公路源重金屬對青藏高原高寒草甸土壤線蟲群落的影響

侯 磊,薛會英

1 西藏農牧學院資源與環境學院,林芝 860000 2 西藏高原森林生態教育部重點實驗室,林芝 860000 3 東北林業大學生態研究中心,哈爾濱 150040

土壤線蟲是土壤生物中的一類數量龐大、種類豐富,并且廣泛分布于地球上所有土壤中的土壤動物[1-2],占據碎屑食物網的多個營養級[3],在土壤有機質分解及土壤養分循環方面有著重要作用[4],是土壤指示生物的典型代表[5]。高寒草甸是青藏高原最為主要的生態系統類型之一,極為脆弱,對人為干擾十分敏感[6]。西藏公路迅速發展[7-8],穿越各類脆弱生態系統,其所產生的重金屬粉塵等[9-10]對距公路一定范圍內的土壤產生影響[11],成為影響公路兩側高寒草甸的潛在環境因子,主要公路源重金屬污染物包括銅(Cu)、鋅(Zn)、鉛(Pb)、鎘(Cd)等[12]。

目前在重金屬對土壤線蟲的影響方面做了一些研究工作,如王贏利等[13]的研究認為重金屬污染會降低稻田線蟲數量,同時改變土壤線蟲群落中的r對策和K對策線蟲的比例；李鈺飛等[14]通過設置重金屬脅迫梯度研究林地和農田土壤線蟲群落特征,發現不同生態類型土壤線蟲多樣性特征隨重金屬銅、鋅濃度的變化規律不一致,較復雜的生態類型中線蟲群落對重金屬的抵抗力較強。此類研究一般采取的是人為控制試驗來探討土壤線蟲群落變化特征,且多使用顯微鏡對線蟲進行形態學分離鑒定,耗時費力[15]。高通量測序技術的發展為環境微生物群落研究提供了便利工具16],被認為有較好的結果一致性[17],也在不同地區土壤線蟲多樣性研究方面[18-20]得到了一些應用,但在青藏高原土壤線蟲研究方面應用還較少[21-22]。

本文利用Illumina Miseq測序技術,在97%相似水平下對所得序列進行生物信息分析,研究青藏高原高寒草甸公路旁的土壤線蟲群落特征,為掌握高寒草甸土壤線蟲群落對重金屬的響應,進一步了解人為干擾下的高寒草甸土壤線蟲群落特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

邦杰塘草原屬西藏林芝市工布江達縣,遠離城市,人口極少。位于尼洋河上游,米拉山東側,海拔平均約4450 m,為高寒草甸。年降水量550 mm,年均氣溫-3.8℃,年均風速3 m/s。主要植物有高山嵩草(Kobresiapygmaea)、紫花針茅(Stipapurpurea)、高山點地梅(Androsacegmelinii)、鵝絨委陵菜(Potentillaansrina)、馬先蒿(Pedicularisreaupinanta)、獨一味(Lamiophlomisrotate)、肉果草(Lanceatibetica)等[23]。邦杰塘草原海拔落差小,人為干擾少,主要受自由放牧影響,拉林高等級公路貫穿其中,采樣點選擇在公路旁的地勢平坦區域,海拔4339 m,坐標92°26′19.9″E,29°54′28.27″N。

1.2 土樣采集和土壤重金屬測定

于2019年8月,在離路基0、5、15、30、50、75 m處布設與公路平行的采樣線,每條采樣線每隔15 m左右布設1個采樣單元,共設3個。各樣線分別編號為P1、P2、P3、P4、P5、P6,表示在距路基不同距離上的樣本。使用土鉆取土樣,裝入塑封袋后儲存在冷藏箱中盡快帶回實驗室。自然風干土樣,去除碎石、根系和各種殘渣。一部分碾碎,過1 mm篩。將粒徑1 mm的土壤充分混合,多點取樣5 g左右,用研缽研細,過孔徑為-0.15 mm篩,采用“硝酸-氫氟酸-高氯酸”消解體系進行消解,采用火焰原子吸收分光光度法(F-AAS)測定全量 Cu、Zn、Pb、Cd。另一部分土樣用以測定土壤線蟲群落特征。

1.3 土壤線蟲群落的高通量測序

1.3.1DNA抽提和PCR擴增

根據E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA抽取質量。采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT- 3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT- 3′引物進行PCR 擴增[16,24]。

1.3.2Illumina Miseq測序

利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.4 數據分析

利用上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺(www.i-sanger.com)分析土壤線蟲群落及其與土壤重金屬之間的關系。使用云平臺mothur軟件,基于OTU水平進行多樣性指數分析,包括Shannon指數、Ace指數和Chao指數。為保證分析在同一水平上進行,分析前進行抽平操作。采用one-way ANOVA進行線蟲數據的統計學檢驗。測序數據比對數據庫是NCBI(NT)。RDA分析利用R語言vegan包,用于探討土壤線蟲群落與重金屬的相關性。采用環境因子排序線性回歸分析重金屬因子對土壤線蟲群落多樣性變異的解釋比例。利用SPSS 20.0軟件分析土壤化學性質數據差異性。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

