擬赤梢魚的胚胎發育和仔稚魚生長特性觀察

楊 建 耿龍武 王 雨, 張宇婷, 張 穎 馬 波 李晨宇 徐 偉

(1. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所, 哈爾濱 150070; 2. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306)

擬赤梢魚(Pseudaspius leptocephalus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、雅羅魚亞科(Leuciscinae)、擬赤梢屬(Pseudapius), 為該屬唯一種喜冷水習性廣溫性魚類, 在我國主要分布于黑龍江、烏蘇里江和松花江及附屬水域[1], 其肉質細膩, 味道鮮美, 是當地土著名優魚類“三花五羅”中的“鴨羅”, 具有非常重要的經濟和研究價值。近年來, 由于人為過度捕撈和生存環境的破壞, 其野生種群數量持續下降, 在松花江和嫩江水域已非常罕見, 現僅在黑龍江上游和烏蘇里江中下游有少量分布, 亟需開展擬赤梢魚的保護性研究。

2015年至今, 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所團隊初步完成了中國境內黑龍江和烏蘇里江水域擬赤梢魚的野生資源調查, 成功實現了擬赤梢魚的人工催產、苗種馴化和池塘培育技術研究。目前, 關于擬赤梢魚的研究僅在人工繁殖[2]、肌肉營養成分[3]、消化系統的結構[4]和酶活力[5]等方面有少量報道, 對擬赤梢魚的繁殖生物學和發育生物學等方面系統性研究方面尚不深入。因此, 開展擬赤梢魚繁殖相關研究工作, 掌握其繁殖生物學特性, 對開展其種質資源保護具有重要意義。2019年,本團隊開始擬赤梢魚的全人工繁殖技術研究并獲得成功; 期間, 開展了胚胎發育和胚后生長階段仔稚魚形態學的指標的測量與分析, 初步揭示了該魚胚胎發育和仔稚魚生長的基本規律, 以期為建立擬赤梢魚苗種培育技術和揭示早期生長規律提供資料支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源與人工催產

2015年6月對采集于烏蘇里江通江口江段的野生擬赤梢魚進行人工繁殖試驗, 獲得的F1代在黑龍江水產研究所呼蘭實驗站池塘培育至4+齡, 隨機選擇健康和成熟度好的雄魚4尾, 雌魚8尾, 親魚體長(26.86±0.85) cm、體重(194.03±18.27) g。擬赤梢魚雌雄親魚大小及外觀差別不大, 雄魚生殖孔有較小生殖突, 繁殖季節輕壓有乳白色精液流出; 雌魚生殖孔呈圓形, 繁殖季節腹部圓潤、飽滿。2019年6月, 水溫達20℃, 通過注射促黃體素釋放激素類似物LRH-A2、絨毛膜促性腺激素HCG和地歐酮DOM進行人工催產, 并成功催產雌魚6尾, 雄魚4尾,采用干法人工授精方式。

1.2 胚胎發育觀察

隨機選取50粒受精卵置于直徑13.5 cm, 深8.5 cm的圓形孵化盒中, 共10盒, 在溫度為23℃的恒溫孵化箱中孵化, 每隔4h換水1次。合子期至囊胚期, 每隔15min對同一批受精卵連續取樣、觀察并拍照記錄; 囊胚期后, 每隔30min采樣、觀察1次。每次隨機選擇3盒取樣觀察, 每盒10枚受精卵。胚胎發育各發育時期以每次鏡檢50%以上受精卵達到該發育節點為準, 胚胎發育分期方法參考硬骨魚類胚胎發育分期標準[6]。胚胎發育的觀察與圖片采集采用Olympus顯微成像系統。

胚胎發育各階段積溫按以下公式計算:K=N×T(K為積溫, h·℃;N為發育至某一階段所經歷的時間, h;T為該發育階段的平均溫度,℃)[7]。擬赤梢魚整個胚胎發育階段所需的積溫為個發育階段積溫之和(表 1)。

