基于α-突觸核蛋白的帕金森病動物模型研究進展

杜可晨，鄒春林△

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的第二常見神經退行性疾病［1］。目前，PD的病因及確切發(fā)病機制尚不清楚，其主要臨床癥狀包括運動癥狀（運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢步態(tài)異常等）和非運動癥狀（自主神經功能障礙、嗅覺障礙、便秘和快速眼動期睡眠行為障礙等）。PD的主要病理學特征是黑質致密部多巴胺神經元的變性丟失及路易小體（Lewy bodies，LBs）形成。而α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）是LBs的主要組成成分，且α-syn的基因點突變（A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T）與家族性PD的發(fā)病密切相關，α-syn參與了PD的發(fā)病。近年來，已有大量研究利用α-syn的異位表達、過表達或腦內注射等方法來建立PD動物模型，這些模型與傳統(tǒng)化學毒素模型相比，能夠更好地復制PD患者的特征性病理改變。本文基于α-syn的PD動物模型的研究進展進行綜述。

1 α-syn概述

1.1 α-syn的基本結構 α-syn是由140個氨基酸構成的蛋白，并且是一種具有多種構象的蛋白，包括單體、寡聚體、多聚體、原纖維、不溶性原纖維等。有研究表明，α-syn各組分間存在動態(tài)平衡，正常情況下不具有聚集傾向，當寡聚體與單體比例失調時會引起聚集，形成的原纖維可損害神經元并導致疾病進展［2］。α-syn由3個結構域組成：N端與脂質結合的α螺旋結構域、非淀粉樣β蛋白結構域、非結構化C端。N端在膜上起結合的作用，含有7個重復序列，每個序列包含11個氨基酸，而非結構化C端含有大量帶電殘基，這些殘基有助于抑制原纖維的形成，是重要的翻譯后修飾結構。

1.2 α-syn的生理功能 α-syn的生理功能尚未被完全揭示。已有研究證明α-syn能抑制胞吐融合孔的關閉，促進胞吐作用［3］。同時α-syn可調節(jié)多巴胺（dopamine，DA）轉運體，影響神經末梢攝取DA的效率。α-syn的C端與α-晶體蛋白部分結構相似，具有保護細胞內蛋白免受溫度變化和氧化應激影響的作用。α-syn作為腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）合成的生理調節(jié)因子，能在線粒體中影響ATP合成的效率［4］，同時也參與正常的脂肪酸攝取、轉移及代謝；且能控制神經遞質釋放［5］。Bi等［6］發(fā)現(xiàn)α-syn能誘導p38絲裂原活化蛋白激酶激活Ser131磷酸化的Parkin基因，使E3泛素連接酶失活，并進一步降低二價金屬轉運體-1（divalent metal transporter 1，DMT1）的泛素化水平。DMT1穩(wěn)定性的改變和細胞對鐵攝取的改變能影響腦中鐵穩(wěn)態(tài)，因此α-syn可能在黑質（Substantia nigra，SN）中參與PD相關的鐵沉積以及鐵代謝功能障礙。

1.3 α-syn的病理功能 Logan等［3］發(fā)現(xiàn)外源性或過表達α-syn可以促進胞吐融合孔的擴張，促進胞吐作用。異常聚集的α-syn能增強細胞核周圍和樹突中線粒體的氧化應激。α-syn低聚物會導致線粒體破碎，產生的碎片又進一步引起更多線粒體發(fā)生功能障礙與死亡。α-syn以劑量依賴性方式抑制囊泡從內質網(wǎng)轉運至高爾基體，使囊泡在質膜附近堆積成囊泡簇。免疫熒光顯示囊泡簇與α-syn及不同的囊泡標志物相關，表明α-syn能影響囊泡運輸?shù)牟襟E。α-syn的錯誤折疊會形成毒性淀粉樣蛋白聚集體，這些聚集體在神經元中沉積并引發(fā)神經元功能障礙，最終過表達的α-syn與其他蛋白形成LBs并沉積在神經突中，阻礙DA代謝和神經元的正常功能，導致神經元死亡。