各樣本土壤化學性質如表1。可見Cu、Pb、Zn、Cd四種重金屬最小值均出現在最遠的P6,且P6的Cu、Pb、Cd與P1—P5差異顯著(P<0.05),Zn與P1、P2差異顯著(P<0.05),但與P3、P4、P5差異不顯著。磷、pH、氮、有效磷在P6也呈現出與其他樣本的差異。

表1 土壤化學性質

2.2 OTU組成

利用物種豐富度指數sobs制作稀釋曲線。如圖1所示,各樣本的sobs稀釋曲線趨于平緩,數據量增加后對OTU無影響,說明所得序列基本可以反映實際環境的土壤線蟲群落結構。

圖1 土壤線蟲測序的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil nematodes communitiesP1—P6分別指離公路0、5、15、30、50、75 m處土樣

不同樣本土壤線蟲群落共同擁有的OTU有10個,如圖2,P1獨有11個OTU,P2獨有2個OTU,P3獨有4個OTU,P4獨有3個OTU,P5獨有2個OTU,P6獨有9個OTU。

圖2 土壤線蟲群落OTU維恩圖Fig.2 OTU Venn diagram of soil nematodes communitiesOTU:操作分類單元 Operational taxonomic unit

2.3 α多樣性

各樣本的α多樣性指標如表2。不同樣本土壤線蟲群落多樣性各指數略有不同,但最小值均出現在P6。其中P6的Shannon指數與P1、P2、P3、P4差異均顯著(P<0.05),與P5差異不顯著；P6的Ace指數與P1、P2、P3、P4、P5差異均顯著(P<0.05)；P6的Chao指數與P1、P2、P3、P4、P5差異均顯著(P<0.05)。以上表明距離公路最遠的P6土壤線蟲群落具有與P1、P2、P3、P4、P5不同的線蟲多樣性特點。

表2 土壤線蟲群落α多樣性

2.4 土壤線蟲群落組成

2.4.1綱水平土壤線蟲群落組成

綱水平土壤線蟲群落分布如圖3。在P1、P2、P3、P4、P5中,一類未分類線蟲綱(unclassified_p_Nematoda)是土壤線蟲優勢群落,分別占各樣本土壤線蟲群落的75.31%、68.90%、70.30%、68.58%、72.54%；其次為刺嘴綱(Enoplea),分別占各樣本土壤線蟲群落的13.30%、18.59%、15.64%、22.41%、22.94%；再次為色矛綱(Chromadorea),分別占各樣本土壤線蟲群落的11.39%、12.51%、14.06%、9.01%、4.52%。但在距公路最遠的P6,土壤線蟲群落分布狀況與P1、P2、P3、P4、P5均有較大不同,色矛綱線蟲(Chromadorea)成為優勢線蟲群落,占68.20%；其次為一類未分類線蟲綱(unclassified_p_Nematoda),占31.40%；刺嘴綱(Enoplea)最少,僅占0.40%。綜上,P6的優勢線蟲群落與P1、P2、P3、P4、P5有很大不同。這可能與土壤狀況有關。

圖3 綱水平土壤線蟲的分布Fig.3 Frequence of class level of soil nematode communities

2.4.2目水平土壤線蟲群落組成

目水平土壤線蟲群落分布如圖4。在P1、P2、P3、P4、P5中,一類未分類線蟲目(unclassified_p_Nematoda)是優勢土壤線蟲群落,分別占各樣本土壤線蟲群落的75.31%、68.90%、70.30%、68.58%、72.54%；其次為矛線目(Dorylaimida)和墊刃目(Tylenchida),但在P3略有不同,P3的小桿目(Rhabdtida)相對較多。與P1—P5比較,在距公路最遠的P6,小桿目(Rhabdtida)為優勢土壤線蟲群落,占59.68%；其次為一類未分類線蟲目(unclassified_p_Nematoda),占31.40%；墊刃目(Tylenchida)最少,僅占8.52%。從各樣本可知,目水平P6的優勢土壤線蟲群落與P1、P2、P3、P4、P5有很大不同。這可能與土壤狀況有關。

圖4 目水平土壤線蟲群落的分布Fig.4 Frequence of order level of soil nematode communties

2.5 土壤線蟲群落與重金屬的關系

線蟲門群落與土壤重金屬的關系如圖5。第一和第二主軸共解釋了門水平土壤線蟲群落相對豐度39.22%的方差變化,其中第一主軸解釋了24.84%的方差變化,第二主軸解釋了14.38%的方差變化。Cu、Pb、Zn、Cd四種重金屬均與線蟲門(Nematoda)正相關。