1.3 胚后發育形態學觀察與數據采集

仔魚破膜后轉移至循環水養殖系統中, 養殖容器規格有兩種, 1號缸長/寬/高規格為28 cm×15 cm×19 cm, 供出膜25d以內幼魚使用, 2號缸長寬高分別為43 cm×29 cm×29 cm, 供出膜25d以后幼魚使用。仔魚開口至40d, 投喂豐年蟲成體。養殖密度控制:25d以內, 300尾/缸; 25—40d, 150尾/缸。水溫(23±1)℃, 光周期10L∶14D。每天清理1次殘餌糞便,1周更換循環系統1/3水體, 以保證水質清新。

測量仔魚形態學數據: 每天采樣觀察1次, 每次30尾。用MS-222麻醉后, 解剖鏡下觀察仔魚形態,拍照記錄, 并測量魚體全長、頭長、體高、卵黃囊長徑和短徑等指標。卵黃囊體積(V)參照Alderdic等[8]的方法計算:V=(R·r2·π)/6, 式中R為長徑,r為短徑。

1.4 圖片處理與數據分析

胚胎發育及仔稚魚圖片采用Photoshop CS6軟件編輯, 測量數據分析采用單因素方差分析, 數據以平均值±標準差(± SD)表示。

表 1 擬赤梢魚胚胎發育各階段積溫Tab. 1 Temperatures of Pseudaspius leptocephalus at different stages of embryonic development

2 結果

2.1 胚胎發育

擬赤梢魚卵呈圓球形, 遇水具有微黏性, 成熟卵粒呈黃色, 平均卵徑為(1.77±0.20) mm。在水溫23℃下, 歷時47h55min完成整個胚胎發育過程, 各發育時期的形態特征見圖版Ⅰ。擬赤梢魚胚胎發育時序與大部分硬骨魚類相同, 主要分為合子期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、器官形成期和孵化出膜期7個階段(表 2和圖版Ⅰ)。在23℃水溫條件下, 完成整個胚胎發育所需的積溫為1102.09 h·℃。

合子期(0—1h)受精完成至第一次卵裂發生的階段, 持續時間約1h。受精卵吸水膨脹后平均卵徑為(4.45±0.05) mm, 膨脹率平均為253.37%。受精10min后, 卵膜膨脹, 同時胞質活動激活, 非卵黃細胞質向動物極流動, 促使胚盤與卵黃分離, 胚盤隆起呈帽狀, 顏色較深(圖版Ⅰ-1、2)。

卵裂期(1h—3h15min)在受精1h后, 卵裂開始, 為部分分裂方式, 胚盤底部不完全分開。這一階段, 經歷6次以上特定方向的卵裂, 細胞數目逐漸增多, 體積越來越小, 胚盤細胞層數增多而逐漸隆起, 但細胞界限仍可分辨(圖版Ⅰ-3—9)。

囊胚期(3h15min—6h17min)細胞分裂繼續, 細胞界限開始模糊, 形成的多細胞層隆起于卵黃之上, 形如帽狀, 為囊胚早期標志; 隨后外包開始, 胚盤細胞逐漸變薄, 外周細胞與卵黃囊交界平滑, 界限不明, 為囊胚中期; 胚層細胞下包至1/3之前, 為囊胚晚期(圖版I- 10—12)。

原腸胚期(6h17min—13h43min)外包運動繼續, 伴隨胚盤細胞層邢臺的內卷和延伸, 產生原始胚層和胚軸。外包進行至卵黃約1/3處時, 即進入原腸胚階段; 胚層下包至1/2處, 胚盤邊緣形成一層厚的環帶, 即為胚環, 胚環一側形成三角形加厚隆起, 為胚盾, 此期為原腸中期; 原腸晚期, 胚層下包至3/4處時, 胚體逐漸形成(圖版Ⅰ- 13—15)。

神經胚期(13h43min—16h9min)胚層下包至4/5, 即進入神經胚期, 其標志為胚環變小, 外胚層分化形成神經板, 胚層植物極未包入部分卵黃囊形成卵黃栓(圖版Ⅰ-16); 隨著外包的繼續, 卵黃被完全包裹, 胚孔封閉(圖版Ⅰ-17)。

