原花青素B2誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡 及其作用機制

薛宏坤，譚佳琪，李 倩,*，唐勁天,*

（1.清華大學工程物理系，粒子與輻射成像教育部重點實驗室，北京 100084；2.北京大學前沿交叉學科研究院，北京 100080）

正常細胞的生長、代謝及增殖分化都受機體嚴格而有序的調控，而癌變細胞則不受機體控制，會惡性增殖分化，破壞機體正常的生理功能，進而誘發機體死亡。其中，乳腺癌是惡性腫瘤之一，其嚴重危害女性身體健康，發病率位居女性惡性腫瘤的首位[1]。盡管乳腺癌的綜合治療水平在不斷提高，但其致死率仍然位居女性腫瘤的第2位。目前主要有6 種常見的乳腺癌類型，由于乳腺癌的種類不同，治療手段也不盡相同，但手術、化療、放療及藥物治療仍作為治療乳腺癌的主要手段。超過90%的乳腺癌都是非轉移的，對于非轉移的乳腺癌，治療方法一般是手術切除。手術雖可以局部切除腫瘤，但不能根除腫瘤組織，患者術后有可能復發，復發會導致患者的死亡率顯著提升。因此，僅僅通過手術的手段已經不能滿足康復需要；為降低術后乳腺癌的復發率，一般采用放療方法對局部組織進行治療；而對于轉移性病灶主要采用抗腫瘤藥物的治療，其中阿帕替尼、紫杉醇、紫杉烷加曲妥珠單抗和帕妥珠單抗是目前治療轉移性乳腺癌的一線藥物[2]。但由于上述的臨床藥物毒副作用較大，患者長期服用產生諸多的不良反應，并且腫瘤細胞會對之產生很強的耐藥性，由于藥物的局限性，使其應用受到限制。因此，尋找一種毒副作用小、抗腫瘤活性強的天然抗腫瘤藥物來預防或治療乳腺癌已成為當前研究熱點。

原花青素屬于天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和綠色植物莖葉中。原花青素是由單體、低聚和高聚合原花青素組成的化合物[3]，其中原花青素B2（procyanidin B2，PCB2）是原花青素二聚體中活性最強和來源最廣泛的一類化合物，其結構如圖1所示。其獨特的結構使PCB2具有強烈的清除體內過量自由基、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等功效[4-5]，對人體健康十分有益。例如，Kim等[6]研究發現蘋果中PCB2能夠有效清除自由基，同時具有較強的還原性；Tanaka等[7]研究發現PCB2通過下調T細胞表達T盒和視黃酸相關孤兒受體γt蛋白表達，從而抑制T細胞產生干擾素γ和白細胞介素17， 達到較好的抗炎效果；Gopalakrishnan等[8]的研究結果 表明，PCB2能抑制癌細胞中純化蛋白酶體和蛋白酶體的催化活性，但對正常細胞沒有抑制作用，同時減少前列腺癌細胞的增殖及降低前列腺癌細胞裂解物中抗凋亡和血管生成標記物的表達；Feng Jiao等[9]研究發現PCB2可調節人肝星狀細胞體內外血管內生長因子A、低氧誘導因子1α、α-平滑肌肌動蛋白、人I型膠原蛋白和轉化生長因子β1蛋白的表達，從而達到抑制人肝星狀細胞的增殖，誘導其凋亡。孫思明等[10]研究結果表明，山楂中PCB2可通過降低SMMC-7721細胞中抗氧化酶活力和抑制凋亡相關蛋白表達，達到抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的功效。通過以上研究發現，PCB2具有較好的抗炎和抗腫瘤活性，但目前關于PCB2對人乳腺癌MCF-7細胞的抗腫瘤活性及其分子機制尚不明確。

