飼料添加β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦生長性能、血清代謝、免疫相關基因表達和抗亞硝酸氮應激能力的影響

趙紅霞 陳 冰 * 莫文艷 黃 文 , 黃燕華 曹俊明 *

(1. 廣東省農業科學院動物科學研究所, 廣州 510640; 2. 農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室, 廣州 510640;3. 廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室, 廣州 510640; 4. 廣州飛禧特生物科技有限公司, 廣州 510640)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei), 俗稱南美白對蝦, 具有環境適應性強、生長速度快、養殖周期短和市場需求量大等優點, 是我國養殖范圍最廣和產量最高的對蝦種類[1]。然而, 隨著對蝦集約化養殖的迅速發展, 養殖水環境惡化和病害頻發等諸多問題日益嚴峻, 嚴重影響了對蝦養殖業的可持續發展。通過在飼料中添加功能性添加劑促進凡納濱對蝦營養物質代謝和免疫抗氧化功能是提高生長和抗病抗應激能力的重要途徑[2,3]。β-1,3-葡聚糖作為一種免疫增強劑已廣泛應用在水產養殖業中,并取得了顯著成效。在飼料中添加β-1,3-葡聚糖能夠促進凡納濱對蝦生長性能、提高免疫功能和抗環境應激能力[4]。

免疫刺激劑在生長和免疫反應中發揮重要作用, 但其作用效果與其添加劑量和時間相關。β-葡聚糖的添加劑量以0.1%—1%效果最佳, 高劑量可能降低魚蝦免疫力, 并產生免疫疲勞[5—8]。免疫刺激劑具有較短時間持續作用, 長期添加β-葡聚糖可能導致對蝦產生免疫疲勞[9—12]。斑節對蝦(Penaeus monodon)攝食含葡聚糖餌料3d即可顯著提高酚氧化酶活性、血細胞總數和血細胞對哈維弧菌(Vibrio harveyi)的吞噬活力[10]。β-葡聚糖投喂斑節對蝦親蝦24h后其白細胞吞噬活性大大增強, 超氧陰離子產量增加, 這種免疫作用可持續40d[11]。采用0.2%β-葡聚糖投喂凡納濱對蝦40d, 鹽度應激24h后對蝦酚氧化物酶水平下降, 可能與免疫疲勞有關[12]。長期連續攝食免疫刺激劑可能造成動物生理的應激, 影響生長、營養物質代謝或抗病抗脅迫能力。因此, 本實驗觀察了持續或間隔投喂β-1,3-葡聚糖84d對長期養殖凡納濱對蝦生長、血清代謝、免疫相關基因表達和抗亞硝酸氮應激能力的影響, 以期為β-1,3-葡聚糖在對蝦飼料中的精準使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以魚粉和大豆濃縮蛋白等為主要蛋白源, 魚油為主要脂肪源, 玉米淀粉為主要糖源配制等氮等能的基礎飼料, 飼料配方及化學組成如表 1所示。在基礎飼料中添加0.1% β-1,3-葡聚糖(Sigma公司, 純度＞99.0%), 配制1種實驗飼料。實驗按照不同投喂方式分為4個飼料組, 分別為: (1)對照組(G0): 基礎飼料, 持續投喂84d; (2)處理組1(G1): 0.1%β-1,3-葡聚糖飼料, 持續投喂84d; (3)處理組2(G2): 0.1%β-1,3-葡聚糖飼料7d +基礎飼料7d, 循環投喂84d。(4)處理組3(G3): 0.1%β-1,3-葡聚糖飼料14d+基礎飼料14d, 循環投喂84d。飼料原料過60目篩粉碎, 混合均勻后用SLX-80型擠壓機制成直徑為1.0 mm的顆粒飼料, 在45℃下烘干。自然冷卻后放入密封袋中于–20℃冰箱中保存待用。

