HNF-4α基因多態性與非酒精性脂肪性肝病的關系

黃海燕，李毅，呂其軍，周芳，王濟紅，楊長春，徐娟△

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）屬一種臨床病理綜合征，主要病理特征是肝實質細胞發生脂肪變性，甚至壞死、脂肪貯積及炎性細胞浸潤等［1-2］。NAFLD作為代謝綜合征在肝臟的表現，單純性脂肪肝、脂肪性肝炎及與其有關的肝硬化或肝癌等均屬該病的疾病譜［3-4］。NAFLD可引起多種并發癥，如動脈粥樣硬化、2型糖尿病等［5］。其發病與環境、遺傳等多種因素有關。肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4，HNF-4α）可調節肝臟多個脂代謝的通路［6］，在NAFLD中的作用逐漸成為研究熱點，但目前關于HNF-4α基因多態性與NAFLD的關系鮮有報道。本文以NAFLD患者為研究對象，分析HNF-4α基因多態性與NAFLD的關系，以期為探究NAFLD發病的遺傳學因素提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年10月—2019年4月勝利油田中心醫院收治的NAFLD患者為研究對象。納入標準：符合《NAFLD診療指南（2010版）》相關臨床診斷標準［7］；年齡18~75歲；無大量或長期飲酒史（飲酒換算乙醇量：女性＜70 g/周、男性＜140 g/周），均為非酒精性單純性脂肪肝；精神狀態尚可、意識清晰，可配合研究。排除標準：合并惡性腫瘤；合并心、肺、腎等其他重要器官的功能損傷；伴有病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝病、肝豆狀核變性等；伴發感染性疾病、傳染性疾病、免疫性疾病、內分泌疾病等；處于妊娠期或哺乳期；近3個月服用可影響內分泌的藥物。根據上述標準，共納入100例NAFLD患者作為觀察組。選擇同時期來本院查體的100例健康人作為對照組。本研究已通過醫院醫學倫理委員會的審查，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 資料收集 收集研究對象的一般臨床資料，包括年齡、性別、身高、體質量、體質量指數（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、腰圍、臀圍、腰臀比（WHR），以及肝功能［丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）］、血脂［三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）］、血糖（GLU）、胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、尿酸（UA）等生化指標，檢測非酒精性單純性脂肪肝嚴重程度和HNF-4α的基因多態性。

1.3 檢測方法與分組（1）非酒精性單純性脂肪肝嚴重程度。行腹部CT，觀察病變程度，肝/脾CT比值≤0.5為重度病變，0.5＜肝/脾CT比值≤0.7為中度病變，0.7＜肝/脾CT比值＜1.0為輕度病變。據此，將觀察組分為輕度組（28例）、中度組（36例）和重度組（36例）。（2）HNF-4αrs4812829位點基因多態性。使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集研究對象的外周靜脈血5 mL，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取外周血內單個核細胞基因組DNA。HNF-4α基因上游引物為5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGC?GACTCTCCAAAACCCCT-3'，下游引 物為5'-TCCTTG?TAGTCCATACCGATAACTTCCTGCTTGGTGATG-3'，PCR的擴增體系包含2 U熱啟動混合Taq酶、200 ng DNA模板、正反向引物各5μL（10 mmol/L）、5μL dNTPs（200μmol/L）、5μL Tris-HCl（100 mmol/L）、5μL KCl（500 mmol/L）、5μL MgCl2（215 mmol/L），并加去離子水至體積為50μL。在熱循環儀上展開聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，條件及過程為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸45 s，循環35次；最后72℃延伸10 min。PCR產物純化后，37℃條件下采用限制性內切酶消化12 h，將16.5μL酶切產物放入含4%瓊脂糖凝膠內，進行電泳分離并明確基因型。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0對數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；基因型數據進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，NAFLD發病風險采用多因素Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與觀察組基線資料比較 2組性別、年齡差異無統計學意義，觀察組SBP、DBP、BMI、WHR均明顯高于對照組（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of general data between control group and observation group表1 對照組與觀察組基線資料比較（n=100）

2.2 對照組與觀察組各亞組肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 對照組、輕度組、中度組、重度組的ALT、AST、γ-GT、TC、TG、LDL-C、GLU、HOMA-IR及UA水平大體呈現依次升高趨勢（P＜0.05），而HDL-C水平呈下降趨勢，見表2。

Tab.2 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and UA levels between control group and different subgroups of the observation group表2 對照組與觀察組各亞組肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

Tab.2 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and UA levels between control group and different subgroups of the observation group表2 對照組與觀察組各亞組肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與輕度組比較，c與中度組比較，P＜0.05

