小鼠細菌性乳腺炎模型研究進展

吳有華，劉雪松，楊慶穩*

(1.重慶三峽職業學院，重慶404155; 2. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾161005)

奶牛細菌性乳腺炎一直是困擾著奶牛養殖行業發展的重大難題，受到越來越多學者的廣泛關注。但是，如果直接將奶牛作為試驗動物進行乳腺炎研究，其巨大的花費和苛刻的飼養條件讓許多研究無法實施。因此，研究人員急需建立一種成本低、操作簡單且穩定的細菌性乳腺炎模型進行研究。隨著模型研究的不斷深入，以小鼠為模式動物構建的細菌性乳腺炎模型逐漸成型，具有成本低、操作簡單且穩定的特點。20世紀70年代Chandler首次發表了小鼠細菌性乳腺炎模型的文章[1]。在隨后的幾年里，Chandler以及Anderson等人發表了多篇關于小鼠細菌性乳腺炎的文章，詳細敘述了模型的建立方法以及相關特征[2-3]。隨著技術進步，研究人員對細菌在小鼠乳腺內部的增殖方式以及相關病理變化等情況掌握得更加清晰；并與牛乳腺內部情況進行了詳細的對比，認為可以使用小鼠模型進行細菌性乳腺炎相關研究。然而，不可否認的是，小鼠細菌性乳腺炎模型與奶牛細菌性乳腺炎還是有許多的不同。但是許多文章報道，小鼠細菌性乳腺炎的病理變化在很多方面都與奶牛細菌性乳腺炎相似，例如都會發生中性粒細胞浸潤等現象[4]。因此，可以對小鼠模型上獲得的數據進行謹慎科學地分析，從而為奶牛細菌性乳房炎的防治提供參考。

1 小鼠乳腺結構

小鼠從頭到尾共有五對乳腺。乳腺是一個復管泡狀腺體。乳腺實質包括腺泡和導管兩個部分。每一個乳管分支及其所屬腺泡組成乳腺小葉，若干乳腺小葉組成乳腺葉，腺上皮為單層立方上皮。小葉結締組織成為乳腺間質。乳腺間質內由富含血管、淋巴管和神經纖維的疏松結締組織和脂肪組織構成，具有支持和營養作用。每一個乳腺葉各有一條導管引流至乳頭，稱為輸乳管。輸乳管在乳頭基部膨大呈囊狀稱為乳竇。乳竇遠端的輸乳管口徑縮小，最后開口于乳頭[5]。根據小鼠乳腺發生和發育的特征，可以將小鼠的乳腺生長大致分為5個時期：胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期。泌乳期時可見乳腺處于全面活躍的狀態，結締組織和脂肪組織大量退化，被新發育的腺泡代替。在經歷泌乳期后，乳腺開始退化，退化時的乳腺腺泡逐漸消失，被脂肪組織和結締組織取代，最后被脂肪組織和結締組織分割，回到妊娠前的水平，等待下一輪的妊娠[6]。

2 小鼠細菌性乳腺炎模型的建立

2.1 細菌種類 目前，小鼠細菌性乳腺炎模型常用到的細菌種類包括了大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)以及銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等[1]。這些細菌都是容易引起奶牛乳腺炎的常見細菌，嚴重影響奶牛健康。

2.2 急性乳腺炎模型 小鼠具有5對乳腺，3對在胸部，2對在腹部。研究人員通常在第4對乳腺處進行乳腺炎模型的建立，因第4對乳腺最大且最容易獲取到[7]。一般在攻菌前的1～2 h將已經接受母乳4～15 d的幼鼠與母鼠分離[8]。將母鼠進行麻醉，待母鼠完全麻醉后，仰臥保定母鼠，并且充分暴露其第4對乳腺。術者用75%酒精對乳房及其相應區域進行消毒，剪下一塊小于1 mm的組織，用小于30-gauge的注射器將50～100 μL的菌液注射到小鼠乳腺內；注射的深度不應超過3～4 mm。第4對乳腺的左右兩側乳腺均可進行如上操作[9]。

2.3 慢性乳腺炎模型 按照2.2所述方法建立的乳腺炎模型小鼠通常會在2～3 d內死亡，此種方式所建立的小鼠乳腺炎模型被稱為急性小鼠乳腺炎模型[10-11]。與急性乳腺炎相比，臨床上較難治療的是慢性乳房炎[12]，因此急切需要建立慢性乳腺炎模型以滿足臨床試驗需要。科研人員在原有方法的基礎上，對上述模型建立方法進行改良，從而建立慢性乳腺炎模型。該方法的操作是在向乳腺注射細菌菌液前的幾小時，通過注射內毒素來達到這種造模要求[13-14]。在注入細菌之前接種內毒素會促進小鼠中性粒細胞浸潤，這種方式造成的中性粒細胞浸潤不會阻止感染的發生，但是會吞噬細菌；與急性小鼠乳腺炎模型相比，在小鼠乳腺內的細菌數量會相對減少[4]，從而導致細菌在乳腺體內的持續感染[15]。

