斑點叉尾鮰病毒實時熒光LAMP檢測方法的建立

郝 凱 劉洪巖 陳校輝 袁軍法 李莉娟 邊文冀 趙 哲

(1. 河海大學海洋學院, 南京 210098; 2. 江蘇省淡水水產研究所, 南京 210017; 3. 華中農業大學水產學院, 武漢 430070)

斑點叉尾鮰(Letalurus punetaus), 原產于北美,是一種溫水性的淡水養殖魚類, 1984年引入中國后,養殖面積和總產量不斷增加, 目前已在我國20多個省份養殖, 2016年總產量達28.5×107kg, 我國已經成為世界最主要的斑點叉尾鮰養殖國家之一[1]。斑點叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒, 又稱鮰皰疹病毒Ⅰ型(Ictalurid herpesvirus Ⅰ), 該病毒是魚類異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)中重要的一員, 能夠對斑點叉尾鮰魚苗和魚種造成致死性感染[2—4]。隨著斑點叉尾鮰養殖規模的不斷擴大, 集約化程度日益提高,養殖環境惡化, 斑點叉尾鮰病害日趨嚴重, 特別是由斑點叉尾鮰病毒(CCV)引起的斑點叉尾鮰皰疹病毒病(Channel catfish virus disease, CCVD)危害最大[5,6], 給斑點叉尾鮰養殖業造成嚴重的經濟損失。但是, 目前對其所引起疾病尚無有效的治療方法, 因此加強對該病早起快速的診斷和篩查, 防止該病在我國的發生、傳播和大規模流行十分必要。

目前, 參照世界動物衛生組織(OIE)《水生動物疫病診斷手冊》及我國的出入境檢驗檢疫行業標準, CCVD的確診是基于細胞培養的病毒分離，然后用中和試驗、免疫熒光、酶聯免疫吸附(ELISA)或PCR鑒定[7—9]。以上方法雖然準確可靠,在實驗室檢測中廣泛應用, 但這些方法存在操作相對復雜、檢測成本高及對檢測人員較高的技術要求等問題, 限制了它們在斑點叉尾鮰養殖現場推廣使用。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP)是一種新型核酸擴增技術, 該技術在保持傳統PCR技術優點的基礎上, 進一步增強了反應的特異性和縮短了檢測時間[10];由于LAMP反應具有簡單、快速、高效和經濟等特點, 已廣泛應用于多種病原微生物的現場化檢測[11,12]。對于應用LAMP技術檢測CCV, 2015年Liu等[13]的實驗室報道了利用凝膠電泳建立了CCV的LAMP檢測方法。本研究以CCV磷酸激酶蛋白編碼基因ORF77為檢測靶標設計特異性的環介導等溫擴增引物, 通過實時熒光PCR對CCV進行檢測, 建立一種用于CCV快速檢測的實時熒光LAMP方法。

1 材料與方法

1.1 材料

CCV感染陽性斑點叉尾鮰樣品由江蘇省淡水水產研究所提供, 于–80℃保存。白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus, KHV)、真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)的基因組DNA由河海大學大學海洋科學實驗中心保存。

1.2 方法

LAMP引物設計: 參照CCV基因組及相關文獻資料, 以病毒磷酸激酶蛋白編碼基因ORF77保守區域為檢測靶位點, 利用在線軟件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)設計6條LAMP引物(表 1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基因組DNA提取: 取CCV感染陽性斑點叉尾鮰的腎臟組織材料置于滅菌后的研缽中, 加入液氮研磨后, 將樣品轉入含有500 μL PBS無菌離心管中,然后12000 r/min離心5min收集上清用于DNA提取。DNA提取利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒進行(TIANGEN, 北京), 具體操作步驟參照試劑盒提供的說明書進行。使用微量紫外分光光度計對提取的DNA進行濃度測定。

表 1 CCV ORF77實時熒光LAMP擴增引物序列Tab. 1 Primers used for real-time LAMP targeted on ORF77 gene of CCV