正常情況下，過表達或錯誤折疊的α-syn會通過自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP）降解。ALP是對胞漿內大分子蛋白和細胞器等進行降解的一種途徑，可以通過溶酶體清除多種α-syn聚集體。因此，ALP受損會導致α-syn在細胞中過表達及異常聚集而產生神經毒性。異常聚集的α-syn又能阻斷葡萄糖腦苷酶1等水解酶從內質網(wǎng)轉運到溶酶體，降低溶酶體的降解能力，進一步引發(fā)溶酶體清除過表達或錯誤折疊的α-syn的能力下降［7］。因此ALP受損與病理性α-syn聚集可能共同加速了神經元受損，導致嚴重的神經元病變。

2 基于α-syn的PD動物模型

研究人員已建立了多種PD動物模型，包括秀麗隱桿線蟲、果蠅、斑馬魚等低等動物，小型豬、狗、嚙齒類和非人靈長類（non-human primates，NHPs）等高等哺乳動物。嚙齒類動物體型較小、易于飼養(yǎng)，解剖結構與人類相近，因此成為PD研究中最經典的動物模型之一，常用嚙齒類動物有小鼠與大鼠。NHPs是與人類最為接近的動物，能夠更好地復制PD患者的特征性病理改變，但因飼養(yǎng)難度大且成本較高，目前研究數(shù)量相對較少。低等動物雖然結構簡單，但能與高等動物模型形成互補，如秀麗隱桿線蟲體壁透明可用于追蹤顯示熒光蛋白，彌補高等動物模型中難以體內示蹤的缺陷。

基于α-syn的PD動物模型與其他藥物構建的PD模型存在一定區(qū)別。神經毒素類（6-羥基多巴胺、1,4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶、殺蟲劑等）模型造模速度快，但僅能模擬PD癥狀，不能很好地模擬PD特征性的病理改變；而基于α-syn的PD動物模型雖然造模速度較慢，但可造成PD特征性的病理改變并引起PD癥狀，相比神經毒素模型能更好地模擬PD患者的病程發(fā)展。以下主要討論基于α-syn的嚙齒類及NHPs的PD模型的研究進展。

2.1 基于α-syn的嚙齒類動物PD模型

2.1.1 轉基因模型 嚙齒類動物是目前最常用的實驗哺乳動物。已有研究利用轉基因技術在嚙齒類動物腦中過表達野生型（Wild Type，WT）、A53T、A30P或E46K突變型α-syn，可部分引起紋狀體DA含量減少、黑質神經元變性和運動功能障礙等一系列特征性的PD生化、病理和行為學改變。Masliah等［8］首先成功建立了過表達WTα-syn轉基因小鼠模型，并在該模型中觀察到部分PD特征性病理改變，如在新皮質、海馬及黑質神經元內形成α-syn陽性包涵體和泛素陽性包涵體；此外，基底節(jié)內也可見紋狀體多巴胺能神經元末梢丟失，但黑質部位多巴胺能神經元無明顯減少，且未見典型的LBs形成，行為學異常也僅在高表達α-syn的轉基因小鼠中觀察到。van der Putten等［9］建立了Thy1調控序列作用下過表達A53T突變型的人源性α-syn轉基因小鼠模型，該轉基因小鼠的黑質多巴胺能神經元缺乏A53T突變型的人源性α-syn表達，但在黑質之外的腦區(qū)卻具有與Lewy體病患者大腦相似的α-突觸核蛋白病病理改變；此外，該模型可表現(xiàn)出明顯的運動功能障礙，表明此模型可作為研究α-突觸核蛋白病的一個較好的小鼠模型。雖然上述轉基因小鼠模型能出現(xiàn)PD的一些特征性病理改變（如神經元內α-syn的聚集和α-syn包涵體形成等）以及運動障礙，但這些模型大多缺乏特異性的黑質多巴胺能神經元損傷和丟失，因此與PD患者的臨床病理改變仍有明顯區(qū)別。