1.2 實驗蝦與飼養管理

養殖實驗在廣東省農業科學院動物科學研究所水產研究室室內循環水養殖系統中進行。養殖系統由圓柱形玻璃纖維桶(直徑80 cm, 高70 cm)組成, 容水量300 L。實驗用凡納濱對蝦先在室外循環水泥池中馴養2周, 期間投喂基礎飼料。實驗開始前禁食24h, 選取初始體均重為(0.43±0.01) g的凡納濱對蝦幼蝦480尾, 隨機分為4組, 每組設4個重復,每個重復40尾蝦, 分別以不同周期投喂2種飼料, 實驗期為12周。實驗期間定量投喂, 每日分別在09:00、14:30和20:30分3次投喂, 日投喂量為體重的4%—6%, 根據攝食情況調整投喂量。每天觀察蝦體健康狀況, 記錄死亡情況。養殖用水為進水速率為1.5 L/min的曝氣自來水, 每天對養殖水體進行3次監測, 實驗期間鹽度5‰—6‰, 水溫27—31℃,氨氮＜0.20 mg/L, 亞硝酸鹽＜0.01 mg/L, 溶氧＞6.0 mg/L, pH 7.5—7.9。實驗期間采取自然光源, 時間為2019年7月14日至2019年9月7日, 地點為廣州市天河區五山。

1.3 樣品采集

在飼養實驗結束前, 禁食24h, 統計每桶對蝦的存活數, 稱量每桶蝦體重, 計算末體重、特定生長率和存活率。每桶隨機選取3尾置于–20℃保存, 用于檢測全蝦體組成。以無菌的1 mL注射器及針頭自圍心腔取血, 置于Eppenddorf離心管中, 靜置2h,3000 r/min離心10min, 取上清液作為待測血清,–78℃冷凍保存備用。采血后的對蝦在冰盤上采集肌肉, 迅速投入液氮中速凍, 保存于–78℃冰箱用于肌肉血藍蛋白(Haemocyanin)、脂多糖/?-1,3-葡聚糖結合蛋白(LPS/b-glucan binding protein, LGBP)、抗菌肽(Penaedin-3)、酚氧化物酶原(Prophenoloxidase, proPO)、絲氨酸蛋白酶(Serine proteinase, SP)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)mRNA表達的分析。

1.4 亞硝酸氮應激實驗

在12周的飼養實驗結束后, 每組保留60尾對蝦進行應激實驗。應激實驗停止循環水, 每個實驗組設4個應激實驗缸, 應激持續120h, 應激源為亞硝酸鈉(NaNO2)。150 L水體加入NaNO2, 使氮濃度達到20 mg/L。實驗期間繼續投喂實驗飼料, 觀察并記錄各組對蝦0、24h、48h、72h、96h和120h內死亡情況, 計算120h內的累計死亡率。和應激實驗結束后, 采集對蝦血清和肌肉樣品, 置于–78℃冰箱冷凍保存備用。

累計計死亡率(Cumulative mortality rate,CMR,%)=應激后實驗魚死亡尾數/應激前實驗魚尾數×100

1.5 指標測定

生長性能計算增重率(Weight gain rate,WGR,%)=100×(終末體重－初始體重)/初始體重; 特定生長率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100×(ln終末體重－ln初始體重)/飼養天數; 存活率(Survival rate,SR, %)=100×實驗結束時蝦尾數/實驗開始時放蝦尾數。

實驗飼料和實驗蝦營養成分測定實驗飼料和實驗蝦全蝦營養成分測定參照AOAC(1984)[13]方法。水分含量采用105℃烘箱(HDG-9203A, 上海一恒科學儀器有限公司)烘干至恒重測定, 粗蛋白質含量采用凱氏自動定氮儀(KDN-103F, 上海纖檢儀器有限公司)測定, 粗脂肪含量采用索氏抽提儀(SXT-06, 上海洪紀儀器設備有限公司)測定, 粗灰分含量采用550℃灼燒法(SX410, 天津泰斯特儀器有限公司)測定。

血清代謝指標分析血清總蛋白(Total protein, TP)、葡萄糖(Glucose, GLU)、膽固醇(Cholesterol, CHO)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、乳酸鹽(lactate)含量及谷草轉氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase, GOT)和谷丙轉氨酶(Glutamic-pyruvic transaminase, GPT)活性采用Beckman Synchron CX5全自動生化分析儀測定。

基因mRNA表達量分析取對蝦肌肉組織在液氮中充分研磨成粉狀, 加入裂解液按TaKaRa RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA。采用實時熒光定量PCR測定對蝦肌肉LGBP、Haemocyanin、Penaedin-3a、proPO、SP和SOD mRNA相對表達量, 以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因。根據對蝦上述6種基因的cDNA序列利用Primer5.0軟件設計實時熒光定量PCR特異引物(表 2)。實時熒光定量PCR(SYBR Premix ExTaqII, TaKaRa, 大連)擴增程序為93℃預變性3 min, 40個循環包括93℃ 30s,55℃ 45s, 72℃ 45s。采用2?ΔΔCt法分析基因相對表達量[14]。

