S-腺苷甲硫氨酸合成酶參與肺炎支原體生物被膜形成

李婷婷，陳春艷,2，余 斕,3，丁偉艷，丁 楠，李水紅，朱翠明

社區獲得性肺炎(CAP)是一種常見的呼吸系統感染性疾病。5歲以下兒童死因中，約16%由CAP所致[1]。肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是社區獲得性肺炎最主要的病原體之一，在兒童和青少年中，10%～30%的CAP是由Mp感染所致，流行期間可達30%～50%[2-3]。除CAP外，Mp感染還與支氣管哮喘的發病密切相關，并可引起腦膜腦炎、心肌炎、動脈粥樣硬化等肺外感染和并發癥[4-5]。

生物被膜(Biofilm，BF)是細菌在生長過程中為適應環境而形成的一種生存狀態。BF的形成增強了細菌的黏附活性，阻擋了抗生素、抗體、補體等對細菌的殺傷。此外，BF內的細菌較浮游細菌彼此之間更易進行信號傳遞、毒力基因及耐藥基因的捕獲和轉移[6]。包括Mp在內的很多支原體在生長過程中可形成BF[7-9]。但目前關于MpBF的研究很少，除Kornspan JD等確定主要黏附蛋白P1是MpBF的組分之一[9]；Simmons WL的研究顯示過氧化氫酶可促進MpBF的生長和產生[10]，此外，目前尚無其他MpBF組成和調節機制的研究。

S-腺苷甲硫氨酸(S adenosyl methionine, SAM)合成酶是SAM在生物體內合成的關鍵限速酶，廣泛存在動物、植物和微生物體內。SAM 合成酶催化 ATP 和 L-甲硫氨酸反應生成SAM，后者作為甲基供體參與多種重要反應。在甲基循環中，SAM提供甲基，使得甲基循環中生成自誘導物-2(Autoinducer-2，AI-2)[11]，AI-2是群體感應(quorum sensing, QS)系統的主要信號分子，可促進BF的形成。已有研究發現，雞毒支原體的SAM合成酶可參與BF的形成[12]。本文初步研究Mp SAM合成酶在BF形成中的作用，為了解MpBF的形成及尋找抗MpBF的制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 支原體液體培養基CM403和固體培養基CM401購自Oxoid公司。西奈芬凈(sc-203263)為Santa Cruz Biotechnology產品；迷迭香酸為Sigma公司產品；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(SK1321)購自上海生物工程公司；SuperReal 彩色熒光定量預混試劑和細菌全基因組DNA提取試劑盒為Tiangen產品；結晶紫購自湘中地質實驗研究所。

1.2菌株來源和分離及鑒 Mp M129菌株(ATCC 29342)為南華大學病原生物學研究所保存。22株Mp 臨床菌株由課題組在2016年1月至2018年12月從南華大學附屬第一醫院兒科呼吸道感染患兒咽拭子標本中分離培養鑒定[13]。

1.3MpBF觀察 參照參考文獻[7-9]對M129及22株Mp臨床菌株進行BF培養，具體如下：24孔板中置入無菌圓玻片，每孔加入1 mL 含1×105顏色變化單位(CCU)的Mp，設置只加培養基孔為對照。37 ℃ 靜置培養5～7 d，取出圓玻片，用PBS輕輕沖洗3次，置于培養皿中，加100 μL 10 g/L的結晶紫溶液染色15 min，吸去染色液，無菌水清洗3次，在光學顯微鏡下觀察MpBF 形成情況。

1.4BF半定量分析 96孔細胞培養板中每孔中加入200 μL 1×105CCU/mL Mp菌液，滴加滅菌液體石蠟后于37 ℃培養5～7 d至Mp生長。輕輕移去上清液，用PBS清洗3次，甲醇固定30 min后晾干，用100 μL 0.5%的結晶紫溶液染色30 min，無菌水洗滌3次后自然晾干，每孔加入200 μL 無水乙醇脫色10 min，酶標儀測定570 nm波長處吸光值。實驗單個樣本均設置3個平行復孔。