2.1.2 腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）模型 由于AAV具有體積小、感染效率高、很少整合到宿主基因組中，并能感染分裂細胞和非分裂細胞等優(yōu)勢，近年來許多研究者開始通過AAV介導WT或突變型α-syn在中腦黑質中過表達，從而導致黑質多巴胺能神經元的丟失，以期建立能夠更好模擬PD特征性病理改變的動物模型。van der Perren等［10］將編碼A53T突變型α-syn的重組腺相關病毒載 體 2/7（recombination adeno-associated virus，rAAV）通過腦立體定位，定向注射到大鼠黑質部位，模型鼠在注射3周后出現(xiàn)明顯的運動障礙，注射4周后對側前爪使用率減少50%，且使用左旋多巴治療可使前爪功能完全恢復；注射29 d后，大鼠黑質內80%的酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）陽性神經元死亡；注射32 d后，通過影像學發(fā)現(xiàn)尾殼核內DA轉運體結合率降低了85%；此外，在黑質中出現(xiàn)了α-syn異常聚集體，且17 d后在黑質中可見硫代黃素S染色呈陽性的α-syn異常聚集體。以上結果表明通過rAAV介導，在黑質部位過表達A53T突變型α-syn可高效建立具有特征性病理和行為學改變的PD動物模型。Ip等［11］將編碼A53T突變型α-syn的AAV 1/2立體定向注射到小鼠黑質部位，10周后整個黑質與紋狀體中均發(fā)現(xiàn)A53T突變型α-syn，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)TH陽性神經元與A53T突變型αsyn存在共定位，TH陽性神經元密度降低了20%，且紋狀體中DA水平減少約40%，通過放射自顯影分析，DA轉運體結合率降低了29%；同時可觀察到小鼠黑質神經元產生LBs樣結構以及營養(yǎng)不良性神經突起，行為學檢測可見小鼠左前爪使用率下降。該研究在小鼠中誘導出了PD樣的病理及行為學改變，成功構建了基于α-syn的PD小鼠模型。由于在PD前驅階段藍斑去甲腎上腺素能神經元的退行性改變可引起一系列非運動癥狀（抑郁癥、焦慮和睡眠障礙等），因此Henrich等［12］建立了第一個小鼠藍斑中過表達α-syn的動物模型，該研究將編碼A53T突變型α-syn的AAV1/2注射到小鼠藍斑中，結果發(fā)現(xiàn)注射3周后藍斑中TH陽性細胞減少約15.86%，6周后減少約34.84%，9周后減少約56.25%；該研究還發(fā)現(xiàn)藍斑神經元中出現(xiàn)磷酸化的α-syn聚集以及反應性小膠質細胞和星形膠質細胞增生；但該研究未發(fā)現(xiàn)黑質中TH陽性神經元明顯減少，這可能與實驗周期短有關。

與其他AAV相比，AAV2/DJ在體外有更高的轉染效率。von Hovel等［13］首次利用AAV2/DJ作為載體在大鼠黑質過表達WTα-syn與E46K突變型αsyn，結果顯示黑質神經元中均產生了具有蛋白酶K抗性的不溶性磷酸化α-syn，并出現(xiàn)LBs樣病理改變；黑質紋狀體TH免疫組化染色結果顯示，在過表達WTα-syn的大鼠模型的黑質內TH陽性神經元數(shù)量呈進行性減少，12周時減少達40%，并且紋狀體中TH陽性神經纖維也呈現(xiàn)相似的改變；而在過表達E46K突變型α-syn大鼠黑質紋狀體內TH陽性神經元和神經纖維的數(shù)量在注射4周后不再減少；行為學方面，2個模型均出現(xiàn)了旋轉行為學的改變，但在圓筒實驗中，僅過表達WTα-syn的大鼠出現(xiàn)明顯變化，TH陽性神經纖維在第4周降低至67.0%，第8周進一步降低至58.7%，第12周下降至44.1%，提示W(wǎng)Tα-syn大鼠神經元正在持續(xù)退化，這些結果表明過表達E46K突變型α-syn的大鼠模型可作為前驅期PD模型，而過表達WTα-syn的大鼠模型可作為早期PD模型。