1.6 數據分析

實驗結果用平均值±標準誤表示, 采用SPSS11.5軟件進行數據分析和統計, 先對數據作單因素方差分析(One-way ANOVA), 若組間差異顯著, 再用Duncan氏多重比較。顯著性水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 凡納濱對蝦生長性能

如表 3所示, G0、G1、G2和G3組凡納濱對蝦的終末均重、特定生長率和存活率沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 凡納濱對蝦肝胰腺消化酶活性

由表 4可知, G3組凡納濱對蝦肝胰腺的蛋白酶活性顯著高于G1組(P＜0.05)。G2和G3組凡納濱對蝦肝胰腺的脂肪酶活性顯著高于G0和G1組(P＜0.05)。各實驗組凡納濱對蝦肝胰腺的淀粉酶活性沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 凡納濱對蝦體成分

如表 5所示, G0、G1、G2和G3組凡納濱對蝦的全蝦水分、粗蛋白質、粗脂肪和灰分含量沒有顯著性差異(P＞0.05)。

表 3 β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦生長性能的影響Tab. 3 Effects of dietary β-1,3-glucan on growth performance of litopenaeus vannamei

表 4 β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦肝胰腺消化酶活性的影響Tab. 4 Effects of dietary β-1,3-glucan on activities of digestive enzymes in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei (U/mg prot)

表 5 β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦體成分的影響(%DM)Tab. 5 Effects of dietary β-1,3-glucan on body composition of Litopenaeus vannamei

2.4 亞硝酸氮應激120h累計死亡率

如圖 1所示, 亞硝酸氮應激120h, G1、G2和G3組凡納濱對蝦累計死亡率顯著低于G0組(P＜0.05), G3組凡納濱對蝦累計死亡率顯著低于G0、G1和G2組(P＜ 0.05)。

2.5 凡納濱對蝦應激前后血清代謝指標

如圖 2所示, 在養殖84d后, G1、G2和G3組凡納濱對蝦血清CHO和TG含量顯著高于G0組(P＜0.05)。各實驗組凡納濱對蝦血清TP、GLU、LD、GOT和GPT活性無顯著差異(P＞0.05)。亞硝酸氮應激120h后, G1、G2和G3組凡納濱對蝦血清TP含量顯著高于G0組(P＜0.05)。G1和G3組凡納濱對蝦血清乳酸鹽含量顯著高于G0組(P＜0.05)。凡納濱對蝦血清葡萄糖含量、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性在G0組達到最高, 顯著高于G1、G2和G3組(P＜0.05)。各實驗組凡納濱對蝦血清CHO和TG含量無顯著差異(P＞0.05)。

圖 1 β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦抗亞硝酸氮應激能力的影響Fig. 1 Effects of dietary β-1,3-glucan on anti- nitrite-nitrogen stress ability of Litopenaeus vannamei

2.6 凡納濱對蝦應激前后免疫相關基因表達

如圖 3所示, 在養殖84d后, G3組凡納濱對蝦肌肉LGBP和proPO mRNA表達顯著高于G0、G1和G2組(P＜0.05)。G3組凡納濱對蝦肌肉SOD mRNA表達顯著高于G0和G1組(P＜0.05)。在各實驗組中凡納濱對蝦肌肉Haemocyanin、Penaedin-3a和SP mRNA表達量無顯著差異(P＞0.05)。在亞硝酸氮應激120h后, G3組凡納濱對蝦肌肉LGBP和proPO mRNA表達顯著高于G0和G1組(P＜0.05)。G1組凡納濱對蝦肌肉SP mRNA表達顯著高于G0、G2和G3組(P＜0.05)。G1、G2和G3組凡納濱對蝦SOD mRNA表達顯著高于G0組(P＜0.05)。各實驗組凡納濱對蝦肌肉Haemocyanin和Penaedin-3a mRNA表達量無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