圖5 線蟲門與重金屬的冗余分析 Fig.5 Redundancy analysis of Nematoda and heavy metal

土壤重金屬與綱水平土壤線蟲群落的關系如圖6。第一主軸和第二主軸共解釋了綱水平土壤線蟲群落相對豐度72.65%的方差變化,其中第一主軸解釋了69.16%,第二主軸解釋了17.18%。Cu、Pb、Zn、Cd四種重金屬互相均呈正相關。第一主軸上的Cu和Pb是最主要的重金屬影響因子,相關系數分別為-0.9933和-0.9979；第二主軸上Cd是最主要的重金屬影響因子,相關系數為-0.5553。四種重金屬均與刺嘴綱(Enoplea)和一類未分類線蟲綱(unclassified_p_Nematoda)群落正相關,與色矛綱(Chromadorea)群落負相關。

圖6 綱水平土壤線蟲群落與重金屬的冗余分析 Fig.6 Redundancy analysis of class level of soil nematode communities and heavy metal

土壤線蟲Chao指數與土壤重金屬Cu、Pb、Zn、Cd的線性回歸結果如圖7,R2依次為0.648365、0.63319、0.55778、0.17770,說明Cu對不同位點線蟲Chao指數差異的解釋度最大,Cd的解釋度最小,Cu、Pb、Zn對土壤線蟲多樣性的影響相對較強。

圖7 土壤線蟲多樣性與重金屬的回歸分析Fig.7 Regression analysis of soil nematode diversity and heavy metals

3 討論與結論

土壤線蟲是對環境因子響應敏銳的一類土壤生物[25]。土壤線蟲群落的分布特征受不同生態類型的影響[14]。試驗區各位點土壤重金屬與西藏土壤環境背景值[26]相比,Cu和Cd均超過背景值,Zn和Pb均未超過。對于試驗區土壤環境背景值的調查尚未報道,但從距公路不同距離土壤重金屬含量來看,較遠的位點土壤重金屬相對較低,理論上更靠近土壤環境背景值。一般在重金屬濃度較高的土壤中,土壤線蟲數量呈下降趨勢[27-28]。由于本研究沒有采用傳統鑒定法,因此未能確定土壤線蟲數量。在青藏高原高寒草甸,先前的研究認為Zn與線蟲門(Nematoda)有較強的負相關性[22],Zn、Cu與綱水平線蟲群落相關性較大[21]。在門水平,本研究認為Zn、Cu等重金屬與線蟲門(Nematoda)有較強的正相關,與綱水平線蟲群落有較大相關,這與先前的門水平研究結果正好相反。此外,在綱、目水平上的線蟲豐度組成與此前的研究差異很大,侯磊等[21]的研究結果表明在一般高寒草甸刺嘴綱(Enoplea)、矛線目(Dorylaimida)線蟲占相對優勢地位。Clarke等[29]認為一定濃度的Cu和Zn刺激線蟲卵孵化過程繼而增加線蟲豐度,因此初步估計在青藏高原高寒草甸內部存在區域之間的土壤線蟲群落結構上的差異,這種差異可能與不同區域土壤重金屬含量有關。當然這種差異還需要在高寒草甸進行系統的土壤線蟲群落調查才可較為深入地分析。

在青藏高原高寒草甸土壤重金屬Cu、Pb、Zn、Cd含量較低的樣本中,土壤線蟲群落結構與重金屬含量Cu、Pb、Zn、Cd較高樣本差異明顯。重金屬含量較低樣本以色矛綱(Chromadorea)和小桿目(Rhabdtida)土壤線蟲為主要群落類型；重金屬含量較高樣本以一類未分類線蟲綱(unclassified_p_Nematoda)和一類未分類線蟲目(unclassified_p_Nematoda)為主要群落類型。說明重金屬含量升高改變了高寒草甸土壤線蟲綱水平和目水平的群落結構,使近自然狀況下的色矛綱(Chromadorea)、小桿目(Rhabdtida)優勢土壤線蟲群落轉變為一類未分類線蟲綱(unclassified_p_Nematoda)、一類未分類線蟲目(unclassified_p_Nematoda)優勢土壤線蟲群落。重金屬Cu、Pb、Zn、Cd含量對土壤線蟲群落α多樣性產生影響。在重金屬含量較低樣本中,Shannon指數、Ace指數、Chao指數比重金屬含量較高樣本均要小,且整體上Shannon指數、Ace指數、Chao指數與重金屬含量較高樣本差異顯著(P<0.05)。重金屬Cu、Pb、Zn、Cd與線蟲門(Nematoda)和刺嘴綱(Enoplea)正相關,但與色矛綱(Chromadorea)負相關。比較而言,在所討論的四種重金屬中,Cu對土壤線蟲群落多樣性變異具有最高的解釋比例,Pb、Zn、Cd對變異的解釋依次減小。本研究未能確定未分類線蟲的綱、目具體名稱,應當豐富對比生物文庫基礎數據,以利于今后土壤線蟲群落的研究。此外,本文未結合線蟲形態學鑒定,因此物種組成分析是基于相對豐度而言的,無法進行定量分析[15,30]。