紫云英苷誘導DLBCL細胞系OCI-LY8凋亡*

王 瑜，朱明了，何施燕，陳 弘，陳佳玉

（紹興文理學院醫學院，浙江紹興312000）

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常見的侵襲性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），約占NHL的41%［1］。美羅華+環磷酰胺+阿霉素+長春新堿+潑尼松聯合用藥是目前DLBCL的標準治療手段，可使患者5年生存率＞71%［2］，但因有明顯毒副作用，且＞1/3的患者治療后會復發［3］，不能實現對DLBCL的完全治療。對于復發或難治性DLBCL患者，常需干細胞移植，但該法費用貴，供體難尋，排斥率高，有較大風險，且往往只能緩解癥狀，不能徹底治愈［4］。因此，尋找高效治療DLBCL的替代藥物一直是該領域研究的熱點。

紫云英苷（astragalin）屬于黃酮類化合物，普遍存在于藥用植物中，有抗炎、抗氧化和保護心肌的功能［5-6］。有研究表明，astragalin可通過活化caspase-3而發揮抗黑色素瘤作用［7］，但其抗DLBCL作用尚未見報道。因此，本研究擬觀察astragalin對DLBCL細胞系OCI-LY8的作用及其分子機制。

材料和方法

1 實驗材料

OCI-LY8細胞為本實驗室所保存。清潔級BALB/c小鼠購自于浙江省實驗動物中心，動物合格證號為SCXK（滬）2013-0016。Astragalin購自深圳市美荷生物科技有限公司；CCK-8為日本同仁公司產品；Hoechst 33342、BCA蛋白濃度測定試劑盒以及RIPA裂解液（強）均購自上海碧云天公司；AnnexinVFITC/PI雙染試劑盒及脫脂奶粉購自BD；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培養液以及胰蛋白酶均購自Gibco；Ⅰ抗和酶標Ⅱ抗購自武漢博士德生物技術公司；RT-qPCR引物源自上海生工生物公司；Trizol和SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis System購自Invitrogen；ECL化學發光液購自Sigma。

2 方法

2.1 細胞培養用含10%FBS的RPMI-1640細胞培養液，將處于對數生長期的OCI-LY8細胞濃度調節至8×107/L，分別接種于96孔板（每孔100μL）和6孔板（每孔2 mL）中，均置于37℃、5%CO2條件下培養。

2.2 CCK-8法檢測OCI-LY8細胞活力取上述96孔培養板，加入astragalin，使其終濃度分別為0、1、5、25和125μg/L，孵育0、24、48和72 h，設3復孔，加入CCK-8溶液每孔10μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養3 h，于490 nm波長下經酶標儀檢測吸光度（A）值，分析OCI-LY8細胞活力，并作生長曲線。

2.3 Hoechst 33342染色觀察OCI-LY8細胞核的變化取上述6孔培養板，加入astragalin，使其終濃度分別為0、5、25和125μg/L，設3復孔，37℃、5%CO2條件下孵育24 h后離心，棄上清，PBS洗3次，用10 μg/L Hoechst 33342染色，室溫條件下避光染色10 min，PBS洗3次，加入50μL PBS，熒光倒置顯微鏡下觀察OCI-LY8細胞核變化。

2.4 流式細胞術分析OCI-LY8細胞凋亡率取上述6孔培養板，加入astragalin，使其終濃度分別為0、5、25和125μg/L，設3復孔，繼續培養24 h后離心，棄上清，PBS洗2次，用細胞凋亡死亡雙染試劑盒染色15 min，PBS洗2次，用流式細胞術分析細胞凋亡和死亡率（試劑用量和染色方法按試劑說明書進行）。

2.5 RT-qPCR檢測OCI-LY8細胞內mRNA的轉錄水平用含有0μg/mL和25μg/m Lastragalin的培養液孵育OCI-LY8細胞24 h，Trizol法提取細胞總RNA，經Nano Drop2000定量后，采用SuperScript?ⅢFirst-Strand Synthesis System逆轉錄生成cDNA（試劑用量和操作均按說明書進行）。以β-actin為內參，實時熒光定量PCR檢測細胞p53、caspase-3、Bax、Bcl-2、JAK1、JAK2和STAT3的mRNA水平，經2-ΔΔCt法計算，分析各mRNA的相對水平。引物序列見表1。

2.6 Western blot分析蛋白水平的變化用含有0 μg/L和25μg/L astragalin的培養液分別孵育OCI-LY8細胞24 h，離心棄上清液，用PBS洗3次，加入適量細胞裂解液，提取蛋白，經蛋白定量試劑盒定量后以β-actin為內參照進行Western blot，觀察OCI-LY8細胞p53、caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達及JAK1、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for RT-qPCR

2.7 抑瘤實驗取4周齡雄性BALB/c小鼠，隨機分為6組，每組10只。在無菌條件下飼養1周以適應環境。取對數生長期的DLBCL細胞OCI-LY8，1 000 r/min離心5 min，去上清，PBS清洗3次，完全去上清液，將細胞沉淀并用生理鹽水稀釋成2×1010/L，于小鼠腹股溝皮下注射0.5 mL細胞懸液。注射3 d后，各組小鼠分別每天灌胃0、5、25、125、625和3 125 μg/kg劑量的astragalin，10 d后殺鼠，取瘤組織稱重，分析該藥的抑瘤作用。

