抑制Polo樣激酶1表達靶向DNA錯配修復相關通路并抑制卵巢癌的相關研究*

李 娟，何 苗，袁春蘭，李紅梅，鄧小梅，肖 雪

（四川省醫學科學院，四川省人民醫院機器人微創中心，四川成都610072）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是最致命的婦科惡性腫瘤，其高死亡率歸因于發現晚、耐藥和缺乏靶向治療［1］。雖然患者最初對常規化療敏感，但大多數患者在12～24個月內復發，最終死于該病。因此，迫切需要識別OC的潛在預后標志物和開發新的治療策略來提高臨床療效。錯配修復（mismatch repair，MMR）是一種進化上保守的機制，可以糾正DNA復制或損傷過程中產生的突變，在維持基因組穩定性方面起著至關重要的作用［2］。在OC中，MMR缺陷（MMR deficiency，dMMR）是繼BRCA1和BRCA2突變后遺傳性OC的最常見原因［3］。Polo樣激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的一員，它在細胞分裂的不同階段連接到有絲分裂紡錘體上，從而穩定著絲粒-微管的附著，并觸發G2-M相變［4］。PLK1在多種腫癌中過度表達，如非小細胞肺癌、乳腺癌和黑色素瘤，并與腫瘤進展和預后不良相關，使得PLK1成為抗腫瘤治療的一個有希望的靶點［5］。最近研究顯示，PLK1抑制劑通過調節DNA修復蛋白增強非小細胞肺癌的放射增敏作用［6-7］，表明PLK1在腫瘤MMR中起著潛在的調控作用。然而，關于PLK1在OC相關MMR中的分子機制還需要進一步研究。在本研究中，我們分析了PLK1在OC細胞和組織中的表達及與臨床病理特征的關系，并探討PLK1抑制對耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）OC細胞活力和凋亡的影響，及其作用機制是否與MMR有關。

材料和方法

1 患者和標本

在2011年4月～2018年12月期間，126名OC患者納入本研究。所有患者術前均出現高水平的糖類抗原125，術前未進行化療或放療。匹配的鄰近正常卵巢組織距離腫瘤＞2 cm。收集患者的臨床病理特征，包括年齡、腫瘤類型、絕經期、FIGO分期和腫瘤分級。術后隨訪記錄總生存時間，中位隨訪時間為39.7個月。使用針對MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的抗體進行免疫組化，缺乏一個或多個這些蛋白的表達診斷為dMMR。本研究經本院倫理委員會批準同意，研究前從每位參與者獲得書面知情同意書。

2 方法

2.1 臨床病理學研究采用免疫組化法檢測PLK1在OC組織及鄰近正常卵巢組織中的表達水平。組織切片經加熱、脫石蠟、復水、過氧化氫浸泡，抑制內源性過氧化物酶活性。在100℃下使用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復5 min。然后，用兔多克隆PLK1抗體（Abcam）（稀釋1∶200）在4℃下孵育過夜。用PBS清洗切片，并在37℃下與生物素標記的Ⅱ級抗一起孵育30 min。最后，切片用二氨基聯苯胺（DAB）和蘇木精染色染色。免疫組化法評分由兩名病理學家根據染色強度和陽性細胞百分比獨立分析。染色強度分別為0（陰性）、1（陽性1+）、2（陽性2+）、3（陽性3+）。細胞百分比分別為1（1%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）和4（76%～100%）。染色強度得分乘以陽性細胞百分率（0～12）計算最終染色得分。評分≥6分為PLK1高表達，評分＜6分為PLK1低表達。

2.2 細胞系與細胞培養人OC細胞系（OVCAR3、SKOV3、ES2和MCAS）、正常卵巢上皮細胞株HOSEPIC及293T細胞均取自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。所有細胞系均在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；GIBCO）、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素（GIBCO）的RPMI-1640培養液中培養。OVCAR3和SKOV3細胞系均通過5-FU的逐步遞增處理，形成耐5-FU的OC細胞系（OVCAR3-5FUres和SKOV3-FUres）。5-FU（Sigma-Aldrich）溶解于二甲基亞砜（Sigma-Aldrich）中，并在實驗前儲存在避光的密閉容器中。將親代細胞系OVCAR3和SKOV3暴露于5-FU濃度逐漸增加（1～100μmol/L）的環境中。將5-FU（1μmol/L）加入OVCAR3-5FUres和SKOV3-FUres的培養液中，以維持耐藥性。實驗前至少2周將細胞保存在無5-FU的培養液中。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）將PLK1重組質粒（Addgene）、PLK1-shRNA慢病毒（sh-PLK1，上海吉瑪基因有限公司）轉染到OVCAR3、SKOV3、OVCAR3-5FUres和SKOV3-5FUres細胞中。