2.2 基于α-syn的NHPs的PD模型 NHPs動物在神經系統(tǒng)解剖結構、運動及非運動行為學方面與人類非常接近，因此作為神經系統(tǒng)疾病模型有著其他動物所無法比擬的優(yōu)勢。Kirik等［14］通過向成年狨猴大腦的黑質中注射編碼WT和A53T突變型α-syn的rAAV建立了第一個NHPsα-syn過表達模型；該研究發(fā)現(xiàn)在注射WT和A53T突變型α-syn-rAAV 16周后，狨猴均出現(xiàn)了明顯的PD樣病理改變，如αsyn陽性包涵體和顆粒狀沉積物以及產生營養(yǎng)不良性神經突起，并且進一步通過體視學細胞計數(shù)，結果顯示在注射WT和A53T突變型α-syn-rAAV的黑質中，TH陽性細胞數(shù)減少達32%~61%。Yang等［15］利用NHPs動物評價了不同年齡對過表達α-syn毒性的影響，將編碼A53T突變型α-syn的慢病毒載體注射到不同年齡的恒河猴黑質部位，8周后所有過表達A53T突變型α-syn的猴腦內注射位點均可見路易神經突，并且路易神經突的密度隨年齡的增長而增加；此外，反應性星形膠質細胞數(shù)量也隨年齡增長而增加，并伴有明顯的神經元軸突退行性病變；TH免疫組化染色結果顯示，與對照組猴相比，過表達A53T突變型α-syn的實驗組猴黑質DA神經元明顯減少，這些結果表明老化可加速神經元中α-syn聚集。Bourdenx等［16］也將編碼A53T突變型α-syn的AAV2/9病毒載體注射到青年和老年狨猴的黑質部位，但與Yang等［15］研究結果不同，該研究結果顯示，青年狨猴與老年狨猴在黑質紋狀體部位TH陽性神經元和神經纖維的丟失程度無明顯差異，說明老化并不會加劇過表達α-syn的神經毒性。造成上述2個研究結果不同的原因可能是Yang等［15］用的是舊世界恒河猴，而Bourdenx等［16］用的是新世界狨猴，由于狨猴的α-syn天然帶有A53T突變，因此可能對外源性過表達A53T突變型α-syn的毒性作用具有一定的拮抗能力。Koprich等［17］通過注射編碼A53T突變型α-syn的AAV1/2病毒載體到食蟹猴黑質部位，成功構建了過表達A53Tα-syn的猴模型，研究顯示該模型黑質DA能神經元丟失超過50%，紋狀體DA減少超過60%，進一步表明在NHPs黑質紋狀體過表達α-syn可建立用于研究PD特異性病理改變的NHPs動物模型。與上述研究不同，Collier等［18］通過注射rAAV-α-syn-shRNA到綠猴黑質部位，敲低內源性α-syn表達，結果發(fā)現(xiàn)在注射后3個月，黑質TH陽性神經元及紋狀體TH陽性神經纖維明顯減少，并且以黑質腹側部TH陽性神經元減少最為明顯；而在紋狀體部位，殼核內TH陽性神經纖維的減少比尾狀核更明顯；因此，研究人員推測α-syn喪失正常功能可能是PD的病因之一，在PD患者腦內病理性α-syn聚集體可能通過吸附作用來阻止α-syn發(fā)揮正常的生理功能。

