牛羊奶中環(huán)丙氨嗪殘留的液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測技術(shù)研究

王亦琳，尹 暉，葉 妮，李 丹，孫 雷，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

環(huán)丙氨嗪(cyromazine, 化學(xué)式C6H10N6)又稱滅蠅胺，是一種高效的三嗪類昆蟲生長抑制劑類殺蟲劑[1]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。該藥物能有效控制動物畜禽舍以及周圍環(huán)境中的有害昆蟲，并促進動物生產(chǎn)性能，因此,該藥在畜牧業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。臨床上環(huán)丙氨嗪主要作為預(yù)混劑拌入全價飼料中，通過飼喂方式進入動物體內(nèi)，大部分以原形及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺(melamine)的形式隨糞便排出體外，并沉積在糞便中以殺滅糞便中的蠅蛆[2]。其作用原理為通過誘使蠅蛆在形態(tài)上發(fā)生畸變，使成蟲羽化不全或受到抑制，從而達到控制蠅蛆過量繁殖的目的。由于在畜牧生產(chǎn)中濫用環(huán)丙氨嗪，造成動物性食品中環(huán)丙胺嗪的殘留，可能通過食物鏈使得消費者的身體健康受到損害[3-4]。美國國家環(huán)保局(EPA)在1993年將環(huán)丙氨嗪列為具有潛在致癌性的化合物[5]，美國和我國都對環(huán)丙氨嗪在動物性食品中的限量做了嚴格規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年發(fā)布的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)[6]中，規(guī)定了該藥物在羊的泌乳期禁用，但并未規(guī)定牛奶中環(huán)丙氨嗪的最大殘留限量，參照羊泌乳期禁用情況，一起進行牛羊奶中環(huán)丙氨嗪的殘留檢測技術(shù)研究。目前國內(nèi)外已經(jīng)報道的動物性食品中環(huán)丙氨嗪的殘留檢測分析方法主要有液相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因為分離能力強，選擇性好，可以實現(xiàn)復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量成分的分析，并且樣品前處理相對簡單，應(yīng)用最為廣泛。本文擬建立一種液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測方法。

圖1 環(huán)丙氨嗪化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of cyromazine

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A液相色譜儀-美國AB SCIEX公司QTrap 6500質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)； AE260電子天平，Mettler Toledo公司； Biofuge Strators高速冷凍離心機，賀利氏公司； SIR4渦旋混合器，IKA公司；固相萃取裝置，Waters公司；Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司。

1.2 藥品和試劑 環(huán)丙氨嗪對照品(C6H10N6，CAS：66215-27-8)，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量≥98.0%；環(huán)丙氨嗪同位素對照品(C313C3H10N6，CAS：1808990-94-4)，含量≥99.4%。甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、乙酸銨(色譜純)，美國Fisher公司；三氯乙酸(分析純)、氨水(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Oasis MCX固相萃取柱：60 mg/3 mL，美國Waters公司；所用水為超純水。

1.3 樣品來源 從北京市超市采購了幾種不同品牌的牛羊奶樣品，選擇無環(huán)丙氨嗪藥物殘留，且基質(zhì)背景較為干凈的樣品作為空白樣品。

1.4 標準溶液配制 精密稱取環(huán)丙氨嗪對照品約10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪標準儲備液；精密稱取環(huán)丙氨嗪-13C標準品約10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標儲備液。精密量取1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪標準儲備液100 μL于100 mL量瓶中，用95%乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為1 μg/mL的環(huán)丙氨嗪標準工作液；精密量取1 mg/mL的環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標儲備液100 μL于100 mL量瓶中，用95%乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為1 μg/mL的環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標工作液。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品的提取 稱取牛奶或羊奶各(2±0.02)g于50 mL離心管內(nèi)，加入適量環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標工作液，加入3%三氯乙酸水溶液8 mL，渦旋混合30 s, 超聲提取10 min，靜置10 min，10000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.5.2 樣品的凈化與濃縮 MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化；取備用液全部過柱，用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL淋洗，真空抽干；用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫，收集洗脫液，于50 ℃水浴氮氣吹干，殘余物用95%乙腈水溶液1.0 mL充分溶解，取適量體積過微孔濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱為BEH HILIC色譜柱(50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm)，流動相A相為20 mM乙酸銨水溶液；B相為乙腈，梯度洗脫：0～1 min保持95% B；1～3 min，95% B線性變化到60% B；3～3.1 min 60% B線性變化到95% B；3.1～4.5 min保持95% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；電噴霧電壓為5500 V；離子源溫度為550 ℃；輔助氣1為55 psi；輔助氣2為55 psi；氣簾氣為30 psi；碰撞氣為High；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測聯(lián)合信息依賴性采集與增強子離子掃描模式(MRM-IDA-EPI)。環(huán)丙氨嗪定性、定量離子對及對應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量見表1。IDA參數(shù)：①使用動態(tài)背景扣除功能；②從不排除之前的目標離子；③觸發(fā)閾值：100 cps。EPI參數(shù)：①掃描范圍：m/z70～180；②掃描速度：10000 Da/s；③CE：25 ev；CES：10 ev。