圖 1 PCB2化學結構式Fig. 1 Chemical formula of PCB2

鑒于此，本研究采用PCB2處理人乳腺癌MCF-7細胞，探究PCB2抗腫瘤活性及其機制。首先通過噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測定不同濃度PCB2和不同處理時間對MCF-7細胞存活率的影響；然后通過激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內Ca2+濃度變化并觀察Hoechst 33342染色后的細胞凋亡形態，同時利用流式細胞分析儀檢測PCB2對MCF-7細胞凋亡率、周期、胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平及線粒體膜電位變化的影響；最后通過Western blot檢測不同濃度PCB2對MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達量的影響。以期為乳腺癌的治療提供植物源的天然抗腫瘤候選藥物，同時為功能性食品的開發提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCB2（純度≥99.8%） 鼎瑞化工（上海）有限公司；人乳腺癌MCF-7細胞 北京協和細胞資源中心；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 山東西亞化學工業有限公司；雙抗（青霉素/鏈霉素） 上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Sigma公司；胰蛋白酶消化液 北京百華百匯生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA細胞裂解液 深圳市瑞吉特生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 上海盛思生化科技有限公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡和周期檢測試劑盒 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；Bcl-2、Bax、細胞色素c、Caspase-3/12和β-actin抗體 美國CST公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LSM 800激光共聚焦掃描顯微鏡 北京普瑞賽司儀器有限公司；JC-1086C Pro全自動酶標分析儀 青島聚創環保儀器有限公司；CO2恒溫培養箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ZE5流式細胞分析儀 美國 Bio-Rad公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 杭州艾普儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

將MCF-7細胞接種于含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養基中，然后于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。當MCF-7細胞鋪滿培養皿底70%～80%時進行傳代，采用對數期細胞進行后續實驗。

1.3.2 MTT法測定細胞活力

將對數期MCF-7細胞（1×104個/孔）接種于96 孔板中，每孔200 μL。在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，待細胞完全貼壁時，棄上清液，換為含PCB2終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的完全培養液（PCB2實驗組）；同時將不含PCB2、與實驗組等體積的完全培養基設為對照組。每個濃度設置6 個復孔。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養24、48、72 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT培養4 h，棄上清液，然后每孔再加入150 μL DMSO，振蕩15 min，用酶標儀測定490 nm波長處吸光度，并計算藥物的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。按式（1）計算細胞存活率[11]。

式中：A0為對照組吸光度；A1為不同濃度PCB2實驗組吸光度。

1.3.3 不同濃度PCB2處理MCF-7細胞內Ca2+濃度的檢測

按照細胞密度為2×105個/孔將對數期MCF-7細胞接種于6 孔板，每孔2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，待細胞貼壁后，按照1.3.2節給藥方式加入PCB2，同時設置對照，培養48 h，收集細胞，然后用PBS重懸細胞，以 1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入200 μL 4 μg/mL鈣離子熒光探針Fluo-3/AM，在37 ℃下避光孵育1 h，用預冷的PBS洗滌3 次，然后再加400 μL PBS重懸細胞，用尼龍網過濾后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測樣品綠色熒光強度。Ca2+濃度以綠色熒光強度表示。

1.3.4 不同濃度PCB2處理MCF-7細胞內ROS水平的測定

利用2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針檢測不同濃度PCB2對MCF-7細胞內ROS水平的影響。按照細胞密度為2×105個/孔將對數期MCF-7細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養24 h，待細胞貼壁后，按照1.3.2節給藥方式加入PCB2，同時設置對照，每個濃度設3 個復孔，培養48 h后，每孔加入終濃度5 μmol/L DCFH-DA熒光探針，避光反應20 min，吸取探針，細胞用PBS洗滌2 次，隨后利用胰蛋白酶消化，離心去除上清液，PBS重懸，并采用流式細胞分析儀測定每孔樣品的熒光強度。ROS水平以綠色熒光強度表示。

1.3.5 Hoechst 33342染色法觀察細胞凋亡形態

將對數期MCF-7細胞（2×105個/孔）接種在蓋玻片6 孔板中，每孔2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，待細胞貼壁后，按照1.3.2節給藥方式加入PCB2，同時設置對照，培養48 h后，吸去培養基，用預冷PBS洗滌3 次，然后每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定1 h，棄去固定液，用預冷PBS洗滌3 次，然后加入終質量濃度為5 mg/L Hoechst 33342染液，37 ℃避光染色15 min，取出蓋玻片，用濾紙吸干蓋玻片底部，將其置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 不同濃度PCB2處理MCF-7細胞凋亡率、周期分布和線粒體膜電位的測定

將對數期MCF-7細胞以2×105個/孔接種于6 孔板，每孔2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，待細胞貼壁后，按照1.3.2節給藥方式加入PCB2，同時設置對照，培養48 h，收集細胞，然后用PBS洗滌2 次。分別取2×105個MCF-7細胞，每份樣本加入5 μL Annexin V染液和10 μL PI染液，4 ℃避光染色30 min，通過流式細胞分析儀檢測MCF-7細胞凋亡率。

