不同接種濃度綠球藻對水產養殖廢水凈化的影響

呂俊平 折雨亭 劉 洋 劉旭東 馮 佳 謝樹蓮

(山西大學生命科學學院, 太原 030006)

作為農業生產的重要組成部分, 水產養殖業為世界各地人口提供了重要的食物來源。餌料投放是水產養殖最為基礎且關鍵的一個環節。然而, 餌料中只有大約9%和17%的氮磷被魚類吸收[1], 其余未被吸收的部分進入水體。此外, 魚類的排泄物也富含氮磷。因此, 在水產養殖過程中餌料的投放及魚類排泄均會向養殖水體輸入大量氮磷, 對水體造成嚴重污染[2,3]。

對于水產養殖廢水的處理, 傳統方法包括物理法和化學法。其中, 物理法對水產養殖廢水中懸浮顆粒物質(例如, 殘餌和魚類排泄物)有較佳的去除效果, 但是難以去除氮磷等溶解性污染物[4]。化學法具有較好的處理效果, 然而由于處理成本高且易對水質造成危害, 因此在水產養殖中難以大規模推廣應用[5]。

作為水生態系統中重要的初級生產者, 藻類在水環境治理方面發揮著重要作用[6]。運用微藻處理廢水, 一方面可以凈化廢水, 另一方面可獲得高附加值產品[6,7]。藻類能夠高效地去除廢水中氮磷等污染物, 同時處理工藝的建設和運行成本較低、維護簡單, 因而受到國內外學者的廣泛關注[8]。張繼平等[9]發現小球藻能顯著降低南美白對蝦養殖廢水中亞硝氮的含量。王榮霞等[10]研究了羽毛藻對石斑魚養殖廢水中氮和磷的吸收特性。顯然, 藻類處理水產養殖廢水是可行的。然而, 已有的報道更多的關注光照強度、光質和碳氮比等因子對微藻處理污水效果的影響。相比較而言, 起始接種濃度對微藻處理污水效果的影響較少被關注。

綠藻門的藻種是污水處理優質藻種的重要來源之一[11]。本課題組前期篩選獲得一株綠球藻(Chlorococcum sphacosumGD)被證實可用于市政污水和牛場污水等的處理[12]。然而, 該藻株對水產養殖廢水凈化效果如何還不清楚。因此, 本研究以該藻株為材料, 通過設置藻液的起始接種濃度, 測定藻體生長狀況和水產養殖廢水中污染物的降解情況, 為選取適宜的接種濃度和評價微藻處理水產養殖廢水的能力提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藻種來源本研究所用藻種為綠球藻(Chlorococcum sphacosumGD), 從山西省關帝山八水溝風景區落葉松林下的苔蘚中分離純化獲得[13]。BG11培養基用于該藻種的擴大培養。

水產養殖廢水水產養殖廢水取自山西省太原市魚種場。為了去除廢水中較大的懸浮顆粒物, 降低其對微藻培養的影響, 在使用之前將廢水靜置1h后取上清使用。

1.2 實驗方法

藻種預培養綠球藻接種至裝有BG11培養基的250 mL錐形瓶中, 然后置于光照培養箱中預培養。培養條件為: 光照強度3000 lx, 光暗比12h∶12h,溫度25℃, 靜置培養, 每天早中晚手動各搖動1次,使藻細胞呈均勻懸浮狀態, 至對數生長期時進行后續實驗。

藻種接種及培養取處于對數生長期的綠球藻培養液離心后(5000 r/min, 5min)接種至含有500 mL水產養殖廢水的錐形瓶中, 設置6個接種濃度梯度: 0、25、50、100、200和400 mg/L。其中,0為對照組, 25—400 mg/L為實驗組, 每個濃度梯度設置3個平行組。然后, 將錐形瓶至于搖床上培養。培養條件為: 光照強度3000 lx, 光暗比12h∶12h,溫度25℃, 搖床轉速150 r/min。在培養周期內, 每天取樣用于相關指標的測試分析。

微藻生物質濃度測定采用干重法測定微藻生物質濃度[14]。利用公式(1)和(2)分別計算微藻的比生長速率和倍增時間:

式中,T為培養時間(d),NT2、NT1為第T2天和T1天的微藻生物質濃度(mg/L),μ為微藻的比生長速率(/d),Td為倍增時間(d)。

水質參數的測定采用納氏試劑光度法(GB 7479-87)測定氨氮含量, 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-87)測定亞硝氮含量, 采用紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)測定硝氮含量, 采用鉬銻抗分光光度法(GB 11893-89)測定磷含量, 采用重鉻酸鹽法(GB 11914-89)測定COD。

葉綠素含量和葉綠素熒光參數測定參照Mera等[15]的方法測定葉綠素含量。藻液離心(4500 r/min, 15min)后棄清液, 于沉淀中加入95%乙醇并混勻。然后, 將樣品于黑暗條件下4℃放置24h, 然后離心獲得上清液(8000 r/min, 10min)。于649和665 nm波長下, 采用紫外可見光分光光度計(TU-1810 DAPC,北京普析通用儀器有限責任公司, 中國)測定上清液的吸光度值, 用95%乙醇溶液作為空白對照。利用公式(3)和(4)分別計算葉綠素a和葉綠素b含量:

參照Markou等[16]的方法測定葉綠素熒光參數。取藻液3 mL于黑暗條件下處理30min, 然后于避光條件下采用手持式葉綠素熒光測量儀(捷克,AquaPen-C AC100)獲取Fv/Fm和Fv/Fo值。

數據處理測量值采用平均值±標準誤表示(n=3)。在0.05的置信水平下, 采用SPSS 19.0進行單因素方差分析, 比較各處理組間生長指標的差異。采用SPSS 19.0中的相關性分析模塊來研究不同初始接種濃度與生長指標間的關系, 同時建立相應的回歸方程,P＜0.05時呈顯著相關。利用Origin 8.5做圖。

2 結果

2.1 不同起始接種濃度下綠球藻的生長特性

如圖 1所示, 綠球藻的生長未出現遲滯, 表明不同接種濃度下該藻株均能適應水產養殖廢水。經過5d的培養, 綠球藻各實驗組的生物質濃度分別增加至135、180、255、320和500 mg/L, 分別較初始接種時增加了1.42、1.5、1.5、1.19和1.06倍。相比于高起始接種濃度(200—400 mg/L), 較低起始接種濃度(25—100 mg/L)下綠球藻在水產養殖廢水中生物量積累速度較快。此外, 我們分析了該藻株的生長速率和倍增時間(表 1)。當起始接種濃度由25 mg/L增加至100 mg/L時, 綠球藻的比生長速率由0.087/d增加至0.1/d, 倍增時間由7.89d下降至6.84d。繼續增加接種濃度至400 mg/L后, 綠球藻的比生長速率降低至0.015/d, 倍增時間上升至44.8d。回歸分析結果顯示, 微藻的初始接種濃度與比生長速率呈顯著負相關(r=?0.927,P＜0.05, 圖 2a), 與倍增時間均呈極顯著正相關(r=0.965,P＜0.01, 圖 2b),說明隨著初始接種濃度的增加, 比生長速率降低,倍增時逐漸增加, 較低的起始接種濃度有利于綠球藻的生長。

圖 1 不同起始接種濃度下綠球藻的生長特征Fig. 1 The biomass concentration of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

表 1 不同起始接種濃度下綠球藻的比生長速率和倍增時間(平均值±標準誤, n=3)Tab. 1 The specific growth rate and doubling time of C.sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater (Mean±SEM, n=3)

2.2 不同起始接種濃度下綠球藻的污染物降解特性

在本研究中, 用于處理的魚種場來源污水中COD、氨氮、亞硝氮、硝氮和總磷濃度分別的32.4、6.25、24.65、0.35和1.83 mg/L。將不同濃度綠球藻接種于污水后, 經過3d培養, 污染物濃度均大幅度降低(圖 3)。其中, 接種濃度為100 mg/L時,污染物去除效率最高, COD、氨氮、亞硝氮、硝氮和總磷的去除率分別為88.89%、94.08%、97.44%、82.86%和 91.8%。在培養結束后(第5天), 不同接種濃度下的綠球藻對COD的去除率為87.69%—96.92%,氨氮的去除率為65.6%—98.08%, 亞硝氮的去除率為59.28%—98.67%, 硝氮的去除率為57.14%—91.42%, 總磷的去除率為78.14%—98.36%(表 2)。盡管不同接種濃度下污染物濃度均呈下降趨勢, 但是污染物最終去除效率對起始接種濃度呈現出不同的響應。起始接種濃度為100 mg/L時, 綠球藻對水產養殖廢水中COD、氨氮、亞硝氮、硝氮和總磷的去除效果要顯著優于其他接種濃度下綠球藻的去除效果(P＜0.05, 表 2)。