2.3 細胞活力檢測采用CCK-8（Dojindo）測量細胞活力。為了分析PLK1對5-FU治療的影響，分別將轉染PLK1重組質粒、sh-PLK1或陰性對照的細胞用0、2、4、8、16、32、64和128μmol/L 5-FU處理48 h。將CCK-8溶液添加到培養液中，并在37℃和5%CO2下培養1小時。使用微板閱讀器（Thermo Fisher）獲得樣品在450 nm處吸光度（A）值。

2.4 建立穩定表達PLK1的細胞將S-FLAG-streptavidin-binding protein（SFB）三重標記的PLK1表達載體轉染293T細胞，在含2 mg/L嘌呤霉素的培養液中培養7 d。然后選擇對嘌呤霉素有抗性的無性系進行擴增。Western blot證實SFB-PLK1的表達。

2.5 串聯親和純化收集50個10 cm2培養皿中穩定表達SFB標記的PLK1的293T細胞，用NETN300緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，300 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，0.5%Nonidet P-40）在冰上裂解20 min。用等量的ddH2O稀釋上清液，用鏈霉親和素偶聯珠在4℃孵育2 h。用飽和生物素（Sigma）在NETN100緩沖液中洗脫30 min。洗脫液與s蛋白瓊脂糖珠（Millipore）在4℃下孵育2 h，用NETN100緩沖液洗滌3次。與s蛋白瓊脂糖珠結合的蛋白用SDS上樣緩沖液洗脫，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。切除整個蛋白條帶（小于1 cm）并上質譜分析。

2.6 質譜分析將凝膠條帶切成1 mm×1 mm×1 mm的小片，凝膠用胰酶消化過夜。用乙腈提取肽段，真空干燥。樣品在高效液相色譜溶劑A（2.5%乙腈和0.1%甲酸）中溶解后，裝載到Proxeon EASYnLCII液相色譜泵（Thermo Fisher）上。通過增加流動相A的濃度（97.5%乙腈，0.1%甲酸），在30 min內用乙腈梯度（6%～30%）洗脫樣品。洗脫后直接通過Orbitrap Elite MS（Thermo Fisher）檢測。通過串聯質譜對每個肽產生的特定片段離子進行檢測、分離和碎片化。使用SEQUEST將蛋白質數據庫與獲得的片段模式匹配，對質譜進行分析。對半胱氨酸的羧基氨基甲基修飾和蛋氨酸殘基的氧化修飾分別為靜態修飾和可變修飾。構建目標-誘餌庫篩選出的肽段的假發現率（false discovery rate，FDR）＜1%。

2.7 免疫共沉淀和Western blot法收集細胞，用NETN300緩沖液在冰上裂解10 min。用相同體積的ddH2O稀釋上清液，并在4℃下用鏈霉親和素結合珠、2μg指示抗體和40μL蛋白A瓊脂糖微球孵育2 h。結合蛋白用SDS負載緩沖液洗脫，經SDS-PAGE分離。所有Western blot實驗均按標準程序進行。使用的主要抗體有：人MutS蛋白同系物2（human mutShomolog 2，hMSH2；Abcam）、PLK1和GAPDH（Sigma）。

2.8 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測在細胞凋亡檢測中，將穩定轉染PLK1抑制劑、陰性對照或hMSH2 siRNA的OVCAR3-5FUres細胞置于10 cm培養皿中，用5-FU（10μmol/L）處理48 h。然后將細胞胰蛋白酶化并收集到離心管中，以800×g離心3 min，用冷PBS洗滌2次。采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）檢測細胞凋亡。處理后取細胞，用冷PBS沖洗。將1×105個細胞重新懸浮在100μL 1×結合緩沖液中，然后添加5μL Annexin V-FITC和1 μL PI工作液。室溫孵育15 min后，加入400μL膜聯蛋白結合緩沖液并混合，然后使用FACSCalibur流式細胞儀（BDBiosciences）測量細胞凋亡率。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0進行統計分析。連續變量表示為均數±標準差（mean±SD），分類變量表示為頻率。雙尾Studentt檢驗確定體外實驗中各組間的顯著性。采用χ2檢驗分析PLK1與臨床病理特征的關系。用Kaplan-Meier法計算生存率和對數秩檢驗生存曲線之間的差異。采用Spearman秩相關分析評價OVCAR3、SKOV3、OVCAR3-5FUres和SKOV3-5FUres細胞中PLK1表達與IC50的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PLK1在OC中高表達及其與臨床病理特征的關系