用上述相同方法收集細胞，分別取1×105個MCF-7細胞，在4 ℃條件下采用1 mL體積分數70%乙醇溶液固定，靜置過夜后，1000 r/min離心5 min，除去固定液，用預冷的PBS洗滌3 次后，加入100 μL 100 μg/mL RNA酶，在37 ℃下消化30 min，然后加入100 μL 50 μg/mL PI染色液，在4 ℃下避光染色30 min，通過流式細胞分析儀檢測MCF-7細胞周期分布。

用上述相同方法收集細胞，然后加入終質量濃度為10 μg/mL JC-1染色液，避光孵育30 min，隨后用預冷的PBS洗滌3 次，再加入PBS重懸細胞，將其置于流式細胞分析儀檢測每個樣品線粒體膜電位。線粒體膜電位以JC-1單體與聚合體熒光強度比值表示。

1.3.7 Western bolt測定不同濃度PCB2處理MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達量

將對數期MCF-7細胞接種于60 mm細胞培養皿，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，按照1.3.2節給藥方式加入PCB2，同時設置對照，培養48 h，隨后加入100 μL RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，利用BCA試劑盒測定總蛋白質量濃度。測定后取20 μL蛋白樣品上樣于質量分數5%～10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳凝膠中進行分離，冰浴下將其轉移至聚偏氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉在25 ℃下搖床封閉1 h，加入對應的一抗4 ℃孵育過夜，次日換為辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h。采用電化學發光顯影，然后通過凝膠成像檢測Bcl-2、Bax、細胞色素c、Caspase-3/12和β-actin的蛋白表達水平。結果采用Image Lab軟件對相應蛋白表達水平進行定量分析。

1.4 數據處理與分析

每組實驗重復3 次，結果均用平均值±標準差表示；采用Statistix8.0軟件對每組實驗數據進行方差分析，并分析差異顯著性（P＜0.05表示差異顯著）；采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理時間下不同濃度PCB2對MCF-7細胞存活率的影響

圖 2 不同濃度PCB2和處理時間對MCF-7細胞存活率的影響Fig. 2 Effect of PCB2 at different concentrations and treatment times on the survival rate of MCF-7 cells

由圖2可知，當處理時間分別為24、48 h和72 h時，MCF-7細胞存活率均隨PCB2濃度增加呈顯著降低趨勢（P＜0.05），并呈濃度依賴性。當PCB2濃度在10～80 μmol/L范圍時，用相同濃度的PCB2處理MCF-7細胞，處理24 h后MCF-7細胞存活率顯著低于處理48 h和72 h（P＜0.05），而處理48 h和處理72 h相比，MCF-7細胞存活率無顯著差異（P＞0.05）。因此，對PCB2處理MCF-7細胞48 h組作進一步分析。通過計算得到PCB2處理24、48 h和72 h對MCF-7細胞存活率的IC50分別為114.82、57.15 μmol/L和55.64 μmol/L，表明處理時間越長，IC50越小，對MCF-7細胞的殺傷能力越強。MTT實驗結果表明PCB2能有效抑制人乳腺癌MCF-7細胞的生長，且呈現濃度依賴性。

2.2 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞內Ca2+濃度變化的影響

圖 3 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞內Ca2＋濃度變化的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of PCB2 on the change of Ca2+ concentration in MCF-7 cells

機體在正常情況下，Ca2+具有維持線粒體膜通透性的作用。Ca2+失衡會造成內質網正常轉運被破壞，大量未折疊或錯誤折疊蛋白聚集，從而引發內質網應激，導致胞內過量ROS的產生，進而釋放細胞色素c，最終誘導細胞發生凋亡[12-13]。由圖3可知，與對照組相比，不同濃度PCB2處理MCF-7細胞48 h后，MCF-7細胞內Ca2+濃度顯著上升（P＜0.05），呈濃度依賴性。結果表明，PCB2處理會造成MCF-7細胞內Ca2+失衡，破壞內質網功能，誘發細胞凋亡，從而起到抗腫瘤效果。

