多因素交互作用導致烘焙咖啡中綠原酸快速降解

劉興勇，陳興連，杜麗娟，林 濤，尹本林，楊東順，邵金良*，汪祿祥

（云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650205）

咖啡中綠原酸類化合物含量十分豐富，約占咖啡質量的6%～12%[1]，主要以綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸3 種異構體為主，三者在小粒種咖啡中占多酚總量的80%以上，其中綠原酸占62%左右[2-3]。綠原酸不僅具有抗氧化、抗菌、保護心臟和神經、調控糖脂代謝和抗腫瘤等生物活性[4-6]，最新研究表明綠原酸還可抑制高溫加工食品中有害內源污染物丙烯酰胺和晚期糖基化終產物的產生[7-10]，是一種新型、天然、高效的食品污染物抑制劑和食品免疫增強劑[4,6]，其烘焙產物是咖啡苦味物質的來源之一[11]。

烘焙條件對咖啡豆的物理和化學性質有較大影響。Smrke等[12]報道咖啡中的新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的質量分數分別為0.17%～0.21%、2.9%～3.2%、0.28%～0.34%。Dong Wenjiang等[13]發現不同品種咖啡綠原酸含量無顯著差異，而新綠原酸和隱綠原酸含量在品種間差異顯著。近年來有許多關于烘焙條件對咖啡綠原酸影響的報道。綠原酸在咖啡烘焙過程中能發生酰基遷移、脫水、差向異構化及與醋酸、奎尼酸和莽草酸的酯交換，通過4 種不同的反應途徑產生熱降解，目前咖啡豆中共鑒定出137 種不同的綠原酸衍生物[14-15]。Moon等[16]指出咖啡總綠原酸含量隨烘焙強度的增加而降低，230 ℃下烘焙12 min和250 ℃下烘焙21 min，綠原酸總含量分別降至原含量的50%和接近微量。該結果與本課題組前期研究結果[17]一致，且新綠原酸和隱綠原酸在輕度烘焙時含量較生咖啡豆有所上升，主要原因是綠原酸在一定條件下發生異構體的轉化[18]。綠原酸先異構為隱綠原酸，然后經分子內?；w移生成新綠原酸，其異構化取決于基質的pH值和溫度[19]。烘焙咖啡基質pH值偏酸性，在4～6之間[16]，有研究表明綠原酸在酸性條件下穩定[20]，但在咖啡烘焙高溫條件下也能導致綠原酸異構體的轉化。研究證明咖啡酸度也與綠原酸含量有關，烘焙后隨酸度降低，綠原酸含量下降[16]。在咖啡烘焙過程的早期，高溫下綠原酸一方面可發生差向異構化，產生 多種異構體；另一方面，通過水分子的損失和分子內酯鍵的形成而產生內酯，隨著溫度的升高，異構體及內酯含量逐漸增多，其中3-咖啡酰奎寧酸內酯和4-咖啡?？鼘幩醿弱ナ侵饕木G原酸內酯，且輕度烘焙的內酯含量整體高于重度烘焙[20-21]。綠原酸的異構化和內酯的形成改變了異構體間的含量比例[22-23]，咖啡繼續烘焙導致綠原酸及其內酯碳-碳鍵斷裂，形成咖啡酸和奎寧酸、奎寧內酯類，逐步形成揮發性風味成分，如呋喃、吡啶、吡咯和吡嗪等[24]。因此，咖啡中綠原酸含量的高低與烘焙咖啡品質特性密切相關[25]。

除咖啡?？鼘幩犷惥G原酸異構體，異綠原酸也是咖啡中含量較多的一類綠原酸異構體，包括異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C 3 種，其中異綠原酸A為主要成分，占生咖啡豆質量的0.5%左右，影響沖泡咖啡的可接受度[26]。異綠原酸類異構體間同樣可發生轉化，并生成相應內酯[23]，但鮮見該類異構體在咖啡烘焙中的相關轉化研究?？Х群姹哼^程中，綠原酸能產生各種衍生物和揮發性成分，從而影響咖啡的品質、風味和口感。因此，開展綠原酸及其異構體在咖啡烘焙中的降解規律及影響因素的研究，對保持其功效活性、揭示咖啡化學成分和感官屬性之間的相互關系及控制咖啡品質具有重要意義。本研究采用不同條件對小?？Х壬惯M行烘焙，分析綠原酸及異構體與烘焙溫度、時間和咖啡基質pH值的量效動態變化和轉化關系，并采用動力學模型和化學反應模型探討多重因素對綠原酸降解的交互作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮卡小粒生咖啡豆購于普洱金樹咖啡產業有限公司。

綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A標準品 成都德思特生物技術有限公司；甲醇（色譜純） 德國Merck公司；磷酸、 磷酸氫二鈉、檸檬酸（分析純） 國藥集團化學試劑有 限公司。

1.2 儀器與設備

PhSJ-5 pH酸度計 上海儀電科學儀器股份有限 公司；e2695高效液相色譜儀（在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、2998二極管陣列檢測器） 美國 沃特世公司；Milestone ETHOS A微波消解/萃取系統 意大利萊伯泰科公司；CENTRA-R200超純水制備系統 英國ELGA公司；T500電子分析天平 常熟市雙杰測試儀器廠；BSA224S-CW電子分析天平 德國賽多利斯 公司；CBR-101咖啡烘焙機 韓國Gene Cafe集團。

1.3 方法

1.3.1 咖啡豆樣品的烘焙

將200 g生咖啡豆放入烘焙機中，設定烘焙溫度分別為230、235、240、245 ℃，烘焙時間分別為10、12、14、16、18 min。烘焙結束后迅速冷卻、稱質量，磨碎過80 目篩，密封錫箔紙保存于-20 ℃備用。

1.3.2 咖啡豆水分質量分數及烘焙質量損失率的測定

水分質量分數的測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，采用直接干燥法?？Х群姹嘿|量損失率按公式（1）計算。

1.3.3 咖啡pH值的測定

生咖啡豆和烘焙咖啡豆pH值測定參照Chindapan等[27]的方法。稱取2 g磨碎并通過80 目網篩的咖啡粉放入250 mL錐形瓶內，加入100 mL蒸餾水，搖勻。將混合物在電熱板上加熱至微沸，并保持10 min，冷卻后用濾紙過濾。取50 mL濾液至100 mL平底燒杯中，使用事先校正好的pH計測定pH值。

1.3.4 綠原酸降解模擬模型

采用不同比例的磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）和檸檬酸溶液（0.1 mol/L）配制pH值分別為4、5、6的緩沖液，利用上述緩沖液配制濃度為10 mmol/mL的綠原酸溶液。吸取2.0 mL綠原酸溶液加入石英管中，采用微波消解/萃取系統加熱，溫度分別設置為180、200 ℃， 加熱時間分別為10、20 min，反應結束冷卻后定容至2.0 mL，過0.22 μm濾膜，測定3 種綠原酸異構體含量。每份樣品進行3 次平行實驗。

1.3.5 咖啡中綠原酸類化合物含量的測定

稱取0.5000 g（精確至0.0001 g）制備的咖啡粉于100 mL容量瓶中，加入80 mL體積分數0.1%的磷酸-水溶液，沸水浴30 min，期間每隔10 min搖動一次。取出冷卻至室溫，用體積分數0.1%的磷酸-水溶液定容并混勻，靜置10 min后過0.45 μm濾膜，待測。新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸及3 種綠原酸異構體含量的測定采用高效液相色譜法，配備2998二極管陣列檢測器；分離柱為CAPCELL PAK MG IIC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）和體積分數0.1%的磷酸-水溶液（B），流速為1.0 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫35 ℃；檢測波長327 nm。梯度洗脫程序為：0～10 min，10% A；10.01～12 min，20% A；12.01～30 min，20% A；30.01～32 min，10% A；32.01～36 min，10% A。

1.4 數據統計與分析

采用Graphpad Prism 8.0統計軟件進行單因素方差分析（P＜0.05表示差異顯著）、Pearson相關性分析，采用SPSS 20.0統計軟件進行兩因素交互作用分析。檢測結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 咖啡烘焙給熱曲線