2.3 不同起始接種濃度對綠球藻的葉綠素含量及葉綠素熒光特征的影響

如圖 4所示, 在培養周期結束后, 綠球藻的葉綠素a濃度分別從0.48、0.98、1.98、3.75和6.28 mg/L增加至1.13、2.31、2.63、4.2和7.59 mg/L。葉綠素b濃度在培養結束時上升至0.26、0.7、0.88、1.59和3.17 mg/L。顯然, 綠球藻細胞葉綠素含量隨著接種濃度的增加而逐漸升高。

此外, 我們也分析了這葉綠素熒光參數對起始接種生物質濃度的響應。如圖 5所示, 在所有接種濃度下, 綠球藻的葉綠素熒光活性較好。經過5d的培養, 綠球藻各實驗組的Fv/Fm值維持在0.53—0.78,較初始接種時輕微的增長。而且, 在本研究的接種濃度范圍內, 高接種濃度下綠球藻的葉綠素熒光活性較好。Fv/Fo的變化趨勢類似于Fv/Fm。

圖 2 綠球藻的接種濃度與生長特性的相關分析Fig. 2 The regression analysis between initial inoculation concentration and growth characteristics of C. sphacosum GD

3 討論

通過培養微藻的方式處理廢水是水產養殖廢水處理的一種可供選擇的方案。前人的一些研究工作發現微藻處理養殖廢水時展現出了優秀的性能[17,18]。在本研究中, 不論綠球藻的起始接種濃度如何變化, 綠球藻的生長均未出現遲滯, 表明該藻株能夠適應水產養殖廢水, 具有良好的生長狀況。盡管如此, 當起始接種濃度為25—100 mg/L時, 綠球藻的比生長速率為0.087—0.1/d。然而, 起始接種濃度上升至400 mg/L后, 比生長速率降低至0.015/d。Guerrero-Cabrera等[19]的研究發現, 小球藻、柵藻和單針藻在羅非魚養殖廢水中的比生長速率為0.006—0.018/d, 其低于本研究中低接種濃度下綠球藻的比生長速率, 但是和高接種濃度下綠球藻的比生長速率處于同一水平。王偉偉等[20]的研究發現, 湛江等邊金藻在水產養殖廢水中的比生長速率達到0.235/d, 其顯著高于本研究中所有接種濃度下綠球藻的比生長速率。上述這些差異可能源自于藻種及培養條件等的不同[19,20]。更為重要的是, 我們的研究結果表明, 起始接種濃度影響了綠球藻的生長。Pelizer等[21]研究發現, 以低接種濃度(50 mg/L)培養螺旋藻時其生長速度最快。Nasir等[22]的研究表明, 相較于40%、50%和60%的起始接種濃度, 以10%、20%和30%的起始接種量培養的小球藻具有更高的生長潛力。顯然, 本實驗的研究結果與前人的研究結果基本一致。由于本研究采用批次模式培養綠球藻, 因此在一個培養周期內廢水中的營養物是有限的。當微藻起始接種濃度超過一定的閾值后, 由于藻濃度過高導致藻細胞之間潛在的營養競爭加劇, 這可能是高接種濃度抑制微藻異養生長的一個重要原因[23]。為了使綠球藻在養殖廢水中達到一個較好的生長狀態, 在本研究的培養條件下,建議以低起始接種濃度(100 mg/L)接種綠球藻用于該藻株的培養。

圖 3 不同接種濃度下綠球藻去除污染物的特征Fig. 3 Pollutants removal of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

表 2 不同接種濃度對綠球藻去除污染物效率的影響(平均值±標準誤, n=3)Tab. 2 The performance on pollutants removal efficiency of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations(Mean±SEM, n=3)