研究表明, 在飼料中短期添加β-葡聚糖可以提高凡納濱對蝦生長性能[3,15]。攝食β-葡聚糖飼料56d顯著提高低鹽度養殖凡納濱對蝦生長性能、消化酶活性和存活率[3]。然而, 凡納濱對蝦連續攝食β-葡聚糖飼料36d造成免疫疲勞, 但間隔投喂β-葡聚糖飼料可以提高對蝦免疫力[15]。在本實驗中, 連續或間隔投喂β-1,3-葡聚糖84d對凡納濱對蝦生長性能和體成分沒有顯著影響, 但間隔投喂顯著提高了凡納濱對蝦的脂肪酶活性及血清膽固醇和甘油三酯水平, 表明間隔投喂β-1,3-葡聚糖促進了對蝦機體內的蛋白質和能量代謝。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)攝食實驗飼料(2周、4周投喂或間隔7d投喂β-葡聚糖)56d, 對生長性能沒有顯著影響,但間隔投喂顯著提高羅非魚免疫功能和抗Aeromo-nas hydrophila和Flavobacterium columnare感染能力。這與本實驗結果相似, 與未添加組相比, 投喂0.1% β-1,3-葡聚糖84d顯著提高了對蝦抗亞硝酸氮應激能力, 但14d間隔投喂β-1,3-葡聚糖組凡納濱對蝦的累計死亡率達到最低。

圖 2 β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦應激前后血清代謝指標的影響Fig. 2 Effects of dietary β-1,3-glucan on hemolymph variables before (time 0) and after (120h) nitrite stress in Litopenaeus vannamei

在高密度集約化養殖系統中, 隨著對蝦養殖密度的增加, 過度投喂的高蛋白殘餌和含氮排泄物不斷沉積, 導致亞硝酸鹽積累, 成為誘發疾病的主要環境脅迫因子[16]。研究表明, 亞硝酸鹽隨養殖周期延長而上升, 在凡納濱對蝦養成池塘中可能達到20 mg/L[17]。羅氏沼蝦暴露于21 mg/L亞硝酸鈉的水體120h, 死亡率50%至66.67%[18]。在本實驗中,飼料中添加β-1,3-葡聚糖能夠提高凡納濱抗亞硝酸氮應激能力, 可能與β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦的血清代謝和免疫功能的調節作用相關。亞硝酸鹽進入蝦類血淋巴, 促使氧合血藍蛋白轉化為脫氧血藍蛋白, 導致血淋巴對氧的親和性降低, 降低了機體的輸氧能力, 同時伴隨著血淋巴pH降低,對機體產生毒害作用[19]。此外還影響蝦類血淋巴中含氮廢物的排泄、血淋巴蛋白質水平、血淋巴滲透壓和離子濃度等許多方面[19,20]。血藍蛋白作為血淋巴蛋白的重要組成成分, 是甲殼動物的載氧蛋白, 具有載氧功能, 還具有酚氧化物酶活性、抗細菌和抗病毒活性和轉運金屬離子, 外界環境的變化影響血藍蛋白的合成與代謝[21]。對蝦處于應激或是饑餓、攝食不佳和蛻殼等環境中, 將消耗體內營養物質用來滿足所需“額外能量”的支出,血淋巴中蛋白水平下降可能是用作能量供給[22,23]。研究發現, β-1,3-葡聚糖在消化腺中能夠被葡聚糖酶降解產生能量[24]。在本實驗中, 亞硝酸鹽應激120h后, 0.1% β-1,3-葡聚糖連續投喂組和間隔投喂組對蝦的血淋巴蛋白水平顯著高于對照組, 血淋巴葡萄糖水平顯著低于對照組。這可能因為β-1,3-葡聚糖在消化腺中降解產生能量, 促進甘油三酯、膽固醇和葡萄糖代謝, 用于滿足應激過程中機體增加的能量需求, 從而避免了飼料蛋白質作為能量的消耗。乳酸鹽是甲殼動物在低氧或缺氧狀態下的主要厭氧產物[25]。從缺氧狀況下恢復時, 乳酸鹽水平首先得到提升, 但機體不能分泌產生乳酸鹽, 它必須通過糖質異生途徑緩慢地重新代謝。在亞硝酸氮應激120h后, 攝食葡聚糖的凡納濱對蝦血清乳酸鹽水平上升, 表明葡聚糖通過增強亞硝酸氮應激后的厭氧代謝, 進一步促進了機體的能量代謝。谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是廣泛存在于動物組織細胞線粒體內的重要氨基轉移酶, 當組織中毒發生病變,或受損傷組織范圍較大, 可引起血清中這兩種酶濃度上升或活性增強[26]。本研究結果顯示, 亞硝酸鹽應激120h后, 0.1% β-1,3-葡聚糖連續投喂組和間隔投喂組對蝦的血淋巴轉氨酶活性顯著低于對照組,表明在飼料中添加β-1,3-葡聚糖減少了亞硝酸氮應激造成的機體損傷。