230 ℃烘焙溫度的咖啡烘焙給熱曲線如圖1所示，咖啡烘焙機給熱可分為升溫、恒溫烘焙和降溫3 個階段。設定烘焙溫度為230 ℃、烘焙時間10 min時，咖啡豆烘焙開始時，由室溫升至設定溫度，包括生咖啡豆蒸發水分并引起化學反應導致溫度下降并逐漸上升，這一階段大概持續3 min，恒溫烘焙7 min，降溫至60 ℃需9 min。以此類推，烘焙溫度每升高5 ℃時，升溫時間延長1.5 min，恒溫烘焙時間延長2 min，降溫時間延長1.5 min?？Х群姹航o熱曲線能為開展不同程度烘焙咖啡烘焙工藝和參數的設計提供參考。

圖 1 咖啡230 ℃烘焙時給熱曲線Fig. 1 Temperature-time curves of coffee roasting process at 230 ℃

2.2 不同烘焙程度咖啡豆質量損失率和水分質量分數

如圖2所示，隨烘焙時間的延長和烘焙溫度的升高，小粒咖啡豆水分質量分數降低，從生咖啡豆的最高水分質量分數8.91%降至245 ℃烘焙18 min的最低質量分數5.62%。質量損失率變化趨勢與水分質量分數相反，隨著水分質量分數的減少，咖啡質量損失率增加。在0～10 min烘焙加熱過程中，隨烘焙溫度升高，咖啡豆質量損失率急劇增加，在烘焙后期的14～18 min，質量損失率增加趨于 平緩。質量損失率范圍在1.90%～3.29%，最低和最高質量損失率分別對應230 ℃烘焙10 min和245 ℃烘焙18 min。本研究顯示，咖啡水分質量分數與烘焙時間、溫度分別呈負相關，烘焙的強度顯著影響咖啡水分質量分數和質量損失率，結果與Somporn等[28]研究一致，其指出水分的損失主要發生在咖啡烘焙的脫水階段，裂解階段有少部分損失，但非常緩慢。

圖 2 不同烘焙程度咖啡水分質量分數（A）及質量損失率（B）變化Fig. 2 Changes in moisture content (A) and mass loss rate (B) of coffee at different roasting degrees

2.3 烘焙咖啡pH值及綠原酸類化合物含量變化規律

由表1可知，生咖啡豆pH值為5.71，相同烘焙溫度下，隨烘焙時間延長，pH值呈現先降低后升高的趨勢。在相同烘焙溫度下，230 ℃時烘焙12 min咖啡pH值最低，其余溫度下最低pH值均出現在烘焙10 min時，隨烘焙時間的延長，pH值逐漸升高，245 ℃烘焙18 min pH值升高至5.80。與pH值不同，綠原酸含量隨烘焙時間的延長或烘焙溫度的升高顯著降低，230 ℃下烘焙10 min，含量降低為生咖啡豆的50%左右；同一烘焙時間，溫度越高含量降幅越大，如235、240、245 ℃烘焙10 min，綠原酸含量分別為生咖啡豆中的41.7%、41.9%和31.4%，該結果與Moon等[16]的結論一致。烘焙時間對綠原酸影響明顯，不同烘焙溫度，相同的烘焙時間（0～10 min），綠原酸的含量顯著變化（P＜0.05），在245 ℃烘焙18 min后綠原酸含量降至0.54 mg/g。異綠原酸異構體在生咖啡豆中含量較低。異綠原酸類異構體在230 ℃烘焙10 min時含量均顯著降低（P＜0.05），12 min時出現不同程度的升高，其中異綠原酸A和異綠原酸C含量顯著增加 （P＜0.05）。異綠原酸3 種異構體總體上隨烘焙時間延長呈現降低趨勢，但不同異構體含量降低程度沒有一致規律。有研究表明，在熱降解中，異綠原酸B比異綠原酸A更穩定，隨烘焙時間的延長，二者比值也增加，可能是異構體在相互轉化的同時異綠原酸A熱降解速率更高所致[21]，在本研究中，異綠原酸B含量較其他兩種異構體高，二者含量變化趨勢與上述報道一致。

表 1 烘焙咖啡綠原酸異構體含量及pH值Table 1 Contents of chlorogenic acid and its isomers as well as isochlorogenic acids and pH in roasted coffee