器官形成期(16h9min—44h)亦稱為體節期, 胚孔封閉后即進入器官形成期。受精17h, 胚體頭部、尾部隆起且區別明顯, 軀干部有體節形成(圖版Ⅰ-18); 頭部腦泡、眼囊和耳囊等依次形成(圖版Ⅰ-19—21); 胚體后端腹面尾芽脫離卵黃, 表皮外有一層突出的皮褶, 成為尾鰭褶皺(圖版Ⅰ-21—24), 尾鰭逐漸形成; 受精37h9min后, 胚體開始不規則扭動, 隨后胚體出現卵圓形圍心腔, 腔內有細胞團, 為心臟原基(圖版Ⅰ-23); 受精44h, 心臟開始緩慢而有節奏的跳動, 胚體在膜內的轉動頻率也逐步加快(圖版Ⅰ-24)。

孵化期(44h—47h55min)受精46h23min后,尾鰭繼續增長, 鰭褶變寬, 卵膜逐漸變薄, 胚體扭動劇烈(圖版Ⅰ-25); 隨后卵膜開始溶解破裂, 絕大部分為尾部先出膜, 少部分頭部先出膜, 出膜仔魚無色素, 透明卵黃囊在魚體下方, 仔魚鰭發育不完全, 只能夠間歇性垂直游動, 此時期為出膜期(圖版Ⅰ-26)。

表 2 擬赤梢魚胚胎發育時序及主要特征(水溫23℃)Tab. 2 Embryonic development of Pseudaspius leptocephalus (water temperature of 23℃)

2.2 仔稚魚生長發育特征

卵黃囊期仔魚(0—7d)(1)初孵仔魚: 剛出膜仔魚, 胚體透明呈彎曲狀, 卵黃囊呈長梨狀, 數個油球散布其中; 心臟位于卵黃囊前端, 血液循環可見, 血細胞呈微紅色, 體表未出現黑色素; (2)1d: 頭部略彎曲, 卵黃囊呈長柱型, 眼球顏色加深, 仔魚沉于水底, 無游泳能力, 僅作間歇性上浮游動(圖版Ⅱ-1); (3)2d: 頭部與軀體平直, 卵黃囊減小, 眼球顏色進一步加深, 胸鰭原基形成(圖版Ⅱ-2); (4)3d: 眼球完全變為黑色, 卵黃囊進一步減小, 肛門原基形成,仔魚頭部、背部、側線附近和卵黃囊后部軀體下部均有黑色素斑點出現(圖版Ⅱ-3); (5)4d: 全身黑色素斑點進一步增多, 并在軀體背部上緣、腹面下緣與卵黃囊連接部和側線呈線性分布, 尾鰭開始分化(圖版Ⅱ-4); (6)5d: 卵黃囊體積明顯減小, 頭部黑色素聚集形成斑塊, 鰾充氣, 尾鰭鰭條骨數目1—2條(圖版Ⅱ-5); (7)6d: 卵黃囊呈細條狀, 消化道逐步貫通, 尾鰭鰭條數目3—5條, 尾鰭表面出現黑色素斑點, 仔魚開始緩慢平游(圖版Ⅱ-6); (8)7d: 腹部出現黃色反光質, 尾椎開始向上彎曲, 尾鰭鰭條數目10—12條(圖版Ⅱ-7)。

晚期仔魚(8—26d)(1)8d: 卵黃囊完全消失,仔魚開口攝食, 腸道內食物可見, 尾鰭鰭條數目12—14條(圖版Ⅱ-8); (2)9d: 仔魚背鰭和臀鰭開始分化, 仔魚游泳能力增強(圖版Ⅱ-9); (3)11d: 背鰭、臀鰭鰭條骨開始形成, 尾鰭出現分叉, 仔魚腹部表面開始出現黑色素斑塊, 尾椎向上彎曲明顯(圖版Ⅱ-10); (4)14d: 腹鰭原基出現, 背鰭和臀鰭開始有黑色素斑點分布(圖版Ⅱ-11); (5)18d: 腹鰭形成(圖版Ⅱ-12); (6)24d: 黑色素斑點在側線以上背部呈散點狀分布(圖版Ⅱ-13); (7)26d: 背部黑色素斑點增多, 皮膚仍為透明, 肌肉紋理可見(圖版Ⅱ-14)。