在α-syn轉基因猴研究方面，Niu等［19］將編碼A53T突變型α-syn的慢病毒載體注射到恒河猴卵母細胞中，并最終從75個胚胎中成功孕育出6只表達A53T突變型α-syn的轉基因猴，雖然這些轉基因猴沒有出現(xiàn)明顯的運動癥狀，但出現(xiàn)了年齡依賴的PD非運動癥狀（如認知缺陷和焦慮表型）。這些癥狀與PD患者早期出現(xiàn)的非運動癥狀相一致，因此這一轉基因猴模型對于今后研究PD的早期病理改變有著重要價值。

3 基于α-syn預制原纖維的PD動物模型

3.1 嚙齒類動物模型 正常情況下α-syn在細胞內以可溶性單體形式存在，當疾病狀態(tài)下體內環(huán)境改變時，可溶性α-syn轉化為寡聚中間體，寡聚中間體再延伸轉化為不溶性的α-syn原纖維，然后進一步聚集形成α-syn包涵體。這種不溶性α-syn原纖維是LBs的主要成分，為了便于研究α-syn原纖維的致病機制，研究人員在體外合成了與α-syn原纖維高度相似的α-syn預制原纖維（α-Synuclein Preformed Fibrils，α-syn PFFs），并將其應用于各種PD細胞和動物模型的制作。Luk等［20］首次將α-syn PFFs添加到過表達α-syn的細胞培養(yǎng)體系中，結果顯示α-syn PFFs可誘發(fā)細胞內源性α-syn的聚集，并形成LBs樣細胞包涵體。Volpicelli-Daley等［21］在原代神經元培養(yǎng)體系中加入α-syn PFFs，結果顯示α-syn PFFs可誘導形成不溶性的α-syn聚集體，并證實病理性α-syn聚集體能夠在神經元之間傳播，最終導致神經元缺失。上述細胞水平的實驗證實了α-syn PFFs具有細胞毒性及在細胞間朊病毒樣傳播的特性。為了進一步在體內證實α-syn PFFs的這些生物學特性和功能，Luk等［22］首次將α-syn PFFs應用于PD小鼠模型的制作，結果顯示在小鼠紋狀體內注射α-syn PFFs可導致病理性α-syn在注射部位的神經元內聚集以及在相連腦區(qū)播散，并導致相應神經元發(fā)生退行性改變；其中黑質致密部DA能神經元的缺失直接導致了模型小鼠行為學改變，包括小鼠握力、平衡和協(xié)調能力下降，表明α-syn PFFs可用于制作PD動物模型。Masuda-Suzukake等［23］除將α-syn PFFs注射到小鼠黑質中外，還首次將路易體癡呆患者的腦組織提取物也注射到小鼠黑質部位，結果同樣顯示病理性α-syn可在多個腦區(qū)間傳播，并導致神經元慢性退行性改變。但Luk等［22］的研究結果不同，模型小鼠未出現(xiàn)明顯的行為學改變，可能是注射劑量和注射部位不同所致。Paumier等［24］進一步將α-syn PFFs注射到大鼠單側紋狀體內，也發(fā)現(xiàn)病理性αsyn出現(xiàn)廣泛的不同腦區(qū)間的傳播，并且可導致在注射部位同側黑質神經元內形成α-syn聚集體、雙側黑質DA能神經元退行性改變以及雙側紋狀體神經支配減少；行為學上，2個部位注射的大鼠模型中可見僅少數(shù)對側前肢運動障礙。上述體內實驗表明α-syn PFFs可用僅于制作嚙齒類動物PD模型。隨后多個研究又將α-syn PFFs分別注射到小鼠和大鼠的腦內紋狀體或黑質，建立了多種基于α-syn PFFs的PD模型，并探討了α-syn PFFs在PD模型腦內的致病作用和相關致病機制［25-29］。