圖 3 β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦應激前后肌肉免疫相關基因表達的影響Fig. 3 Effects of dietary β-1,3-glucan on expression of immunerelated genes in muscle before (time 0) and after (120h) nitrite stress in L. vannamei

β-1,3-葡聚糖通過結合甲殼動物的模式識別受體β-1,3-葡聚糖結合蛋白(BGBP)而連接到血淋巴顆粒細胞膜表面發生反應, 使顆粒細胞釋放出絲氨酸,絲氨酸繼續激活酚氧化酶原發生級聯放大反應, 使酶原變為具有活性的酚氧化酶, 反應產生大量黑色素和醌過氧化物等活性物質, 殺滅病原菌[27]。脂多糖-β-1,3-葡聚糖結合蛋白是一種多功能的模式識別受體, 能夠識別革蘭氏陰性菌的細胞壁成分脂多糖和真菌的細胞壁成分β-1,3-葡聚糖[28]。絲氨酸蛋白酶在級聯放大反應中作為重要調控因子參與免疫反應。超氧化物歧化酶是生物體抗氧化防御系統重要的酶類, 清除體內活性氧自由基, 保護細胞膜及細胞內的核酸免受氧化應激的損害。飼料中加益生菌顯著提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染的能力和上調對蝦感染副溶血弧菌后先天免疫缺陷基因、抗菌肽、酚氧化酶原和溶菌酶mRNA表達[29]。凡納濱對蝦攝食蜈蚣藻多糖飼料顯著提高肝胰腺血藍蛋白、酚氧化酶原和熱休克蛋白70基因mRNA表達量[30]。在本實驗中, 14d間隔投喂0.1% β-1,3-葡聚糖顯著上調凡納濱對蝦在亞硝酸氮應激前后的肌肉脂多糖/β-1,3-葡聚糖結合蛋白、酚氧化化酶原和超氧化物歧化酶表達, 表明β-1,3-葡聚糖通過刺激凡納濱對蝦的免疫相關基因的表達, 提高其抗亞硝酸氮應激能力。與本實驗結果相似, Soraat等研究不同投喂方式對羅非魚免疫功能和抗Aeromonas hydrophila和Flavobacterium columnare感染能力的影響, 認為β-葡聚糖間隔投喂方式是最佳施加方法。斑節對蝦攝食含褐藻酸鈉飼料能夠顯著上調LPS/β-1,3-葡聚糖結合蛋白、超氧化物歧化酶和抗菌肽 mRNA表達, 但對酚氧化酶原沒有影響[31]。在本實驗中, 在飼料中添加0.1% β-1,3-葡聚糖對凡納濱對蝦肌肉血藍蛋白和抗菌肽基因表達沒有顯著影響, 可能β-1,3-葡聚糖主要是通過作用于模式識別受體和抗氧化物酶基因發揮作用。

4 結論

在84d養殖實驗后, β-1,3-葡聚糖持續或間隔投喂對凡納濱對蝦生長性能和體成分沒有顯著影響,但顯著提高了凡納濱對蝦血清膽固醇、甘油三酯水平和降低凡納濱對蝦亞硝酸氮120h應激累計死亡率。7d或14d間隔投喂β-1,3-葡聚糖顯著提高了凡納濱對蝦脂肪酶活性, 14d間隔投喂β-1,3-葡聚糖顯著上調了凡納濱對蝦亞硝酸氮應激前后LGBP、proPO和SOD mRNA表達。飼料添加0.1% β-1,3-葡聚糖顯著提高了凡納濱對蝦亞硝酸氮應激后血清TP含量, 并顯著降低血清GLU含量、GOT和GPT活性。因此, 14d間隔投喂0.1% β-1,3-葡聚糖可能通過促進能量代謝和上調LGBP、proPO和SOD基因表達提高凡納濱對蝦抗亞硝酸氮應激能力。