圖 4 不同起始接種濃度下綠球藻的葉綠素含量Fig. 4 Chlorophyll concentration of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

圖 5 不同起始接種濃度下綠球藻的葉綠素熒光特征測定Fig. 5 Chlorophyll fluorescence characteristics of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

微藻處理水產養殖污水的效率是本研究的一個重要關注點。有關微藻處理水產養殖廢水的相關研究已有報道。陳春云等[24]的研究結果顯示, 小球藻能夠去除對蝦養殖廢水中80%的氨氮和85%的磷。栗越妍等[25]選用蛋白核小球藻、斜生柵藻、月牙藻和螺旋魚腥藻處理羅非魚養殖廢水。這些藻種能夠去除廢水中30.2%—60.9%的氮和22.7%—76.1%的磷。許云等[26]選用雙眉藻和等鞭金藻處理幼蝦養殖廢水, 其對廢水中總磷的去除率為30.9%和70.9%, 對硝氮的去除率為72%和85.7%。馬紅芳等[27]的報道稱, 柵藻能夠去除養魚場換排廢水中85.8%的硝氮、96.3%的亞硝氮、95.5%的氨氮和98.8%的磷。在本研究培養結束后, 不同接種濃度下的綠球藻對 COD的去除率為87.69%—96.92%,氨氮的去除率為65.6%—98.08%, 亞硝氮的去除率為59.28%—98.67%, 硝氮的去除率為57.14%—91.42%, 總磷的去除率為78.14%—98.36%。很明顯, 綠球藻處理水產養殖廢水的效率持平甚至優于前人報道中相關藻種處理水產養殖廢水的效率, 表明本研究所選用的藻種可以作為一個具有潛力的藻種可用于水產養殖廢水的處理。此外, 本研究發現起始接種濃度為100 mg/L時, 綠球藻對水產養殖廢水中污染物的去除效果要優于其他接種濃度下綠球藻的處理效果。考慮到該接種濃度下綠球藻生長良好, 大量污染物被該藻種同化后用于生物質的積累。一般而言, 由于微藻生長速度緩慢, 需要保持較長的水力停留時間(大于10d)以降解養殖廢水中的大部分污染物[18,28]。在本研究中, 通過控制接種初始濃度, 在提高污染物去除率的同時縮短培養周期并提高了容積負荷, 這對于今后微藻用于大規模水產養殖廢水的處理是有益的。在本研究中,當綠球藻接種濃度為25—50 mg/L時, 該藻株的生長速率與100 mg/L接種濃度下該藻株的生長速率基本一致。盡管如此, 過低的接種濃度使得參與污水處理過程的藻細胞基數低, 從而使其去除污染物的效率低于100 mg/L接種濃度下該藻株去除污染物的效率。基于上述討論, 為了使綠球藻高效去除污染物, 在本研究的培養條件下, 建議以低起始接種濃度(100 mg/L)接種綠球藻用于水產養殖廢水的處理。

在微藻處理廢水過程中, 葉綠素含量和熒光參數特征能在一定程度上反映微藻細胞的生理活性狀況[29]。在本研究中, 在不同起始接種濃度下, 培養周期結束后, 綠球藻的葉綠素含量均顯著增長,而且葉綠素熒光參數值也保持在較高的水平。Fv/Fo與Fv/Fm分別反映了光系統 Ⅱ的潛在活性和原初光能轉化效率[30]。因此, 在綠球藻處理水產養殖廢水的過程中, 藻細胞具有良好的生理活性, 這也從一個側面證明了該藻種可用于水產養殖廢水的處理。

4 結論

微藻起始接種生物質濃度是影響綠球藻生長及水產養殖廢水處理效率的一個重要因子。在本研究的培養條件下, 隨著綠球藻初始接種濃度的上升, 其生長能力及污染物去除效率均有所降低。以低起始接種濃度(100 mg/L)接種綠球藻至水產養殖廢水中, 在5d的培養周期內, 其能夠高效去除廢水中的COD、氨氮、亞硝氮、硝氮及總磷等污染物。控制微藻接種濃度在提高污染物去除率的同時縮短培養周期并提高了容積負荷, 這對于今后微藻用于大規模水產養殖廢水的處理非常有益。