如圖3所示，綠原酸與烘焙溫度、時間呈極顯著負相關（P＜0.01），相關系數分別為-0.800和-0.939，與咖啡水分質量分數極顯著正相關（P＜0.01），相關系數為0.863，與咖啡pH值呈弱負相關。有研究報道，綠原酸在酸性條件下較穩定[20]，本研究結果顯示生咖啡豆和烘焙咖啡豆pH值均處于酸性環境，該結果與Moon[24]、Chindapan[27]等的研究結果一致。酸性基質條件可在一定程度上緩解綠原酸的降解和轉化。其次，水分的存在可緩解綠原酸的異構化和降解[21]，但綠原酸的熱不穩定性仍可導致其快速降解。與綠原酸變化規律不同，新綠原酸和隱綠原酸在烘焙時間較短的情況下（10～12 min）較生咖啡豆含量有所增加。230～245 ℃下烘焙10 min，新綠原酸含量增加幅度分別為88.9%、66.3%、66.1%和21.5%；隱綠原酸含量增加幅度分別為82.7%、62.0%、61.7%和20.9%。可見，在同一烘焙時間，新綠原酸和隱綠原酸隨烘焙溫度升高，含量增幅逐漸降低?？赡茉蚴蔷G原酸在烘焙初期除發生降解外， 還大量異構化為新綠原酸和隱綠原酸；隨烘焙時間延長，pH值逐漸升高，兩種異構體同時發生內酯化和降解，導致含量顯著降低[18,21]。本研究發現兩種異構體在245 ℃下亦出現快速降解，導致不同烘焙時間含量差異顯著，研究結果與上述報道的結果[18,21]一致。由圖3可知，新綠原酸和隱綠原酸均與烘焙時間呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數分別為-0.636和-0.641。有研究顯示，新綠原酸和隱綠原酸兩種異構體較綠原酸具有更好的耐熱性，與烘焙時間的相關性更高[21]。本研究還發現新綠原酸、隱綠原酸與pH值呈極顯著負相關 （P＜0.01），相關系數分別為-0.808和-0.811，pH值同樣是影響綠原酸降解的重要因素之一。

圖 3 烘焙咖啡影響因素與綠原酸類化合物含量相關性分析結果Fig. 3 Correlation analysis of roasting conditions and pH with contents of three caffeoylquinic acids in roasted coffee beans

2.4 綠原酸異構體隨烘焙時間變化的降解動力學

為研究咖啡烘焙中綠原酸降解規律，采用無因次量C建立烘焙過程綠原酸降解動力學模型，C為某一烘焙條件下綠原酸含量與生咖啡豆綠原酸含量比值。零級反應動力學方程如式（2）所示。

一級反應動力學方程如式（3）所示。

式中：k為反應速率常數/min-1；t為干燥時間/min。

對不同烘焙溫度、不同烘焙時間所得綠原酸、異構體含量變化進行曲線擬合，結果如圖4和表2所示，lnC與時間呈良好的線性關系，R2均在0.96以上（表2），符合一級反應動力學模型。式（2）符合烘焙咖啡綠原酸異構體降解的動力學變化規律。本研究還發現異綠原酸3 種 異構體的變化趨勢不適合用動力學模型擬合，可能其化學性質與綠原酸類異構體差異較大，且不能排除其可通過熱降解而產生綠原酸類異構體[21]。綜上，異綠原酸類的熱降解較復雜，有待進一步研究驗證。

圖 4 不同烘焙溫度下3 種綠原酸異構體的擬合曲線Fig. 4 Fitting curves for three caffeoylquinic acids at different roasting temperatures

表 2 不同烘焙溫度下綠原酸降解模型及擬合參數 Table 2 Kinetic models and fitting parameters for degradation of three caffeoylquinic acids at different roasting temperatures

2.5 溫度和時間交互作用對綠原酸含量和pH值的影響

由上述結果可知，并不是所有烘焙因素對綠原酸異構體均具有同樣的作用效果，因此開展咖啡烘焙溫度和時間的交互作用分析，結果如表3所示?？Х群姹褐校? 種異構體含量快速降低，烘焙時間、溫度、pH值等因素存在一定的交互作用，烘焙溫度和時間的協同作用對3 種綠原酸異構體含量和咖啡pH值呈現高度 顯著的影響（P＜0.001）。