稚魚期(27—34d)(1)27d: 側線附近及以下腹部開始出現散點分布的白色鱗片(圖版Ⅱ-15);(2)29d: 白色鱗片增多, 腹部區域逐漸連接成片(圖版Ⅱ-16); (3)34d: 鱗片已完全覆蓋側線周邊及整個腹部區域, 背部黑色素斑點不再增多, 魚體形態已基本與成魚無異(圖版Ⅱ-17)。

2.3 仔魚生長特性

自破膜后0—7d, 擬赤梢魚仔魚發育的營養來源主要為卵黃囊; 至8d卵黃囊被吸收殆盡后仔魚開口并完全依賴攝食外源營養; 期間, 卵黃囊體積變化與仔魚日齡的關系符合以下公式:V=0.006x2–0.1628x+0.8675 (R2=0.9483), 其中V代表卵黃囊體積,x為日齡。由圖 1可以看出, 出膜1d后, 卵黃囊消耗速度較慢, 3—6d, 卵黃囊消耗迅速, 表明初孵仔魚在此期間新陳代謝最為旺盛。

經回歸分析(圖 2A)發現, 擬赤梢魚仔稚魚階段(0—40d)的全長生長特性規律符合公式:TL=0.0125x2+0.3579x+6.2058 (R2=0.9953), 其中TL為全長,x為日齡。此外, 由圖 2和表 3可知, 擬赤梢魚仔魚的體長、體高和頭長均隨日齡的增長而變長和變高; 其中, 體高和頭長在仔稚魚發育過程中表現出明顯的異速生長現象。仔魚在15d前生長速度較為緩慢,日生長速率為(0.38±0.02) mm/d, 頭長和體高也增長緩慢; 15d后, 仔魚生長速度相對變快, 日生長速度達(1.24±0.09) mm/d, 體高和頭長亦增長迅速(表 3)。

圖 1 擬赤梢魚卵黃囊吸收曲線Fig. 1 Yolk sac absorption curve of Pseudaspius leptocephalus

表 3 擬赤梢魚仔稚魚發育過程形態學數據Tab. 3 Morphological measurement of larval development Pseudaspius leptocephalus

3 討論

3.1 擬赤梢魚胚胎發育

擬赤梢魚的胚胎發育特征與大多數硬骨魚類相同, 基本遵循“卵裂-胚體形成-器官分化-孵化出膜”的順序。本研究根據擬赤梢魚胚胎發育過程形態特征發生的時間順序則將其劃分為合子期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、器官形成期和孵化出膜期7個階段26個時期。對比雅羅魚亞科不同屬魚類發現起胚胎發育分期的劃分仍存在較大爭議, 例如劉筠[9]則將草魚(Ctenopharyngodon idellus)的胚胎發育分期劃分為6個階段32個時期,任麗珍等[10]則將長江鳡(Elopichthys bambusa)的胚胎發育劃分為7個階段25個時期; 此外, 對比擬赤梢魚相同棲息水域的魚類亦發現其胚胎發育時期的劃分亦存在較大分歧, 例如張永泉等[11]將哲羅鮭(Hucho taimen)的胚胎發育劃分為6個階段26個時期, 姜海峰等[12]則將蒙古鲌(Erythroculter mongolicus)的胚胎發育劃分為6個階段21個時期。基于此種結果, 作者推測魚類的胚胎發育過程是由遺傳信息和外界環境共同調控的, 因此親緣關系相近的魚類可能因棲息環境不同, 其胚胎發育存在較大差異; 而相同棲息環境下的魚類亦可能因遺傳信息差異較大而胚胎發育過程存在一定差異。