表1 環(huán)丙氨嗪及同位素內(nèi)標MRM參數(shù)Tab 1 Mass parameters of cyromazine and its isotopic internal standard

1.7 標準曲線的制備 精密量取環(huán)丙氨嗪標準工作液和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標工作液適量，用95%乙腈水溶液稀釋成含環(huán)丙氨嗪濃度分別為0.5、1、2、5、10和20 ng/mL(含環(huán)丙氨嗪-13C均為2 ng/mL)的系列標準工作液，由低濃度到高濃度依次上機測定。以環(huán)丙氨嗪和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標的特征離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標，環(huán)丙氨嗪標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.8 方法準確度及精密度的測定 采用標準添加法，在空白牛奶和羊奶中添加定量限、中、高三個濃度的環(huán)丙氨嗪標準工作液和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標工作液。每種濃度5個樣品平行試驗，重復(fù)3次，按照1.4項樣品前處理方法處理之后上機測定，同位素內(nèi)標法定量，計算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.9 方法靈敏度確定 添加適量濃度的環(huán)丙氨嗪標準工作液于2 g空白牛奶和羊奶中，經(jīng)前處理后測定，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N) 和對應(yīng)藥物濃度，以S/N>3(按PtP算)作為方法的檢測限，以S/N>10作為方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 在通常的MRM檢測模式中，通常選擇一個母離子和兩個響應(yīng)較強的子離子進行定性分析。但在動物源食品的殘留檢測實際工作中，由于待測樣品的基質(zhì)含有蛋白質(zhì)、脂肪以及內(nèi)源性組分等多種干擾物質(zhì)，檢測中經(jīng)常會出現(xiàn)基質(zhì)干擾峰，影響定性和定量的準確性。本研究采用MRM-IDA-EPI檢測模式，可以在利用MRM精確定量的同時，得到目標子離子的二級全掃描質(zhì)譜圖(EPI圖)，通過與對照溶液的EPI圖進行對比，可以更加準確地做出定性判斷，排除假陽性。圖2是環(huán)丙氨嗪陽性添加樣品和對照溶液的EPI圖，可以發(fā)現(xiàn)兩者的特征子離子匹配度很高。按照一個母離子1個識別點(IP)點，一個子離子1.5個IP點計算，圖2中主要有5個特征子離子，共8.5個IP點，超出了歐盟2002/657/EC[14]規(guī)定的禁用獸藥，確證檢測至少有4個IP點的要求，進一步提高了動物源食品復(fù)雜基質(zhì)中定性的準確性。

1—環(huán)丙氨嗪空白牛奶添加樣品；2—環(huán)丙氨嗪對照溶液1—blank milk sample added with cyromazine；2—standard solution of cyromazine圖2 環(huán)丙氨嗪的EPI圖Fig 2 EPI chromatogram of cyromazine

2.2 標準曲線 以環(huán)丙氨嗪和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標的特征離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標，環(huán)丙氨嗪標準溶液濃度為橫坐標作圖，得到相應(yīng)的標準曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)見表2。環(huán)丙氨嗪在0.5～20 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積之比與濃度呈良好的線性關(guān)系，R2>0.990。

表2 環(huán)丙氨嗪標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab 2 Regression equations and correlation coefficients of cyromazine

2.3 方法靈敏度 按1.9項中所述方法進行處理，依據(jù)環(huán)丙氨嗪特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>3和S/N>10分別為方法的檢測限和定量限，得出在空白牛奶和羊奶中，環(huán)丙氨嗪的檢測限均為0.2 μg/kg，定量限均為0.5 μg/kg，特征離子質(zhì)量色譜圖見圖3。