1.5實時熒光定量逆轉錄PCR 采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，按說明提取Mp 總 RNA。取 200 ng RNA 用于實時熒光定量逆轉錄 PCR(quantitative Real-time RT-PCR, qRT-PCR)。metX基因引物為: 5′-GTTTGGGTTGAGCGGAAGA-3′和 5′-CCAAAGTGACCGTAAACAGCA-3′。用Mpmpn665基因作為內參，其引物為：5′-TCCCTACCAGAAAACACCGA-3′和5′-CACGG-ATGGAGAACTTACTACCT-3′。在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀 進行如下反應：95 ℃ 3 min 后，進入 95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循環45次。以所得的數據與內參之比作為相對值。

1.6西奈芬凈和迷迭香酸對MpBF形成的影響 將1×105CCU/mL浮游狀態的M129株分別接種于含10～50 μg/mL西奈芬凈和0.5～10 μmol/L的CM403液體培養基，培養5 d后結晶紫染色半定量測定BF形成量，qRT-PCR檢測metX的mRNA。

2 結 果

2.1結晶紫染色觀察MpBF M129菌株分別進行振動和靜置培養5 d，結晶紫染色后光學顯微鏡觀察，靜置培養的M129株可見淡紫色網絡樣團塊膜狀物，而振動培養僅見散在分布的較小膜狀物(圖1)。

圖1 結晶紫染色觀察M129株振動和靜置培養5 d后的BF的形成

2.2MpBF形成呈時間依賴性 分別靜置和振動培養M129菌株，半定量實驗結果表明M129菌株在靜置培養第5 d時BF的形成量相對最高。振動培養無明顯BF形成(圖2)。

①：P<0.05；②：P<0.01

2.3Mp臨床株BF半定量分析 對23株Mp菌株進行BF半定量分析，結果顯示，與振動培養組比較，13株Mp(56.5%，13/23)的BF形成量顯著增高(tM129標準株=28.91，tM119=17.46，tM99=27.05，tM28=7.49，tM134=17.46，tM17=13.78，tM15=12.90，tM42=13.87，tM82=29.42，tM21=14.99，tM71=14.15，tM118=13.73，tM34=8.80，P<0.05)；10株(43.5%，10/23)Mp的BF形成量與振動培養組差異無統計學意義(tM120=3.03，tM122=1.54，tM10=3.59，tM101=3.35，tM126=3.40，tM4=3.35，tM9=3.40，tM49=3.86，tM100=4.61，tM132=1.49，P>0.05)(圖3)。

①: 與振動培養比較，P<0.05

2.4metXmRNA在BF形成能力不同的Mp菌株的相對轉錄水平 分別挑選3株不能形成BF的Mp株(M120、M122、M132)和3株形成BF能力強的Mp株(M129、M82、M99)，qRT-PCR檢測其靜置培養5 d后SAM合成酶基因(metX)的mRNA相對表達水平。結果表明3株形成BF能力強的Mp株metX基因的轉錄水平顯著高于不能形成BF的菌株(P<0.05)(圖4)。

①：與不能形成BF的菌株比較，P<0.05

2.5西奈芬凈和迷迭香酸對MpBF的作用呈濃度依賴性 將Mp分別接種于含不同濃度西奈芬凈或迷迭香酸的CM403培養基，5 d后結晶紫染色半定量分析結果顯示，與對照未處理組比較，10～50 μg/mL的西奈芬凈均能顯著減少MpBF的形成。0.5～5.0 μmol/L的迷迭香酸均可促進MpBF的產生，以2.0 μmol/L 迷迭香酸刺激產生的MpBF最多。10.0 μmol/L可顯著減少MpBF的形成，因為高濃度的迷迭香酸有抗菌作用，可抑制Mp的生長繁殖(圖5)。

A：西奈芬凈處理；①：10～50μg/mL西奈芬凈處理vs未處理，P<0.05；B：迷迭香酸處理；②：0.5～5.0μmol/L迷迭香酸處理vs未處理，P<0.05

2.6西奈芬凈和迷迭香酸對MpBF形成的作用 30 μg/mL西奈芬凈處理3株BF形成能力強的菌株(M129、M99、M82)，5 d后結晶紫染色半定量檢測BF形成，發現3株Mp的BF形成量均較未處理組顯著減少(tM129=13.80,P<0.01;tM82=5.261,P<0.05;tM99=12.35，P<0.01)。將3株不能或形成BF能力弱的Mp株(M120、M122、M132)在含2.0 μmol/L的迷迭香酸中培養5 d后，半定量檢測結果顯示，此3株Mp形成的BF量均較對照未處理組顯著增加(tM120=6.279,P<0.05;tM122=81.86,P<0.01;tM132=5.063，P<0.05)(圖6)。

