時脯氨酸的積累也作為C. sorokinianaGT-1在動態(tài)的環(huán)境中均能正常生長的前提條件。

圖 8 小球藻異養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入自養(yǎng)培養(yǎng)條件后與蛋白質(zhì)含量增加有關(guān)的代謝途徑變化模式圖Fig. 8 Model on the changing metabolic pathways contributing to the enhanced protein contents of the Chlorella sorokiniana GT-1 cells during the transition from the photoautotrophic to heterotrophic conditions

3.4 C. sorokiniana GT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程光合作用相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化

對C. sorokinianaGT-1異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)過程光合作用相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況進(jìn)行分析, 我們發(fā)現(xiàn)在異養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)保留了部分的光合系統(tǒng)蛋白質(zhì), 在轉(zhuǎn)入自養(yǎng)后這些蛋白的轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào)。例如, 光捕獲復(fù)合體葉綠素a/b蛋白, 結(jié)合微藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素, 具有捕獲和傳遞光能, 維持類囊體膜結(jié)構(gòu)等功能[45,46]。Lu等[47]研究表明葡萄糖的存在會降低綠球藻(Chlorococcumsp.)中光捕獲復(fù)合體葉綠素a/b蛋白的mRNA豐度。并且Roth等[14]觀察到去除培養(yǎng)基中葡萄糖后, 佐夫色綠藻細(xì)胞內(nèi)類囊體膜會再生。因此, 在本研究中光捕獲復(fù)合體葉綠素a/b蛋白在異養(yǎng)條件下表達(dá)量低的原因可能是由于缺少光激活及存在葡萄糖, 從而抑制了該蛋白的活性。除此之外, 本研究還檢測到光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)蛋白的mRNA豐度在轉(zhuǎn)入光自養(yǎng)培養(yǎng)條件后迅速上調(diào), 說明光照激活了細(xì)胞內(nèi)的光合系統(tǒng)。我們認(rèn)為, 光合系統(tǒng)蛋白質(zhì)的含量增加也為總蛋白含量的增加做出了顯著的貢獻(xiàn)。而值得注意的是, 部分光合蛋白在自養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)錄本的絕對豐度比異養(yǎng)條件更低, 這些蛋白在異養(yǎng)條件下是否行使其他功能, 值得未來進(jìn)一步探究。

綜上所述, 本研究通過揭示C. sorokinianaGT-1在異養(yǎng)轉(zhuǎn)自養(yǎng)條件下碳氮代謝基因表達(dá)的變化,分析了在自養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)含量提高的可能原因(包括糖酵解和磷酸戊糖途徑增強(qiáng), 為細(xì)胞提供了大量還原能和其他物質(zhì)合成的碳骨架, 及在自養(yǎng)條件下細(xì)胞氮的吸收和同化效率高等), 為后續(xù)通過培養(yǎng)條件優(yōu)化或代謝工程改造提高C. sorokinianaGT-1產(chǎn)蛋白質(zhì)的能力提出了新的思路。