2.3 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞內ROS水平的影響

線粒體是ROS產生的主要細胞器，機體在正常狀態下，ROS產生和清除處于動態平衡過程，適量ROS不僅能提高巨噬細胞的吞噬能力，而且能顯著提高機體的免疫能力[14-15]。但細胞受到外界應激刺激時，線粒體膜電位發生變化，使細胞內Ca2+失衡，進而誘發大量ROS產生，細胞內過量的ROS會對細胞膜、蛋白質和核酸造成氧化損傷，最終導致細胞凋亡[16-17]。由圖4可知，與對照組相比，不同濃度PCB2處理48 h后，MCF-7細胞內ROS水平顯著升高（P＜0.05），且PCB2濃度越大，MCF-7細胞內ROS水平越高。結果表明，PCB2能顯著提高MCF-7細胞內ROS水平，過量ROS釋放到胞質中破壞MCF-7細胞，從而抑制MCF-7細胞增殖，誘發細胞凋亡。

圖 4 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞內ROS水平的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of PCB2 on ROS levels in MCF-7 cells

2.4 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞凋亡形態的影響

圖 5 共聚焦顯微鏡觀察不同濃度PCB2作用下MCF-7細胞 凋亡形態的變化（×100）Fig. 5 Changes in apoptosis morphology of MCF-7 cells treated with different concentrations of PCB2 under confocal microscope (× 100)

PCB2能使MCF-7細胞內Ca2+濃度顯著上升，同時顯著提高胞內ROS水平。大量研究表明Ca2+失衡和過量的ROS均會誘導細胞發生凋亡[18-19]。為從另一方面進一步驗證PCB2是否能夠誘導MCF-7細胞發生凋亡，本實驗通過Hoechst 33342染色法觀察MCF-7細胞凋亡形態。由圖5可知，隨PCB2濃度（10～80 μmol/L）的增加，細胞數量相較于對照組明顯減少，不規則細胞數量增多，細胞核藍色熒光強度明顯增強，并伴有凋亡小體的產生，且具有濃度依賴效應。通過上述實驗結果可知，PCB2可通過誘導MCF-7細胞凋亡進而抑制其生長。

2.5 不同濃度處理PCB2對MCF-7細胞凋亡率的影響

圖 6 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞凋亡的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of PCB2 on apoptosis of MCF-7 cells

大量研究已表明PCB2具有較強的抗氧化和清除自由基的能力[20-21]，對癌細胞的增殖同樣具有顯著的抑制作用，可加速癌細胞的凋亡[22-23]。因此，本實驗在MTT和Hoechst 33342染色法觀察MCF-7細胞凋亡形態的基礎上，采用流式分析儀進一步探究不同濃度PCB2對MCF-7細胞凋亡率的影響。由圖6可知，隨PCB2濃度的增加，MCF-7細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴效應。當PCB2濃度為10、20、40、80 μmol/L 時，MCF-7細胞凋亡率分別為（12.85±0.65）%、（16.71±0.57）%、（21.43±1.12）%和（42.29±2.15）%；與對照組相比，細胞凋亡率分別提高了4.69%、8.55%、13.27%和34.13%。結果表明PCB2可通過抑制MCF-7細胞增殖加速細胞凋亡，且濃度越大效果越顯著。Miura[24]和Yin Wenbin[25]等的研究同樣發現PCB2能顯著提高癌細胞凋亡率，其作用機制可能是通過上調促凋亡相關蛋白表達水平和下調凋亡抑制因子，從而加速癌細胞凋亡。

2.6 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞周期分布的影響

圖 7 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞周期分布的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of PCB2 on cell cycle distribution of MCF-7 cells

為闡明PCB2對MCF-7細胞生長的抑制作用是否與細胞周期阻滯有關，本研究分析不同濃度PCB2對細胞周期分布規律的影響，采用細胞同期檢測試劑盒并通過流式細胞分析儀進行檢測。由圖7可知，當PCB2濃度在10～80 μmol/L范圍內，處理MCF-7細胞48 h后，與對照組相比，G0/G1期細胞數量隨PCB2濃度的增加呈顯著增加的趨勢（P＜0.05），且具有濃度依賴性；而S期和G2/M 期的細胞數量均隨PCB2濃度的增加呈顯著降低的趨勢（P＜0.05）。實驗結果表明PCB2對MCF-7細胞周期有阻滯作用，并將周期阻滯在G0/G1期，從而達到抑制MCF-7細胞生長的效果。

2.7 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞線粒體膜電位的影響

圖 8 不同濃度PCB2對MCF-7細胞線粒體膜電位的影響Fig. 8 Effect of different concentrations of PCB2 on mitochondrial membrane potential in MCF-7 cells