3 統計學處理

用SPSS 19.0軟件處理實驗數據。實驗數據用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間差異的比較用單因素方差分析，以P＜0.05表明差異有統計學意義。

結 果

1 Astragalin抑制OCI-LY8細胞的活力

分別經0、1、5、25和125μg/L的astragalin作用OCI-LY8細胞0 h、24 h、48 h和72 h，結果如圖1所示，astragalin能顯著抑制OCI-LY8細胞的活力，且作用效果隨用藥劑量和用藥時間的增加而增強。

Figure 1.The results of viability by CCK-8 assay.OCI-LY8 cells were treated with 0，5，25 and 125μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μg/L group.圖1 CCK-8法檢測細胞活力

2 Astragalin導致OCI-LY8細胞核型改變

經0、5、25和125μg/L的astragalin分別作用OCI-LY8細胞24 h，結果如圖2所示，經5、25和125 μg/L astragalin作用后的OCI-LY8細胞，出現細胞核染色質濃集、核碎裂現象，形成凋亡小體，且作用效果隨用藥劑量的增加而增強。

3 Astragalin上調OCI-LY8細胞的細胞凋亡水平

分別經0、5、25和125μg/L的astragalin作用OCI-LY8細胞24 h，流式細胞術檢測結果顯示，astragalin可誘導OCI-LY8細胞凋亡，且作用效果隨用藥劑量的增加而增加（P＜0.01），見圖3。

4 Astragalin改變OCI-LY8細胞各基因的mRNA水平

經25μg/L astragalin作用OCI-LY8細胞24h后，RT-qPCR檢測結果顯示，細胞內p53、caspase-3和Bax的mRNA水平顯著上調，而Bcl-2、JAK1、JAK2和STAT3的mRNA水平顯著下降（P＜0.01），見圖4。

Figure 3.The results of apoptotic rate examined by flow cytometry.OCI-LY8 cells were treated with 0～125μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs0μg/L group.圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡率的結果

5 Astragalin改變OCI-LY8細胞的蛋白水平

經25μg/L astragalin作用OCI-LY8細胞24h后，Western blot檢測結果顯示，astragalin可顯著上調OCI-LY8細胞內p53、caspase-3和Bax蛋白水平，并下調蛋白Bcl-2的蛋白水平及JAK1、JAK2和STAT3的磷酸化水平，見圖5。

6 Astragalin抑制DLBCL生長

抑瘤實驗結果顯示，astragalin可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，且作用效果隨用藥劑量的增加而增強（P＜0.01），見圖6。

討 論

JAK/STAT信號通路主要由酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶JAK以及轉錄因子STAT三組分構成［8］，近年來越來越多的資料證實，該信號通路可作為腫瘤治療藥物的靶點［9-11］。研究表明，JAK1和JAK2在經某種外界刺激后的磷酸化水平受抑，而活性降低的JAK1和JAK2可抑制STAT3蛋白在細胞內募集，并下調STAT3蛋白活性［12-13］，p-STAT3下降可改變線粒體跨膜蛋白，導致Bax與Bcl-2同源二聚體比例增加，增強線粒體膜的通透性，誘導細胞色素C自線粒體中釋放出來，上調凋亡終末效應分子caspase-3的表達水平，促進腫瘤細胞發生凋亡，從而發揮抗腫瘤的作用［12-13］。

Figure 4.The results of RT-qPCR.OCI-LY8 cells were treated with 0 and 25μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs0μg/L group.圖4 RT-qPCR檢測結果

Figure 5.The results of Western blot.OCI-LY8 cells were treated with 0 and 25μg/L astragalin.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 μg/L group.圖5 Western blot檢測結果

本實驗將astragalin作用于DLBCL細胞OCILY8，經CCK-8法、Hoechst 33342染色和流式細胞術證實，astragalin可抑制OCI-LY8細胞活力并誘導其凋亡。同時RT-qPCR以及Western blot實驗結果顯示，細胞內p53、caspase-3和Bax蛋白水平顯著上調，Bcl-2蛋白含量及JAK1、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平顯著下降，因此，astragalin可抑制JAK/STAT信號通路的活化。同時當astragalin作用于OCI-LY8細胞后，p53蛋白水平顯著上調。p53是一種抑癌基因，它不僅可以激活Fas和TNF介導的外源性凋亡途徑，同時能激活線粒體途徑來誘導腫瘤細胞發生凋亡［14-15］。故而，在本研究中p53協同JAK/STAT信號通路發揮著抗DLBCL細胞OCI-LY8的作用。此外，小鼠抑瘤實驗也進一步證實astragalin的抑癌作用。

Figure6.The results of tumor inhibiting experiment.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs0μg/kg group.圖6 荷瘤小鼠抑瘤實驗檢測結果

綜上所述，astragalin可通過上調p53的表達和影響JAK/STAT信號通路，來抑制DLBCL細胞OCI-LY8活力，并誘導其發生凋亡，為抗DLBCL替代藥物的研發提供了重要依據。