不同圖形刺激對小鼠圖形視覺誘發電位的影響

王玨，馬博文，張偉，史學鋒

視覺誘發電位（visual evoked potentials，VEP）是從視皮層腦電活動中提取的視覺刺激誘發的電生理信號，反映視覺通路功能的完整性，是一種客觀、有效的檢查方法，可為視覺系統疾病的診斷提供重要依據［1-2］。其刺激模式主要包括圖形刺激和閃光刺激，常用的圖形刺激主要有翻轉棋盤方格刺激和光柵刺激。由于閃光視覺誘發電位（flash visual evoked potential，FVEP）個體間變異較大，一般只在屈光介質透明度差或注視不佳時采用［3］。圖形視覺誘發電位（pattern visual evoked potential，PVEP）在波形和時序上的變化較小，因此其在眼科臨床檢查中常作為首選。臨床檢查通常使用翻轉棋盤方格刺激來評估患者的視覺功能［4-5］。然而，在動物電生理研究方面，國際臨床視覺電生理協會（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）尚未出臺相應標準［3］，翻轉棋盤方格［6-7］、水平［8-9］或垂直［10］光柵圖形都可被用來評估動物的視覺功能。小鼠的基因序列與人類具有高度相似性，已成為眼科與視覺科學研究中最常用的模式動物。然而，相比于體積較大的動物，要在小鼠上記錄到穩定的PVEP波形較為困難，并且不同的圖形刺激在小鼠PVEP檢測中是否存在差異，哪種刺激更具有優勢，鮮見詳細報道。本研究采用腦表面埋置電極的記錄方法，獲得了高質量的小鼠PVEP結果，分析了水平光柵刺激、垂直光柵刺激和翻轉棋盤方格刺激在小鼠PVEP檢測方面的具體差異，以期為更好地開展眼科與視覺科學相關研究提供基礎性數據。

1 材料與方法

1.1 材料 22只6周齡SPF級C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量16～20 g，均為雄性，屈光間質清晰透明無病變。飼養環境通風良好，溫度18～26℃，12 h/12 h明暗交替環境下飼養，飼養條件符合醫學實驗動物飼養要求（倫理審查編號：IRM-DWLL-2020124）。

1.2 方法

1.2.1 電極埋置 小鼠行5%水合氯醛腹腔注射（10μL/g）麻醉后，將其頭部固定于立體定位儀上，雙眼涂眼膏或硅油保持角膜濕潤。手術過程中，使用不透明黑布遮蓋雙眼防止顯微鏡燈光照射損傷小鼠視網膜，術中體溫維持在36.5℃。碘伏消毒后剪去小鼠顱骨表面的皮毛，完全暴露顱骨前囟與后囟，清除顱骨表面的皮下筋膜組織。于記錄眼對側初級視皮層雙眼區（V1B區）對應位置（后囟旁3 mm）開一直徑約1.5 mm的顱窗，暴露硬腦膜。在硬腦膜表面放置自制金屬記錄電極。于記錄眼同側鼻骨處，采用相同的方法開顱窗并埋置參考電極（圖1）。最后用牙科水泥完全覆蓋暴露的顱骨。待小鼠在加熱毯上蘇醒后再將其放回籠中。

Fig.1 The implantation of the recording electrode and the reference electrode圖1 記錄電極與參考電極的埋置