2.4 小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型 小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型是最常用的小鼠細菌性乳腺炎模型，也是目前為止較為完善的小鼠乳腺炎模型之一。小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型多用于藥物治療效果、相關保護機制以及金黃色葡萄球菌小菌落突變株的研究[4]。現階段，小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型的多樣性主要體現在兩個方面，一個是細菌菌株的不同，另一個是小鼠品系的不同。模型中用于接種的細菌類型可分為模式菌株以及臨床菌株。模式菌株多用美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)中的細菌，如ATCC29740(Newbould 305)以及ATCC35556(SA113)等[4,7]。臨床菌株則因采集地不同而不同，但常用奶牛乳腺炎中分離出的金黃色葡萄球菌，也有用耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)進行相關研究[16]。就小鼠品系而言，國外多用BSVS、Compton white 以及Swiss小鼠品系[4]，而國內主要使用ICR、BALB/C以及昆明小鼠品系[17-18]。通常情況下，當將金黃色葡萄球菌菌液注入小鼠乳腺24 h后，乳腺內細菌量可以達到108～1010CFU/乳腺[4,17]。由于小鼠乳腺內存在乳汁且缺乏中性粒細胞，金黃色葡萄球菌可以在乳腺內很好的生長。與小鼠相比，奶牛乳腺內的中性粒細胞較多，容易發生金黃色葡萄球菌慢性乳腺炎[19]。金黃色葡萄球菌的細胞內感染被認為是造成持續感染的關鍵因素。在小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型中，細菌感染后的12～24 h內，可以在吞噬細胞以及上皮內觀察到病原體；同時細菌也可從乳腺轉移到其他器官[20]。

3 乳腺炎癥評估方法

小鼠細菌性乳腺炎模型的炎癥評估方法有很多種，最常用的就是乳腺菌落計數法。通常是將感染后的小鼠乳腺在無菌環境下放入到無菌生理鹽水中，進行組織勻漿，將勻漿液進行菌落計數[7,21]。在奶牛乳腺炎中，經常使用體細胞計數(Somatic cell count，SCC)來評估奶牛乳腺炎的嚴重程度。在小鼠細菌性乳腺炎模型中，也可以用此方法對乳腺炎癥情況進行評估[22]。對乳腺組織進行病理切片可以有效地觀察組織損傷，從而掌握乳腺炎嚴重程度[11]。此外，應用相應的ELISA試劑盒對炎性因子進行測定，如測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)以及白介素6(IL-6)等，也可以間接反映出炎癥的狀況。

4 小鼠乳腺炎模型的應用

4.1 藥物效果研究 小鼠細菌性乳腺炎模型可以應用于多種研究，其中在藥物效果研究上使用的較為廣泛。Chandler用小鼠細菌性乳腺炎模型對青霉素類藥物的乳腺炎治療效果進行了研究[2]。張琳用小鼠乳腺炎模型探究了黃芩莖葉對金黃色葡萄球菌乳腺炎的治療效果[23]。高瑞娟等使用小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型以及小鼠大腸桿菌乳腺炎模型對蒙藥成分復方的藥效進行了研究[24]。PK/PD模型是一種可以通過科學的計算為動物用藥提供合理劑量的模型，經常在獸藥領域中使用[25-26]。PK/PD模型經常與小鼠細菌性乳腺炎模型聯合使用，為臨床用藥治療細菌性乳腺炎提供合理的用藥劑量以及預測現有用藥劑量的有效率。Yu等分別建立了頭孢喹肟對于小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎以及小鼠大腸桿菌乳腺炎的PK/PD模型，結果表明，在小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型中，為使細菌數量下降1.8 logCFU/乳腺，所需的PK/PD靶值%T>MIC為35.98%，AUC/MIC為137.43 h，用這個數據可以為頭孢喹肟治療金黃色葡萄球菌乳腺炎提供一定的依據[7]。其研究團隊另一個研究顯示，通過小鼠大腸桿菌乳腺炎模型得出了頭孢喹肟能夠有效治療大腸桿菌乳腺炎的劑量[27]。劉雪松建立了頭孢喹肟對小鼠無乳鏈球菌乳腺炎體內PK/PD模型，獲得了頭孢喹肟治療無乳鏈球菌乳腺炎在不同抗菌情況下的PK/PD靶值，為臨床用藥提供了依據[11]。PK/PD模型與小鼠細菌性乳腺炎模型的聯合使用可以為臨床用藥治療細菌性乳腺炎提供指導意義，也可以讓研究人員更好地利用小鼠細菌性乳腺炎模型有效進行藥效研究。