A：西奈芬凈處理；B：迷迭香酸處理；①：處理組vs未處理，P<0.05

2.7西奈芬凈和迷迭香酸處理后metX轉錄水平改變 30 μg/mL西奈芬凈作用于3株BF形成能力強的Mp菌株后，qRT-PCR檢測未處理菌株和西奈芬凈處理菌株metXmRNA相對表達水平，結果顯示3株西奈芬凈處理菌株metXmRNA相對表達水平均較未處理組顯著減少(tM129=12.05,P<0.01;tM82=11.88,P<0.01;tM99=8.682，P<0.05)。2.0 μmol/L的迷迭香酸刺激3株BF形成能力弱(或不能形成BF)的Mp菌株后，其metXmRNA的轉錄水平均較對照未處理組顯著增加(tM120=4.953,P<0.05;tM122=5.939,P<0.05;tM132=9.156，P<0.05)(圖7)。

A：西奈芬凈處理；B：迷迭香酸處理；①：處理組vs未處理，P<0.05

3 討 論

細菌黏附在有生命或無生命材料表面后，細菌及其分泌的胞外多糖、DNA和蛋白質等一起形成BF。BF是細菌普遍的生存狀態，超過80%的人類細菌感染是由BF引起的[14]。我們檢測了23株Mp體外形成BF的能力，結果顯示在細胞培養板上靜置培養5 d后Mp形成的BF最多。23株Mp中有13株(56.5%)可在96孔培養板中形成較強的BF，10株Mp(43.5%)不能形成BF或形成BF的能力弱。

BF形成過程中，大約50%的蛋白發生改變，BF菌中多種黏附蛋白、糖蛋白、應激蛋白和纖維蛋白等的表達較浮游菌顯著上調。我們的實驗發現，MpBF形成能力強的菌株中SAM合成酶基因(metX)的表達水平顯著高于BF形成能力弱的菌株，表明SAM合成酶可能參與MpBF的形成。SAM合成酶可能是通過催化生成QS系統的前體物質SAM，促進AI-2的分泌，增強群體感應而促進MpBF形成。

西奈芬凈是一種腺苷衍生物，其結構與SAM類似但無甲基轉移酶的活性，可抑制DNA、RNA、蛋白和其他分子的轉甲基化反應[15]，減少AI-2的合成，進而減少群體感應而抑制BF形成。Yadav MK發現西奈芬凈可抑制肺炎鏈球菌BF的形成[16]。我們用西奈芬凈處理Mp后發現BF 的形成減少，且metXmRNA的相對轉錄水平亦顯著降低。迷迭香酸是革蘭氏陰性菌的QS信號分子，功能類似于高絲氨酸內酯，能促進QS系統相關基因表達和BF的形成[17]。我們用迷迭香酸刺激Mp后，發現其BF形成量增加，且metXmRNA的相對表達量亦顯著增加。這些結果進一步表明SAM合成酶參與MpBF的形成。SAM合成酶有望成為研發MpBF抑制劑的靶點。

目前兒科治療Mp感染首選大環內酯類抗生素，但近年來，我國80%以上的Mp分離株對大環內酯類抗生素耐藥[18-19]。BF的形成是導致Mp對抗生素形成高度耐藥和多重耐藥的重要原因之一，研發有效的抗MpBF的藥物有重要意義。西奈芬凈是從灰質鏈霉菌中分離出來的藥物，有抗真菌和抗惡性瘧原蟲、利什曼原蟲等寄生蟲的作用[15,20]，最近發現其對寨卡病毒和SARS-Cov-2也有明顯的抑制作用[21-22]。但在進行西奈芬凈抗寄生蟲實驗時, 發現其對犬和山羊具有毒性, 故未在臨床上推廣應用[23]。本研究發現西奈芬凈可顯著抑制MpBF的形成，因此，若以西奈芬凈為基礎，研發出新的、無明顯毒副作用的抗MpBF制劑可為Mp感染的治療提供有效藥物。

利益沖突：無