Tiam1基因和蛋白在子宮頸癌組織中的表達及與預后的關系

李翠，錢慧珍，楊美嬌，李聰，張君

（中國醫科大學附屬盛京醫院大連醫院病理科，遼寧 大連330000）

T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因1（Tiam1）是一種在正常人腦組織和睪丸中具有高表達的基因，但對于惡性腫瘤患者，Tiam1可參與腫瘤細胞遷移、侵襲、浸潤的過程，在癌細胞擴散中發揮重要的作用[1]。子宮頸癌是一種發病率及病死率較高的常見婦科惡性腫瘤，且其發病趨于年輕化，已成為臨床研究的重點[2]。但臨床關于Tiam1基因和蛋白與子宮頸癌的研究較少，對其在子宮頸癌中的作用機制尚不明確。鑒于此，本研究旨在探討Tiam1基因和蛋白在子宮頸癌組織中的表達及與預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2019年9月于本院行子宮頸組織手術切除的158例患者，根據留取組織不同分為正常宮頸組織組（n=46）、宮頸上皮瘤變組（n=52）、子宮頸癌組（n=60）。正常宮頸組織組年齡31～64歲，平均年齡（40.31±7.42）歲。宮頸上皮瘤變組年齡30～60歲，平均年齡（39.64±7.17）歲；分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級24例，Ⅲ級10例。子宮頸癌組年齡34～69歲，平均年齡（41.23±7.89）歲；分型：鱗癌41例，腺癌19例。3組患者臨床資料比較差異無統計學意義，具有可比性。所有患者均對本研究知情同意，并自愿簽署知情同意書。本研究已通過醫院倫理委員會審核批準。

1.2 設備及試劑 實時熒光定量PCR儀（美國ABI）、光學顯微鏡（日本Olympus）、總RNA提取試劑盒（美國Invitrogen）、逆轉錄和PCR試劑盒（日本Takara）、Tiam1和內參引物（上海生工公司）、SP免疫組織化學試劑盒和DAB試劑及PBS（北京中杉金橋公司）、兔抗人Tiam1多克隆抗體（美國Santa Cruz）。

1.3 方法3組患者均采集2份標本，一份置于-80℃保存，一份制備成石蠟切片。①Tiam1 mRNA表達：取各組標本組織研磨，加入細胞裂解液，采用總RNA提取試劑盒提取各組的總RNA，并用紫外分光光度計檢測其純度，合格標準為A260/A280≥1.8。將總RNA逆轉錄為模板單鏈cDNA并用PCR試劑盒擴增，引物序列依次為Tiam1引物、β-actin引物，同時，PCR反應條件依次為：94℃預變性30 s；92℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環36次。對每份組織設置3個平行反應孔，獲取其中Tiam1基因的相對表達量。②Tiam1蛋白表達：將各組的石蠟標本切片、脫蠟和水化，置于濃度為3%的過氧化氫-甲醇在37℃下孵育30 min，并用PBS洗滌3次，置入檸檬酸緩沖液中煮沸10 min，冷卻后，再用PBS沖洗3次。常溫下滴入10%濃度的山羊血清，密閉存儲20 min，滴入一抗兔抗人Tiam1多克隆抗體（1:500），置入4℃冰箱中孵育過夜，取出后用PBS沖洗3次，以同型的IgG作為對照，加入增強劑，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入HRP標記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入DAB顯色并用蘇木素復染，中性樹脂封片，用光學顯微鏡觀察。由2位高經驗的病理科醫師獨立評判，若細胞質內出現黃色、棕黃色或黃褐色染色即為陽性，并對其評分。顏色評分：0分（不染色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）；陽性細胞比例評分：0分（≤5%）、1分（6%～25%）、2分（26%～75%）、3分（＞75%）；總評分=顏色評分×陽性細胞比例評分。依據總評分將Tiam1蛋白表達換分為：陰性（0分）、弱陽性（1～3分）、中等陽性（4～6分）、強陽性（7～9分）。

1.4 觀察指標 檢測3組中Tiam1 mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率，并分析與預后的關系。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，計數資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tiam1基因表達 正常宮頸組織組、宮頸上皮瘤變組、子宮頸癌組Tiam1 mRNA相對表達量分別為（1.26±0.17）、（1.76±0.23）、（2.06±0.18），子宮頸癌組Tiam1 mRNA水平明顯高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 Tiam1蛋白表達 子宮頸癌組Tiam1蛋白陽性率高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，且宮頸上皮瘤變組陽性率高于正常宮頸組織組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組Tiam1蛋白陽性率比較[n（%）]

2.3 子宮頸癌組織中Tiam1表達與預后關系 以P25為Tiam mRNA為臨界值將子宮頸癌組分為高表達組（n=39）和低表達組（n=21），高表達組復發率為76.92%（30/39），明顯高于低表達組的42.86%（9/21），差異有統計學意義（χ2=6.963，P=0.008）；子宮頸癌組Tiam1蛋白陰性表達患者復發率為18.18%（2/11），明顯低于陽性表達患者的71.43%（35/49），差異有統計學意義（χ2=8.640，P=0.001）。

3 討論

子宮頸癌細胞具有極強的轉移能力，因此，在行手術切除后仍有較高的復發率，而有學者認為Tiam1與癌細胞轉移與子宮頸癌復發密切相關，因此，從分子水平探討Tiam1在子宮頸癌組織內的表達，分析其對癌細胞遷移、侵襲的相關機制，有助于及早提高基因治療靶位，改善患者預后[3-4]。

本研究結果顯示，子宮頸癌組Tiam1 mRNA相對表達高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，Tiam1蛋白陽性表達率高于正常宮頸組織組和宮頸上皮瘤變組，且Tiam1 mRNA高表達者復發率較高，Tiam1蛋白陽性表達者復發率較高，表明Tiam1基因和蛋白與子宮頸癌密切相關，且其表達越高，患者預后越差。分析原因為，Tiam1是普遍存在的二磷酸鳥嘌呤核苷酸（GDP）與三磷酸鳥嘌呤核苷酸（GTP）的轉換因子，較少出現在腦和睪丸以外的組織，已被研究證實在胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達[5-6]。Tiam1作用于子宮頸癌的主要機制是通過作用于Rac1上游，其結構內的相關域同Ras產生相互作用，促進GDP和GTP相互轉換，從而活化Rac1，促使細胞表面的整合素甲組遷移至細胞頭部，并調節信號通路促進細胞骨架的活性和形態學改變和細胞運動，促進片狀偽足和膜多極化，從而導致癌細胞侵襲浸潤并發生轉移[7-8]。另外，有研究表明，Tiam1刺激活化的Rac1可誘導MMPs活化，可活化多種外基質結構蛋白的活性，從而誘導腫瘤血管生成，為惡性腫瘤生長提供營養，同時，為癌細胞進入循環系統提供通道[9-11]。因此，Tiam1和惡性腫瘤的發展與預后密切相關，可為臨床靶點治療和預后評估提供依據。

綜上所述，Tiam1基因在子宮頸癌組織中呈高表達，Tiam1蛋白在子宮頸癌組織中呈較高的陽性表達率，可參與子宮頸癌細胞的擴散，二者高表達將導致患者不良預后。