1—牛奶；2—羊奶1—milk；2—goat milk圖3 0.5 μg/kg空白牛奶和羊奶添加樣品中環(huán)丙氨嗪藥物特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 3 Characteristic ion mass chromatogram of cyromazine 0.5 μg/kg added in blank milk and goat milk

2.4 方法準確度及精密度 在空白牛奶和羊奶中各添加3個不同濃度的環(huán)丙氨嗪標準工作液和環(huán)丙氨嗪-13C內(nèi)標工作液進行回收率試驗，結(jié)果匯總見表3。試驗結(jié)果表明，環(huán)丙氨嗪在牛奶和羊奶0.5～5 μg/kg添加濃度水平上的回收率在98.4%～106%范圍內(nèi)；批內(nèi)RSD在0.795%～2.45%之間，批間RSD在4.86%～5.68%之間。結(jié)果表明本方法定量準確，重復(fù)性好。

表3 空白牛奶和羊奶中環(huán)丙氨嗪添加的回收率(n=5)Tab 3 Recoveries of cyromazine in blank milk and goat milk

3 討論與結(jié)論

目前國內(nèi)外關(guān)于牛羊奶中環(huán)丙氨嗪殘留檢測的報道較少[8,10-11]。與現(xiàn)有國內(nèi)外文獻相比, 本研究主要的優(yōu)點是較大幅度地提高了方法定性的準確性。由于牛奶和羊奶屬于動物性樣品，基質(zhì)比較復(fù)雜，在使用通常的MRM方法檢測時，尤其是禁用藥物在定量限濃度附近，雜質(zhì)容易干擾目標峰。樣品中離子對豐度比與對照溶液相比，容許偏差易超出歐盟2002/657/EC[14]中的規(guī)定，對目標物的確證帶來一定的困難。本研究使用的三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(Qtrap)是以傳統(tǒng)的三重四極桿離子路徑為基礎(chǔ)，第三個四極桿(Q3)既可以用作三重四極桿，也可以用作線性離子阱，使得儀器同時具有三重四極桿的準確定量功能和線性離子阱的高靈敏度定性功能[15-16]。利用該特點，建立了MRM-IDA-EPI的質(zhì)譜分析方法，可以在MRM定量的同時，獲得高靈敏度的增強子離子掃描的質(zhì)譜圖。在樣品分析時，儀器首先進行探測掃描，采集化合物的MRM離子對信息。然后系統(tǒng)自動判斷，當采集到的MRM信號強度超過設(shè)定的閾值時(本研究中設(shè)為100 cps)，系統(tǒng)就會自動切換為線性離子阱模式，進行增強子離子掃描(EPI)，獲得相應(yīng)母離子的高質(zhì)量的二級質(zhì)譜全掃描圖。在實際樣品檢測時，可將樣品與對照品或者實驗室已經(jīng)建立好的EPI譜庫中的二級子離子圖進行對比，比較兩者的特征離子的分布及強度，進而做出更為準確地判斷。該方法豐富了樣品定性所需要的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，提高了低濃度水平下目標化合物判定的準確性[17]。

同時，本文的樣品前處理過程比較簡單。利用3%三氯乙酸水溶液一步提取待測組分并沉淀蛋白。針對環(huán)丙氨嗪為堿性化合物，本研究選用了對堿性化合物保留較好的MCX固相萃取柱進行樣品凈化，獲得了滿意的凈化效果。本文在定量方法選擇時采用了同位素內(nèi)標法進行定量。同位素內(nèi)標和分析物的結(jié)構(gòu)相似，和分析物在樣品基質(zhì)中的表現(xiàn)一致，可以有效消除牛羊奶基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高方法定量的準確性。下一步，本實驗室會進一步研究環(huán)丙氨嗪及類似物在更多動物組織中的殘留檢測方法，擴大方法的適用范圍，以便更好的滿足實際工作的需求。

本文采用液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)建立了一種可檢測牛奶和羊奶中環(huán)丙氨嗪殘留的分析方法。該方法在進行MRM采集的同時，采用IDA-EPI模式又可以獲得目標分析物子離子的完整二級質(zhì)譜信息，同時實現(xiàn)了定性和定量，可以有效防止假陽性的產(chǎn)生。同時該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法靈敏度，準確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。