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2.3 對照組與觀察組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較 HNF-4α基因rs4812829位點多態性在對照組與觀察組中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規律（P＞0.05），2組均有較好群體代表性，且2組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of allele and genotype distribution of HNF-4αrs4812829 between control group and observation group表3 對照組與觀察組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較 （n=100）

2.4 觀察組不同亞組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較 觀察組不同亞組HNF-4α rs4812829等位基因及基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of allele and genotype distribution of HNF-4αrs4812829 in different subgroups of the observation group表4 觀察組中不同亞組HNF-4αrs4812829等位基因及基因型分布比較

2.5 觀察組HNF-4αrs4812829位點不同等位基因攜帶者之間肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 觀察組AA、AG、GG型基因攜帶者之間ALT、AST、γ-GT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、HOMA-IR及UA水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and uric acid levels of HNF-4αrs4812829 locus carriers in the observation group表5 觀察組HNF-4αrs4812829位點不同等位基因攜帶者肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

Tab.5 Comparison of liver function,blood lipid,blood glucose and uric acid levels of HNF-4αrs4812829 locus carriers in the observation group表5 觀察組HNF-4αrs4812829位點不同等位基因攜帶者肝功能、血脂、血糖、UA水平比較 （±s）

均P＞0.05

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2.6 HNF-4αrs4812829基因位點與NAFLD發病風險的關系 以是否發生NAFLD（是=1，否=0）為因變量，以性別、年齡、rs4812829基因型（GG=0，AG=1，AA=2）等為自變量，對2組性別、年齡等因素校正后進行Logistic回歸分析。結果顯示，與基因型為GG個體相比，基因型為AG、AA的個體發生NAFLD的風險均未增加，見表6。

Tab.6 Correlation analysis of HNF-4αrs4812829 gene locus and the risk of NAFLD表6 HNF-4αrs4812829基因位點與NAFLD發病風險的關聯

3 討論

3.1 NAFLD的臨床特征 NAFLD已成為我國第二大肝病，其發病率僅次于慢性病毒性肝炎［8］。據統計，西方國家NAFLD發病率約30%，其發生與代謝功能障礙機制存在密切聯系［9-10］。有研究發現，隨著高脂血癥、2型糖尿病等代謝性疾病增多，該病發病率明顯升高［11］；且NAFLD易引發肝硬化、不良心血管事件等，具有較高的死亡率［12-13］。本研究發現，觀察組SBP、DBP、BMI、WHR均明顯高于正常對照組，且肝功能、血脂、血糖、UA等指標均明顯異于對照組，病情越重，上述代謝指標越差。由此可見，NAFLD患者存在多種代謝紊亂，肝功能下降、血脂及血糖代謝異常。

3.2 HNF-4α在NAFLD發病中的作用 NAFLD發病機制未有明確定論，可能與環境因素、遺傳因素等相互作用相關［14］。近年來NAFLD發病的遺傳學研究較多，多種核受體、轉錄調控因子等參與其發病過程［15-16］。其中，HNF-4α作為鋅指蛋白的一種，屬于核受體超級家族的孤兒核受體，HNF-4α編碼基因位于20號染色體的長臂，以同源二聚體形式結合DNA，且其主要在肝臟表達，而在腎臟、胰腺等組織少量表達。HNF-4α參與葡萄糖、脂肪酸、膽固醇等物質代謝過程，參與肝臟的糖異生激活、調節胰島細胞分泌、調節脂蛋白等相關基因表達［17］。HNF-4α基因rs4812829（G＞A）位點是糖尿病的易感性位點，與遲發性糖尿病或2型糖尿病的發生相關，在調節體內脂質穩態、膽汁酸合成等過程中，HNF-4α亦發揮重要作用。本研究發現，觀察組HNF-4α rs4812829位點基因型AA、AG、GG的分布及等位基因A、G的占比均與對照組無明顯差異，且HNF-4α rs4812829位點各基因型及等位基因的分布在觀察組各亞組之間亦無明顯差異，對比觀察組HNF-4α rs4812829位點不同基因型攜帶者之間肝功能、血脂、血糖、UA水平亦均無明顯差異，可見HNF-4α rs4812829位點與NAFLD的發生無明顯關系。Logistic回歸進一步分析發現，與基因型為GG個體相比，基因型為AG、AA的個體發生NAFLD的風險均未增加，推測HNF-4αrs4812829位點的基因多態性尚未增加NAFLD的患病風險。

綜上所述，HNF-4α基因rs4812829位點多態性及等位基因的分布與NAFLD發生無明顯相關。但本研究僅對NAFLD患者進行血生化指標、CT影像學等檢查，且整體樣本量偏小，故而有待擴大樣本深入研究HNF-4α基因多態性與NAFLD的關系，為預防NAFLD發生提供科學依據。