與HOSEP1C細胞相比，在OC細胞系中，PLK1水平顯著上調（P＜0.01），見圖1A。在大多數OC組織中，PLK1表達較癌旁組織顯著上調（P＜0.05），見圖1B。圖1C顯示了免疫組化分析PLK1在OC組織中低表達和高表達的典型圖片。Kaplan-Meier分析顯示，PLK1高表達OC患者的平均存活時間顯著低于PLK1低表達OC患者（P＜0.01），見圖1D。OC中PLK1水平的升高與FIGO分期、腫瘤分級、dMMR等臨床病理特征顯著正相關（P＜0.05），見表1。

2 PLK1在5-FU耐藥OC細胞系中上調，并降低對5-FU的敏感性

Figure 1.The expression of PLK1 is up-regulated in OCcells and tissues，which is related to the overall survival rate of OCpatients.A：Western blot was used to detect PLK1 protein expression in human OC cell lines（ES2，SKOV3，MCAS，OVCAR3）and normal ovarian epithelial cell line HOSEPIC（n=3）.B：Western blot was used to detect the expression of PLK1 in OC tissue and paracancerous tissue.T：tumor tissue；N：paracancerous tissue；P：paired tissue（n=5）.C：the typical pictures of low and high expression of PLK1 in OCtissues were analyzed by immunohistochemistry（n=126）.D：Kaplan-Meier survival analysis of OC patients with high or low PLK1 expression（n=126）.Scale bar=50μm.Mean±SD.**P＜0.01 vs HOSEPICgroup；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OCgroup.圖1 PLK1在OC細胞和組織中的表達上調，與OC患者的總體生存率相關

與正常OVCAR3和SKOV3細胞相比，OVCAR3-5FUres和SKOV3-5FUres細胞中PLK1表達均顯著上調（P＜0.01），見圖2。為了探討PLK1在OC細胞5-FU耐藥中的生物學作用，采用CCK-8法計算5-FU的IC50值（5-FU降低細胞活力50%的濃度），其中5-FU對SKOV3細胞的IC50為（10.45±0.61）μmol/L，對SKOV3-5FUres細 胞 為（39.89±1.89）μmol/L，對OVCAR3細胞為（7.34±0.36）μmol/L，對OVCAR3-5FUres細胞為（48.45±2.88）μmol/L。各細胞系中PLK1的表達與5-FU的IC50值呈正相關（r=0.997，P=0.008），見圖3A。為了證實5-FU耐藥與PLK1表達之間的關系，將OVCAR3-5FUres和SKOV3-5FUres轉染sh-PLK1或陰性對照（sh-NC），然后用濃度增加的5-FU（0、2、4、8、16、32、64和128μmol/L）處理細胞48 h。CCK-8結果顯示，與陰性對照細胞相比，轉染sh-PLK1的細胞活力顯著降低（P＜0.05），見圖3B、C。相比之下，轉染PLK1重組質粒的OVCAR3和SKOV3細胞的活力顯著高于對照細胞（P＜0.05），見圖3D、E。

3 PLK 1與hMSH2相互作用

為了深入了解PLK1在OC細胞中的作用，我們建立了穩定表達SFB標記PLK1的293T細胞，并進行了串聯親和純化和質譜分析，其中hMSH2是鑒定的最豐富的蛋白質之一（圖4A及表2），表明PLK1可能與癌細胞中的hMSH2有功能聯系。我們用外顯親和力檢測了串聯蛋白的相互作用，可見SFB標記的PLK1與HA標記的hMSH2相互作用（圖4B）。共聚焦顯微鏡分析還顯示，SFB標記的PLK1與HA標記的hMSH2共定位（圖4C）。

4 PLK1通過靶向hMSH2促進細胞凋亡

所有的細胞均用10μmol/L 5-FU或相同體積的DMSO作為對照，孵育48 h。結果顯示，轉染sh-PLK1的OVCAR3-5FUres細胞的凋亡率顯著高于相應的陰性對照（sh-NC）細胞（P＜0.01）；在不同處理組中，轉染sh-PLK1和5-FU處理的OVCAR3-5FUres細胞凋亡率最高；此外，hMSH2基因敲除使sh-PLK1轉染的OVCAR3-5FUres細胞的凋亡率降低（P＜0.01），見圖5。

表1 PLK 1蛋白表達水平與臨床病理特征相關Table 1.Correlation between PLK1 protein expression and clinicopathological features

Figure 2.The relative expression of PLK1 in 5-FU-sensitive and-resistant SKOV3 cells（A）and OVCAR3 cells（B）was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs SKOV3 group；##P＜0.01 vs OVCAR3 group.圖2 Western blot檢測PLK 1在5-FU敏感和耐藥的SKOV3細胞、OVCAR3細胞中的相對表達