對比雅羅魚亞科其他屬硬骨魚類和相同棲息水域的其他硬骨魚類的胚胎發育過程, 擬赤梢魚胚胎發育亦有其自身特點: (1)擬赤梢魚的受精卵為端黃卵, 卵黃含量大, 具微黏性, 比重稍大于水; (2)未吸水膨脹前, 擬赤梢魚受精卵卵徑為(1.77±0.20) mm,大于貝加爾雅羅魚(Leuciscus leuciscus baicalensis)的(0.8—1.2) mm[13], 小于鳡的(3.5—4.0) mm[10]和哲羅鮭的(5.06±1.3) mm[11]; (3)擬赤梢魚整個胚胎發育階段需有效積溫為1102.09h·℃, 高于鳡的705.34h·℃[14],低于哲羅鮭的6274h·70h·℃[15]; (4)擬赤梢魚器官發育時間較長, 胸鰭、眼囊耳囊和心臟器官在破膜時已具備基本形態結構; (5)不同于哲羅鮭[11]和貝加爾雅羅魚[13]眼色素在胚胎發育期間就已形成, 擬赤梢魚與鳡[10]相同, 眼色素為破膜后形成; (6)擬赤梢魚仔魚絕大部分為尾部先出膜, 少數個體頭部先出膜,其破膜速度與孵化水溫和仔魚活力有關, 水溫越高,仔魚活力越好, 出膜速度越快。

圖 2 擬赤梢魚早期生長曲線Fig. 2 The early growth curve of Pseudaspius leptocephalus

3.2 擬赤梢魚仔稚魚發育

根據Kendall等[16]和殷名稱[17]對魚類早期發育劃分標準, 將擬赤梢魚仔稚魚發育階段劃分為卵黃囊期仔魚、晚期仔魚和稚魚期3個階段。卵黃囊期仔魚活動能力弱, 消化系統發育不完全, 無法攝取外源營養物質, 卵黃囊的內源性營養是維持此期仔魚生命活動的唯一營養來源。作為喜冷水廣溫性魚類的擬赤梢魚仔魚卵黃囊在出膜8d后消耗殆盡; 相比而言, 溫水性魚類蒙古鲌[12]和鳡[14]的卵黃囊消耗需4—5d; 而冷水性魚類哲羅鮭卵黃囊消耗則需27d才消耗完畢[11]; 這一差異主要與其溫度適應性和洄游習性有關, 以保證子代獲得最大的存活率。

此外, Kendall等[16]根據仔魚發育期間尾椎的彎曲變化, 將晚期仔魚進一步劃分為彎曲前期、彎曲期和彎曲后期; 而在本研究中, 仔魚尾椎出現彎曲時, 卵黃囊尚未吸收完畢; 因此, 如按其劃分標準,卵黃囊期仔魚和晚期仔魚在發育時序劃分中存在重疊部分; 針對這一情況, 本研究認為此劃分標準并不能適用于所有魚類。

3.3 擬赤梢魚仔稚魚生長特性

本研究發現, 擬赤梢魚的仔稚魚發育呈現早期生長速度慢, 后期生長速度快的現象, 出膜15d前仔魚的全長增長速率為(0.38±0.02) mm/d, 開口攝食鹵蟲后(15—40d)的增長速率則達(1.24±0.09) mm/d,這與其他魚類的異速生長模式相一致[18—21]。擬赤梢魚仔魚的這種異速生長特點, 可能與早期仔魚發育主要由卵黃囊提供營養, 營養較單一, 而仔魚開口初期, 消化系統發育不完善, 攝食能力差, 是仔魚發育初期生長速度慢的主要原因; 隨著消化系統發育的完善, 仔魚攝食能力增強, 外源性營養豐富且多樣, 仔魚的生長速度得到極大提升, 推測擬赤梢魚的這一異速生長策略主要與早期生長發育的生物習性相適應, 是一種提高仔魚存活率的生存策略。

圖版Ⅰ 擬赤梢魚胚胎發育時序PlateⅠ Embryonic development of Pseudaspius leptocephalus

圖版Ⅱ 擬赤梢魚仔稚魚發育時序PlateⅡ Larva development of Pseudaspius leptocephalus