線粒體對細胞的生長、增殖、分化起著至關重要的作用，作為細胞能量工廠，一些抗腫瘤藥物在發揮其抗腫瘤作用時，通常會激活線粒體凋亡通路[26-27]。由圖8可知，與對照組相比，采用不同濃度PCB2處理48 h后，MCF-7細胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。結果表明PCB2可能通過線粒體途徑誘導MCF-7細胞凋亡。

2.8 不同濃度PCB2處理對MCF-7細胞凋亡相關蛋白的影響

在真核生物中，線粒體作為能量和代謝的中心，為細胞的生命活動提供必要的基礎能量[28]，同時也作為細胞凋亡的控制中心，當細胞受到外界抗癌藥物刺激時會造成線粒體功能損失，引起Bax/Bak形成低聚物復合體，復合體插入到線粒體外膜孔隙，導致Ca2+濃度和滲透壓發生變化[29]，引起內質網轉運功能喪失以及線粒體膜電位崩潰，促使細胞色素c釋放到細胞質[30]， 細胞色素c與細胞凋亡激活因子結合形成凋亡復合體從而激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，誘導凋亡的活化片段進入細胞核激活磷酸內切酶，進而使DNA裂解導致細胞發生凋亡[26-27]。為進一步探究PCB2對MCF-7細胞抗腫瘤作用的分子機制，本研究采用Western Bolt測定不同濃度PCB2對MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達量的影響。

圖 9 不同濃度PCB2對MCF-7細胞蛋白條帶（A）及蛋白Bax（B）、 Bcl-2（C）、細胞色素c（D）、Caspase-12（E）和Caspase-3（F） 相對表達量的影響Fig. 9 Effect of PCB2 at different concentrations on protein bands (A) and the protein relative expression levels of Bax (B), Bcl-2 (C), cytochrome c (D), caspase-12 (E) and caspase-3 (F) in MCF-7 cells

由圖9可知，與對照組相比，不同濃度PCB2處理48 h后，MCF-7細胞中Bax、細胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白相對表達量均顯著上調（P＜0.05），而Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調（P＜0.05），且呈濃度依賴性。實驗結果表明PCB2能激活線粒體介導的凋亡通路和內質網通路，上調促凋亡相關蛋白表達水平，下調凋亡抑制相關蛋白表達水平，進而抑制MCF-7細胞增殖，加速細胞凋亡，從分子機制方面進一步證明PCB2具有抗腫瘤的作用。

綜合以上研究結果可知，當MCF-7細胞受到PCB2干預后，首先打破Ca2+平衡，使內質網轉運功能被破壞，引起細胞內ROS水平顯著升高，過量的ROS誘導MCF-7細胞凋亡形態發生變化，在Hoechst 33342染色下可觀察到經PCB2處理后MCF-7細胞核呈現較強的藍色熒光，并且PCB2濃度越大，細胞核熒光強度越強，同時伴有凋亡小體的產生；通過細胞流式分析儀進一步分析可知，與對照組相比，不同濃度的PCB2處理均顯著增加MCF-7細胞凋亡率，同時PCB2對MCF-7細胞周期有阻滯作用，并將其細胞周期阻滯在G0/G1期，達到抑制MCF-7細胞生長的效果；另外，Ca2+濃度呈上升趨勢，造成線粒體滲透壓發生改變，線粒體膜電位隨PCB2濃度的增加呈顯著增加趨勢，結果說明PCB2能改變線粒體膜電位，進一步驗證PCB2可能通過線粒體途徑誘導MCF-7細胞凋亡。為進一步探究PCB2的抗腫瘤作用機制，Western blot實驗結果表明PCB2能上調Bax、細胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白相對表達水平，下調Bcl-2蛋白相對表達量。通過上述實驗結果可知PCB2具有抗腫瘤作用，其機制與激活線粒體和內質網介導的凋亡通路、周期阻滯和細胞內ROS水平升高有關，其凋亡途徑如圖10所示。

圖 10 PCB2誘導MCF-7細胞凋亡相關途徑Fig. 10 PCB2 induces apoptosis-related pathways of MCF-7 cells

3 結 論

通過上述研究結果可知，PCB2可通過破壞Ca2+平衡，增加胞內ROS水平和MCF-7細胞凋亡率，改變MCF-7細胞凋亡形態，并將細胞阻滯在G0/G1期，其內在機制為通過上調Bax、細胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白相對表達水平，下調Bcl-2蛋白相對表達水平來達到抗腫瘤效果。該研究結果為天然抗乳腺癌藥物的開發提供重要的物質資源和理論參考。