重組質粒的構建: 以上述提取的CCV感染陽性DNA為模板, 使用CCV-F3和CCV-B3進行PCR反應, 回收擴增片段與pMD18-T載體連接, 轉化DH5α感受態細胞, 構建含有ORF77目的片段的pMD18-T-ORF77重組質粒。用微量紫外分光光度計測定質粒濃度, 計算質?？截悢?。

實時熒光LAMP反應體系和反應條件: 25 μL的反應體系包括: CCV-F3 0.2 μmol/L、CCV-B3 0.2 μmol/L、CCV-FIP 1.6 μmol/L、CCV-BIP 1.6 μmol/L、CCV-LF 0.8 μmol/L和CCV-LB 0.8 μmol/L,LAMP反應液(10 mmol/L dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液和150 mmol/L MgSO4, 三者的體積比為8∶5∶2)12.5 μL, Bst DNA聚合酶10U, 10×SYTO-9 0.5 μL, DNA模板 1—100 ng, ddH2O補齊到25 μL。

實時熒光LAMP反應條件: 63℃ 1min, 共45個循環。利用LightCycler96熒光定量PCR儀(Roche公司)收集熒光信號。

實時熒光LAMP檢測的靈敏度試驗: 將構建和制備的pMD18-T-ORF77質粒進行8個梯度稀釋(108、107、106、105、104、103、102和101copies/μL),每個稀釋度樣品取1 μL作為模板, 進行實時熒光LAMP檢測的靈敏度試驗。

實時熒光LAMP檢測的特異性試驗: 以白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)的基因組DNA為檢測模板進行實時熒光LAMP擴增, 對本研究建立的CCV實時熒光LAMP檢測方法的特異性進行測試。

實時熒光LAMP檢測的重復性試驗: 將構建和制備的pMD18-T-ORF77質粒進行2個梯度稀釋, 其濃度分別為105和102copies/μL, 每個稀釋度樣品取1 μL作為模板, 不同稀釋度樣品進行20次重復, 對實時熒光LAMP檢測的重復性進行測試。

實際樣品檢測: 用所建立的實時熒光LAMP檢測方法對病毒感染的斑點叉尾鮰腎臟組織樣品進行檢測, 評價建立的實時熒光LAMP檢測方法的實際應用性。

2 結果

2.1 實時熒光LAMP檢測CCV的靈敏度

將實時熒光LAMP擴增靶位點克隆到pMD18-T載體中, 構建pMD18-T-ORF77質粒, 使用微量紫外分光光度計測定質粒濃度, 計算質?？截悢? 并將質粒稀釋到108、107、106、105、104、103、102和101copies/μL, 分別以此為模板進行實時熒光LAMP擴增, 在反應大約12min后出現明顯的峰值,隨著擴增模板的稀釋濃度的降低, 出峰時間逐漸延后, 最低能檢測到的質粒濃度為102copies/μL, 最晚出峰時間大約在35min(圖 1)。

圖 1 實時熒光LAMP檢測靈敏性Fig. 1 Sensitivity of real-time fluorescent LAMP

2.2 實時熒光LAMP檢測CCV的特異性

分別以斑點叉尾鮰皰疹病毒(CCV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)的基因組DNA為LAMP檢測模板, 進行實時熒光LAMP擴增, 檢測本研究建立的CCV實時熒光LAMP檢測方法的特異性。結果顯示本研究建立的實時熒光LAMP檢測方法只對CCV陽性基因組出現明顯的“S”形擴增曲線, 但對其他6種水生動物病毒DNA均為陰性反應(圖 2)。

圖 2 實時熒光LAMP檢測特異性Fig. 2 Specificity of real-time fluorescent LAMP

2.3 實時熒光LAMP檢測CCV的重復性

將構建的pMD18-T-ORF77質粒稀釋到105和102copies/μL, 分別以此為模板進行實時熒光LAMP擴增, 結果如圖 3所示, 在同一次實驗內, 同一質粒濃度下, 20個平行樣品的擴增曲線基本重合, 分別在反應大約20min和35min出現明顯的峰值。

圖 3 實時熒光LAMP檢測重復性Fig. 3 Repeatability of real-time fluorescent LAMP

2.4 實際樣品檢測結果

通過對待檢實際樣品腎臟組織檢測結果顯示(圖 4), 本研究建立的實時熒光LAMP方法對CCV感染的實際樣品基因組出現明顯的“S”形擴增曲線,對產物進行擴增測序, 顯示本研究建立的實時熒光LAMP方法外引物擴增出的產物為靶基因目的片段。