1.2.2 數據采集 于電極埋置術后的第1天，將小鼠麻醉后進行PVEP檢查。整個測試過程在小鼠尾部夾捏反應消失的情況下進行。若在測試過程中出現夾捏反應，則追加少量麻醉藥并密切觀測小鼠的呼吸情況。將預先埋置好的記錄電極和參考電極與信號放大器的探頭相連接，接地電極（為自制針電極）插入尾根部。刺激屏幕為LCD液晶顯示屏，小鼠雙眼正對刺激屏幕，距離屏幕15 cm。實驗中使用的水平光柵刺激圖形、垂直光柵刺激圖形和棋盤方格刺激圖形（圖2）的空間頻率、時間頻率、疊加次數等保持一致，空間頻率保持0.02周/度，時間頻率1 Hz，疊加次數240次，屏幕亮度為20坎德拉/平方米（cd/m2），對比度為95%。每種刺激無時間間隔連續呈現240次，相鄰的2次刺激間在空間相位上以180°翻轉，不同種刺激間間隔10 s，3種刺激按照事先設定的假隨機順序依次呈現，每只小鼠按隨機方法分配不同的假隨機刺激順序。所有小鼠均在麻醉后相同時間開始進行測試，并進行相同時長的測試。視覺誘發電位信號通過CED1401數據采集系統（英國Cambridge Electronic Design公司）和Spike2軟件（英國Cambridge Electronic Design公司）采集并保存于電腦中。視覺刺激的顯示及數據的采集通過自編的Matlab程序進行控制。所有數據采集均在暗環境中進行，每次記錄的環境亮度均保持一致。

Fig.2 The 3 different stimulus patterns圖2 3種不同的刺激圖形

1.2.3 數據處理 將采集到的數據文件導入Matlab，用自編的Matlab程序對獲得的視覺誘發電位信號進行平均疊加處理后，分析不同視覺刺激條件下得到的PVEP P100波振幅與峰時值。用變異系數（coefficient of variation，CV）評估3種不同圖形刺激誘發的PVEP振幅與峰時值測量的穩定性。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.2.1統計學軟件（美國GraphPad Software公司）進行統計分析。數據以均數±標準差（±s）表示。多組配對數據的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠PVEP波形 小鼠PVEP波形以正向波為主，未見到明顯的負向波，所獲得PVEP波振幅較大，均超過90μV，多數在150μV以上，見圖3。

Fig.3 PVEP waveforms of a mouse圖3 小鼠PVEP波形圖

2.2 3種不同圖形刺激誘發的PVEP P100波振幅的比較 翻轉棋盤方格刺激后P100波振幅低于水平光柵刺激和垂直光柵刺激，差異有統計學意義（P＜0.01）；水平光柵刺激P100波振幅低于垂直光柵刺激，差異也有統計學意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of amplitudes and peak times of PVEP P100 waveforms evoked by three different patterns表1 3種不同圖形刺激PVEP P100波振幅與峰時值的比較（n=22，±s）

Tab.1 Comparison of amplitudes and peak times of PVEP P100 waveforms evoked by three different patterns表1 3種不同圖形刺激PVEP P100波振幅與峰時值的比較（n=22，±s）

＊＊P＜0.01；a與水平光柵刺激比較，b與垂直光柵刺激比較，P＜0.05

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2.3 3種不同圖形刺激誘發的PVEP P100波峰時值的比較 翻轉棋盤方格刺激P100波峰時值長于水平光柵刺激和垂直光柵刺激，差異有統計學意義（P＜0.05），水平光柵刺激后峰時值長于垂直光柵刺激，差異也有統計學意義（P＜0.01），見表1。

2.4 3種不同圖形刺激誘發的PVEP P100波振幅和峰時值穩定性的比較 水平光柵刺激、垂直光柵刺激和翻轉棋盤方格刺激PVEP振幅的變異系數分別為19.06%、16.82%和22.87%；峰時值變異系數分別為14.16%、12.07%和18.19%。垂直光柵圖形刺激誘發的PVEP振幅和峰時值的測量結果更為穩定。

3 討論

VEP在眼科檢查中普遍應用，對視覺神經通路疾病的診斷十分重要。其信號來自視皮層，是從視覺刺激誘發的腦電信號中通過信號平均技術提取出來的［11］，反映的是從視網膜神經節細胞到視皮層的視覺功能［12］，是視路功能的客觀檢查方法。PVEP相對于FVEP結果更為可靠，其波形在個體之間更加穩定與一致［11］，因此臨床上對于能夠實現PVEP記錄的受檢者均首選PVEP檢查。為了規范VEP的檢查和診斷，促進VEP檢查在眼科和神經科疾病診斷、鑒別診斷和預后評估中的規范應用，近20年來ISCEV先后發布了關于人VEP檢查的標準及更新版本［3］。中華醫學會眼科學分會視覺電生理學組也于2020年組織翻譯和發表了ISCEV最新版本的臨床VEP標準［1-2］。但是，動物的PVEP尚無統一的標準［13-14］，各實驗室在動物PVEP的檢測中所采用的電極放置、刺激圖形等記錄方法也不盡相同，同時由于其記錄難度較高，限制了PVEP這一客觀視功能評估手段在眼科與視覺科學研究中的應用。本研究通過將電極埋置于視皮層硬腦膜表面而不侵入視皮層內的方法記錄得到了穩定且高幅值的PVEP反應信號，并比較了不同刺激圖形PVEP結果的差異，可為將來小型嚙齒類動物PVEP指南的制定提供參考。