討 論

Figure 3.PLK1 reduces the sensitivity of OCcells to 5-FU.A：Spearman rank correlation analysis was used to evaluate the relationship between PLK1 expression and IC50 of 5-FU in OVCAR3，SKOV3，OVCAR3-5FUres and SKOV3-5FUres cells；B and C：CCK-8 assay was used to detect the activity of 5-Fu-resistant OCcells transfected with sh-PLK1 or negative control；D and E：CCK-8 assay was used to determine the viability of OCcells transfected with PLK1 or negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sh-NCgroup；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NCgroup.圖3 PLK1降低OC細胞對5-FU的敏感性

Figure 4.PLK1 interacted with hMSH2.A：293T cells stably expressing either the vector control or SFB-tagged PLK1 were used for tandem affinity purification；B：co-immunoprecipitation analysis of SFB-tagged PLK1 and HA-tagged hMSH2 in 293T cells；C：confocal microscopic analysis of SFB-tagged PLK1 and HA-tagged hMSH2 in 293Tcells.n=3.圖4 PLK1與hMSH2相互作用

表2 質譜鑒定與PLK 1相互作用的蛋白Table 2.Identification of proteins interacting with PLK1 by mass spectrometry

Figure 5.Down-regulation of PLK1 increased the sensitivity of OVCAR3-5FUres cells to 5-FU by targeting hMSH2.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs sh-NC+DMSOgroup；*P＜0.05 vs sh-PLK1+DMSOgroup；△△P＜0.01 vs sh-PLK1+5-FUgroup.圖5 PLK1表達降低通過靶向hMSH2增加OVCAR3-5FUres細胞對5-FU的敏感性

已經證實PLK1在許多不同的腫瘤類型中過度表達，并且干擾PLK1的功能會導致細胞周期停滯和凋亡［8-9］。在這項研究中，我們檢測PLK1在OC細胞和腫瘤組織中均上調，并且高水平的PLK1蛋白顯著縮短了OC患者的總生存期。此外，降低PLK1表達通過直接靶向hMSH2，提高了體外OC細胞對5-FU治療的敏感性?；熌退幨荗C患者預后不良的主要原因，尤其是對基于5-FU的輔助治療反應微弱或完全不起作用的dMMR狀態的OC患者。最近一些數據表明，MMR系統與化療耐藥相關；當MMR系統出現功能性錯誤或缺陷時，修復過程失敗，未修復的突變分散在整個基因組中，導致腫瘤相關基因的突變，出現化療耐藥［7］。識別和修復DNA錯配有利于改善OC患者的腫瘤預后。因此，我們認為PLK1是改善dMMR OC患者化療耐藥的一個有價值的靶點。先前的研究表明PLK1的異常表達參與了包括OC在內的一些腫瘤的惡性過程［10-13］。研究證實，PLK1在OC組織中顯著上調，并通過激活Wnt途徑和增加相關轉錄因子c-Myc和Nanog來影響OC細胞的重編程［14］。然而，PLK1與5-FU耐藥之間的關聯在OC中仍然是未知的。本研究顯示PLK1在5-FU耐藥的OC細胞系中上調。此外，我們檢測PLK1與dMMR狀態呈正相關。總的來說，這些數據表明PLK1在腫瘤MMR中起著潛在的調控作用。

多項的證據表明，表觀遺傳改變可能在OC化療抵抗中起重要作用［15］。在哺乳動物中，MMR基因不僅在DNA復制和修復中起著關鍵作用，而且在DNA損傷信號和隨后的細胞凋亡中也起著關鍵作用［3］。由于化療是眾多癌癥治療中DNA損傷的主要成分，MMR蛋白的丟失使細胞對DNA損傷因子產生抵抗力［7］。Ding等［16］報告，MLH1過表達可以使OC細胞對順鉑誘導死亡敏感。Jia等［17］揭示了上皮性卵巢癌中PMS2的表達受到Akt的翻譯后調控，進一步支持MMR系統對鉑誘導的細胞凋亡至關重要。本研究借助串聯親和純化和質譜分析支持了hMSH2是PLK1在OC細胞中的結合蛋白。hMSH2本身［18］或作為hMSH2-hMSH6復合物［3］可識別化療藥物引起的特定DNA損傷。此外，hMSH2可與ATR相互作用，并將其招募到DNA損傷部位，進一步激活一系列凋亡蛋白，導致細胞凋亡［19］。因此，hMSH2在OC的耐藥中起重要作用。本研究顯示，hMSH2基因敲除逆轉了PLK1抑制劑的功能。這些結果表明PLK1通過下調hMSH2來增強OC細胞對5-FU的抗性。

綜上所述，PLK1可能成為dMMR OC的一個有希望的治療靶點，抑制PLK1表達通過靶向hMSH2提高了OC細胞對5-FU的敏感性。因此，PLK1抑制劑可能與化療藥物聯合用于OC治療。