圖 4 實際樣品實時熒光LAMP檢測Fig. 4 Actual samples detection of real-time fluorescent LAMP

3 討論

由斑點叉尾鮰病毒引起的斑點叉尾鮰皰疹病毒病傳染快, 魚苗、魚種死亡率可達90%以上。目前對本病尚無有效的藥物治療, 因此加強斑點叉尾鮰苗種和成魚類檢疫對防止該病大規模爆發具有重要意義。PCR方法能對病原微生物的靶基因進行特異性擴增, 因而是對病原物感染進行早期診斷的重要手段之一。目前已有以實時熒光定量PCR技術為依托的CCV檢測方法的報道, 因其靈敏度高、特異性好等優點, 在病原體定性及定量檢測等方面有著廣泛的應用前景[14]。但熒光定量PCR存在檢測耗時、操作相對復雜及依賴PCR儀等問題,造成其難以在基層及現場快速診斷中大規模推廣應用[15,16]。LAMP是由日本榮研化學株式會社Notomi等[17]在2000年研發出的一種新型的能夠在體外進行恒溫擴增核酸片段的技術, 該技術根據靶基因序列的6個或8個位置區域, 設計出4種或6種具有特異性的引物, 然后在DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)催化作用下恒溫持續數10 min, 完成核酸的擴增檢測, 不需要復雜的溫度循環過程, 與PCR法相比節省了大量的時間、降低了檢測成本, 適合于病原微生物的現場快速檢測和基層普及應用[18,19]。

CCV基因組中磷酸激酶蛋白編碼基因(ORF77)序列與其他魚類皰疹病毒基因序列相似性較低,本研究建立的實時熒光LAMP檢測CCV的方法針對ORF77靶基因保守區域設計了6條引物, 能特異性識別靶基因上的8個獨立區域, 在恒溫反應35min后即可完成靶基因檢測, 最低檢測線可達100個DNA拷貝(圖 1)。Liu等[13]利用凝膠電泳進行LAMP反應產物的檢測, 結果顯示其能夠檢測到10?9稀釋的病毒DNA; 本研究建立的實時熒光LAMP檢測方法與6種常見水生動物病原DNA均無交叉反應(圖 2和圖 4); 同一樣品于組內或組間重復性試驗發現, 在同一DNA濃度下, 20個平行樣品的擴增曲線基本重合, 分別在反應大約20min和35min出現明顯的峰值(圖 3)。因此, 本研究建立的方法具有反應時間短、特異性強、靈敏度高和重復性好的特點。

目前國內外常用的鑒定LAMP反應產物的方法為染料法、濁度法和凝膠電泳法[13,20,21]。本研究建立的實時熒光LAMP方法, 通過實時采集熒光信號對擴增過程進行及時判斷, 在保證高敏感性的同時, 使結果形象化和數據化, 不需要繁瑣的電泳和紫外觀察等過程, 又能避免開蓋而導致的污染,比傳統的利用染料法、濁度法和凝膠電泳法判斷反應終點更加客觀可靠[22,23]。同時, 本研究使用SYTO-9作為LAMP反應熒光顯色劑, 可以有效避免使用SYBR Green Ⅰ 作為LAMP反應熒光顯色劑過于靈敏, 從而造成陰性反應孔出現非特異性擴增曲線, 影響結果判斷[13,24]。此外, 本研究建立的方法擺脫了傳統檢測方法對昂貴儀器設備的依賴, 可使用便攜式儀器, 如ESE-Quant tube scanner等進行操作。由于其價格相對便宜, 體積較小, 便于攜帶, 節約了大量成本, 非常適合水產養殖現場檢測使用。

綜上所述, 本研究建立的CCV實時熒光LAMP檢測方法操作簡單、檢測快速、特異性好、靈敏度高、結果可靠, 能為斑點叉尾鮰養殖現場和實驗室的斑點叉尾鮰皰疹病毒病病原的快速診斷和實時監測方面提供技術支撐。