小鼠與人類的基因序列具有高度的相似性［15］，且飼養簡單、成本較低，廣泛適用于生物學研究及眼科與視覺科學研究，特別是C57BL/6J品系及以此為背景的轉基因小鼠。由于實驗用嚙齒類動物一般體型較小，視覺誘發反應信號微弱，參考人的PVEP記錄方法直接用于嚙齒類動物通常信噪比很低，難以得到高質量的數據，嚴重影響了相關實驗結果的可靠性。本課題組曾采用埋置顱釘的方法，對Wistar大鼠進行PVEP記錄，得到了較好的記錄結果［16］。然而，C57小鼠體質量僅為Wistar大鼠的1/10，其視覺誘發反應信號相應地更為微弱。筆者嘗試采用埋置顱釘的方法對小鼠進行PVEP記錄，雖然可以記錄到PVEP波形，但信噪比較大鼠明顯降低，且個體間變異性較大，部分動物個體甚至無法記錄到較高質量的波形。本研究采用改進的電極埋置方法，使記錄電極更加貼近腦表面以獲取視覺誘發反應的腦電信號。由于記錄方法的改進，本實驗測得的PVEP振幅均超過90μV，信噪比好，高于目前國際上其他方式記錄得到的PVEP振幅［17-18］，且該記錄方法不侵入視皮層組織內，更具優越性。此外，在本研究中，3種圖形刺激的PVEP波形均以正向波為主，未見明顯的負向波，可能與本實驗中電極埋置的位置有關。以往研究證實小鼠VEP波形與記錄電極的深度有關，在小鼠視皮層淺層記錄到的誘發反應主要為正向波，在視皮層深層記錄到的誘發反應主要為負向波，而在中間層則記錄到雙向波形［17］。

視覺系統自視網膜神經節細胞開始至視皮層，各個部位的神經細胞對視覺刺激具有特征選擇性［19］。很多視覺細胞對不同方位（orientation）或運動方向（direction）的視覺刺激具有選擇性［19-20］。研究發現，視網膜的輸出神經元—視網膜神經節細胞，對特定方向的運動圖像具有優先反應的特性［20］。總體而言，與垂直方向運動的圖像相比，視網膜細胞更偏向于水平方向運動的圖像［21］。值得注意的是，水平方向運動的刺激實際相當于垂直光柵的運動。外側膝狀體核對不同運動方向的視覺刺激也具有選擇性，雪貂外側膝狀體核內的二連放電神經元細胞對水平方向運動的刺激最為敏感［22］。Salinas等［23］在特定空間頻率下記錄到視皮層細胞更加偏向于水平方向運動的垂直光柵。此外，Yap等［24］也通過研究發現，無論對視力正常兒童還是患有散光的兒童來說，垂直或斜向光柵刺激比水平光柵刺激更易誘發圖形給撤光視覺誘發電位。本研究采用于視皮層表面埋置電極的方法，獲得了高質量的PVEP記錄數據，并系統地比較了水平光柵刺激、垂直光柵刺激和翻轉棋盤方格刺激誘發的PVEP振幅和峰時值的差異，進一步明確了采用垂直光柵刺激相對更易誘發出小鼠PVEP波形，表現為更高的振幅和更短的峰時值。這與既往細胞電生理實驗研究和臨床研究結果是相一致的。同時，垂直光柵刺激可獲得更為穩定的小鼠PVEP波形，其更低的變異度也意味著可顯著減少實驗所需的樣本量。