根據(jù)Braak假說，PD患者的α-syn病理改變可能起源于腸道神經系統(tǒng)和嗅球這2個部位［30］。為了證實病理性α-syn可以從上述2個部位傳播到中腦黑質部位，研究人員將α-syn PFFs分別注射到腸道肌層和嗅球，并觀察病理性α-syn在相關神經通路的傳播及所引起的病理改變。Kim等［31］向小鼠十二指腸和幽門肌層注射α-syn PFFs，并在注射后1、3、7和10個月分別取相關神經組織進行分析，結果顯示在注射1個月后病理性α-syn可通過迷走神經擴散至大腦底部的腦干部位，3個月時繼續(xù)向上擴散至藍斑、黑質、杏仁核、下丘腦和前額葉，7個月時可蔓延到海馬、紋狀體和嗅球，而在迷走神經切斷的小鼠或α-syn敲除的小鼠體內注射α-syn PFFs，病理性α-syn的傳播可被阻斷，說明病理性α-syn是通過迷走神經從腸道神經系統(tǒng)向腦內傳播，并依賴內源性α-syn；該研究還發(fā)現(xiàn)注射α-synPFFs 7個月后小鼠產生精細行為障礙和焦慮樣行為表現(xiàn)；因此研究結果顯示該模型可作為一種新的PD模型用于PD的發(fā)病機制和治療研究。此外，有研究證實腦內病理性α-syn同樣會通過迷走神經傳播到腸道神經系統(tǒng)，并引起病理性α-syn聚集和腸道神經元損傷［32］，提示病理性α-syn能通過迷走神經在腦與腸道之間互相傳遞。另有研究者將α-syn PFFs注射到小鼠嗅球部位，幾個月后可見由該外源性α-syn PFFs誘導的內源性α-syn在遠離注射部位的不同腦區(qū)產生病理性聚集，并且這種病理性聚集可導致進行性嗅覺功能缺失，這與臨床上PD患者早期癥狀相似，因此該模型可作為前驅期PD模型用于PD早期治療方法的研究［33-34］。

3.2 NHPs模型 為了進一步研究α-syn PFFs在NHPs動物模型中的致病作用，Shimozawa等［35］首次將α-syn PFFs注射到青年狨猴紋狀體內，注射3個月后即可在多個腦區(qū)神經元內觀察到磷酸化α-syn陽性染色包涵體形成，表明注射外源性α-syn PFFs可誘導內源性α-syn發(fā)生病理性聚集，并且在注射側黑質內能觀察到TH陽性神經元數(shù)量明顯減少以及神經元內LBs樣包涵體形成；此外，該研究發(fā)現(xiàn)從注射部位到新皮質、黑質、杏仁核、蒼白球和丘腦等腦區(qū)均觀察到病理性α-syn聚集，說明病理性α-syn可在神經元間進行逆行傳播；同時，他們還觀察到含有α-syn包涵體的神經元可能通過小膠質細胞的吞噬作用被清除。Chu等［36］在8只食蟹猴的殼核內注射了α-syn PFFs，12~15個月后，免疫組化染色結果顯示在殼核注射區(qū)域可見大量磷酸化α-syn陽性染色的神經元，在注射部位同側的黑質神經元內可見各種形狀的磷酸化α-syn陽性染色聚集體，其中包括LBs樣包涵體，同時DA能神經元數(shù)量明顯減少，該研究再次證實了α-syn PFFs能夠誘導NHPs產生類PD樣的病理改變。但是，在上述2項研究中，模型猴均未出現(xiàn)明顯的行為學改變，這可能與α-syn PFFs的注射劑量不足和觀測周期尚短有關。

4 小結

近20年來研究人員已建立了多種基于α-syn的PD動物模型，雖然目前還沒有一種模型能夠完全復制PD的所有臨床癥狀和病理改變，但每種模型均能復制PD的部分疾病特征，因此應根據(jù)不同實驗目的來選用相應的動物模型。如利用rAAV作為載體在黑質部位過表達α-syn的動物模型，可用于探索αsyn的致病作用和相關機制，而α-syn PFF體內注射模型適用于病理性α-syn體內傳播機制和阻斷治療的研究。因此，α-syn作為LBs的主要成分，在PD的發(fā)病中起著重要作用，其或可成為新的PD診斷生物標志物和治療靶點。