4.2 相關機制研究 該模型可用于細菌性乳房炎的相關機制研究，其中包括細菌的感染機制以及某種藥物對細菌性乳腺炎的治療機制。修磊建立了小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型對γδT細胞在金黃色葡萄球菌乳腺感染中起到的作用以及機制進行了研究[28]。呂琛等通過建立小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型得出了IL-2以及IL-4參與了小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎的發生與發展[20]。李炎燚等探究了瓜蔞提取物對小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎的保護作用以及相應機制[29]。王天成利用小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型探究了甜菊苷的保護作用以及相應機制[30]。Jacobsen于1910年分離得到一種異常的傷寒埃伯澤氏菌株，并根據其特殊的表型命名為小菌落突變株(small colony variants，SCVs)[31]。從此，人們逐漸在許多細菌中分離得到了小菌落突變株，其中金黃色葡萄球菌的小菌落突變株情況較為突出[32]。小菌落突變株已經被證明在宿主體內更容易生存、更容易逃避藥物治療以及可引起持續性感染[33-34]。運用小鼠細菌性乳腺炎模型可以探究抗菌藥物對小菌落突變株引起的乳腺炎的治療效果以及相應的治療機制，為小菌落突變株引起的乳腺炎治療提供幫助。Brouillette等用小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型驗證了頭孢菌素對金黃色葡萄球菌小菌落突變株引起的乳腺炎的治療效果，并簡要闡述了治療機制[35]。朱立力等將金黃色葡萄球菌小菌落突變株引起的小鼠乳腺炎與普通株引起的小鼠乳腺炎進行了對比，并對金黃色葡萄球菌小菌落突變株引起慢性乳腺炎的機制進行了研究，為小菌落變異株慢性乳腺炎的相關研究奠定了基礎[36]。

4.3 細菌毒力因子的研究 多年來，研究人員利用小鼠細菌性乳腺炎模型對幾種細菌毒力因子進行了相關研究。Jonsson等利用小鼠細菌性乳腺炎模型對金黃色葡萄球菌的毒力因子進行研究，確定了α溶血素(hla)以及凝固酶(coa)為金黃色葡萄球菌的毒力因子[37]。Chen等通過構建細菌突變株以及建立突變株小鼠乳腺炎模型，確定了轉肽酶A(SrtA)是金黃色葡萄球菌誘發乳腺炎的關鍵毒力因子，并且探究了相應的感染機制[38]。小鼠細菌性乳腺炎模型因其具有體積小的優點，在對假定的毒力因子進行驗證時具有良好的效果，被廣泛使用在相關研究中。

4.4 腸道菌群與乳腺炎關聯性的研究 腸道菌群是動物機體重要的組成部分，它們是一個種類繁多且數量極為龐大的微生物群體。越來越多的研究表明腸道菌群的紊亂與糖尿病以及肥胖等疾病的引發也有關系[39]。隨著研究的逐漸深入，研究人員發現腸道菌群的紊亂與乳腺炎的發生也有關聯[40]。因此，越來越多的研究人員使用小鼠細菌性乳腺炎模型進行腸道菌群與乳腺炎關聯性研究。胡曉宇通過對比正常小鼠、腸道菌群紊亂小鼠以及糞便移植小鼠建立的小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型，得出腸道菌群紊亂導致小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型中乳腺損傷更加明顯，表明腸道菌群紊亂可以誘發乳腺炎[41]。劉凡銘等通過建立小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型進行了乳腺炎小鼠腸道菌群的改變與炎性因子的相關性分析，得出乳腺炎的發生和進展與腸道菌群的平衡有著密切關系[42]。小鼠腸道菌群情況與奶牛瘤胃內菌群情況確實有著很大的不同，但是通過小鼠細菌性乳腺炎模型的腸道菌群情況與乳腺炎關聯性的研究，可以為乳腺炎的防控技術及相關產品的研發提供新的方向。

5 展望與小結

目前，小鼠細菌性乳腺炎模型在乳腺炎研究領域中應用較為廣泛。一些新的技術也可應用在該模型上，例如應用信號標簽誘導技術(Signature-tagged mutagenesis，STM)對細菌在體內表達的毒力基因進行辨別[43]。正是因為小鼠乳腺炎模型具有體積小、易操作等優勢，使得更多的新技術能夠在乳腺炎模型中得以應用。現階段，許多中藥對細菌性乳腺炎的治療效果以及相關機制研究都是在小鼠乳腺炎模型基礎上進行驗證，為中藥治療細菌性乳腺炎提供了理論基礎。相信隨著研究的深入，小鼠細菌性乳腺炎模型會應用到更多的研究中，為乳腺炎的防治提供支持。