表 3 咖啡烘焙溫度與時間交互作用對綠原酸含量和pH值影響的分析Table 3 Analysis of variance for the effect of interaction between roasting temperature and duration on the contents of three caffeoylquinic acids and pH in roasted coffee beans

2.6 溫度和pH值對綠原酸異構體含量的影響

采用準確控制pH值的綠原酸化學模擬反應模型驗證加熱溫度和pH值對綠原酸熱降解的交互作用，實驗結果見圖5和表4。不同pH值下，質量濃度為3.54 mg/mL（10 mmol/mL）綠原酸單體加熱10 min，均有部分綠原酸轉化成為新綠原酸和隱綠原酸兩種異構體。相同溫度條件下，模擬模型中綠原酸異構體質量濃度隨pH值升高而顯著下降（P＜0.05）。在180 ℃、pH 6時，質量濃度達到痕量，3 種異構體質量濃度分別為6.25、5.34 μg/mL和 3.00 μg/mL（表4）。隨pH值升高，綠原酸降解程度顯著增強。經pH值和溫度的交互作用分析發現，pH值對綠原酸的降解影響高度顯著（P＜0.001）（表5）。Narita等[29]研究表明，綠原酸降解依賴于pH值和異構化，隨pH值的升高，穩定性降低，降解加劇，本研究結果與該研究結果一致。

相同pH值條件下，反應模型中綠原酸異構體質量濃度在不同溫度下差異顯著（P＜0.05）（表4）。在pH值為4時，3 種異構體質量濃度在200 ℃時約為180 ℃的50%，通過因素主體效應檢驗發現，溫度、pH值的交互作用對綠原酸的降解影響高度顯著（P＜0.001） （表5）?；瘜W反應模擬結果顯示：綠原酸的快速降解可以解釋為pH值和溫度的交互協同增效作用，而不是某一單獨因素的影響。綜上，綠原酸熱降解均受烘焙溫度、時間和pH值的顯著影響，該結果與Jiao Ye[30]和Dawidowicz[31]等的結論一致。

圖 5 不同pH值條件下綠原酸單體的轉化及降解圖譜Fig. 5 High performance liquid chromatograms showing conversion and degradation of 3-O-CQA into 4-O-CQA and 5-O-CQA with increasing pH of roasted coffee beans

表 4 綠原酸在不同加熱條件下模擬反應結果Table 4 Degradation of three caffeoylquinic acids under different temperature and pH conditions in chemical reaction models

表 5 pH值和溫度的交互作用對綠原酸降解影響的分析結果Table 5 Analysis of variance for the effect of interaction between pH and temperature on caffeoylquinic acid degradation

通過綠原酸單體的模擬反應，驗證了溫度、時間及pH值3 種因素的交互作用導致咖啡烘焙中綠原酸的快速降解。3 種因素在咖啡烘焙中不僅促使綠原酸向新綠原酸和隱綠原酸轉化，同時使其產生降解，三者之間的比例隨條件不同發生動態變化，對綠原酸功效作用產生一定的影響。未來，需要進一步開展不同加工工藝、加工因素對綠原酸異構化、量效化和比例化的研究，實現綠原酸在高溫加工食品體系的高值利用。

3 結 論

咖啡烘焙過程中，綠原酸類化合物均出現不同程度的降解致使含量顯著降低。綠原酸快速降解受溫度、時間和pH值的交互影響，各因素對不同異構體影響效果不同。新綠原酸、隱綠原酸含量隨pH值升高和烘焙時間的延長而降低，呈顯著負相關（P＜0.05）；綠原酸含量受烘焙時間、溫度和咖啡水分質量分數影響顯著，隨時間延長和溫度升高含量下降，呈顯著負相關 （P＜0.05），與水分質量分數呈顯著正相關 （P＜0.05），而pH值對綠原酸影響較弱。3 種綠原酸異構體在咖啡烘焙中的降解符合一級動力學模型。異綠原酸類異構體中異綠原酸B含量最高，異綠原酸C和異綠原酸A含量差異較小，3 種異構體均隨烘焙時間的延長與溫度的升高呈降低趨勢。