低劑量氯胺酮對MPTP誘導帕金森病小鼠神經功能及炎性因子的影響

宋俊杰，范軍朝，陳英，陳勇

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是最常見的神經退行性疾病之一，神經炎癥、遺傳以及持續激活的N-甲 基-D-天 冬 酰 胺（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體引起的神經細胞凋亡被視為PD發病的主要病理機制［1-2］。氯胺酮（ketamine）是NMDA受體的非競爭性拮抗劑［3］。有研究認為其對PD導致的抑郁、步態異常有一定改善作用［4］。氯胺酮對神經功能的影響存在兩面性，大部分研究認為氯胺酮暴露對神經及記憶功能有一定損傷［5］。但也有研究提出氯胺酮可以通過多種途徑保護多巴胺能神經元，20~50 mg/kg的氯胺酮對腦損傷有一定神經保護作用［6］。因此，推測其作用可能與用藥劑量及暴露次數有關，不同劑量氯胺酮對于PD的具體作用及機制尚需進一步研究。在預實驗和現有研究的基礎上，本研究分別采用25、50和75 mg/kg劑量的氯胺酮干預1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導的PD小鼠，初步探討不同劑量氯胺酮對PD小鼠神經功能及神經炎癥影響的差異和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級成年雄性C57BL/6小鼠50只，體質量28~30 g，8~10周齡，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）2017-001。動物飼養及實驗過程依照動物護理和使用指南進行。本研究經河南大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 CatWalk XT自動步態分析系統購自諾達思（北京）信息技術有限責任公司。鹽酸氯胺酮注射劑購自福建古田藥業有限公司，MPTP購自美國Sigma公司，小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6和IL-1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗小鼠Toll樣受體4（TLR4）、兔抗小鼠核因 子（NF）-κB p65、兔抗小 鼠髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和β-actin抗體均購自上海碧云天生物技術公司。兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）一抗及羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模和給藥 將小鼠按照隨機數字表法分為NC組、PD組、PD+Keta-L組、PD+Keta-M組、PD+Keta-H組，每組10只。氯胺酮用生理鹽水稀釋至1 g/L，給藥時調整體積至1 mL，PD+Keta-L、PD+Keta-M、PD+Keta-H組小鼠分別腹腔注射25、50和75 mg/kg氯胺酮，每天1次，共2 d，NC組和PD組同時間注射等體積生理鹽水；MPTP用生理鹽水稀釋至1 g/L，給藥時調整體積至1 mL，氯胺酮給藥結束20 min后，對PD組、PD+Keta-L、PD+Keta-M、PD+Keta-H組小鼠腹腔注射MPTP 20 mg/kg，每天1次，連續20 d，建立亞急性PD模型［7-8］，NC組相同時間注射同體積生理鹽水。

1.3.2 神經行為學評分 末次MPTP給藥結束2 h后，采用CatWalk自動步態分析系統獲取各組小鼠步態數據，包括步長、步頻和步行速度變化率；采用改良神經功能缺損評分（modified neurological severity score，MNSS）系統對小鼠進行神經功能缺損評分，包括運動功能評估（0~6分）、感覺功能評估（0~2分）、平衡功能評估（0~6分）和反射功能評估（0~4分）4部分?？傇u分為0~18分，評分越高說明MPTP所致神經功能障礙越嚴重。

1.3.3 HE染色 神經行為學測試完成后（末次給藥結束后24 h），使用過量戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠后迅速斷頭，于冰下取腦，-80℃凍存。取皮層腦組織，經4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，透明劑二甲苯進行透明，石蠟包埋成蠟塊，最后于切片機上切成6μm厚的切片。將切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，蘇木精染色5 min，1%鹽酸分化30 s，流水沖洗15 min，伊紅染色2 min，脫水透明后，中性樹脂封固，光鏡下（×400）觀察結果。

1.3.4 免疫組化檢測TH表達 取腦組織石蠟切片常規脫蠟入水，3%H2O2孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，抗原修復后用5%的胎牛血清封閉30 min，兔抗小鼠TH單克隆抗體（1∶300）4℃孵育過夜，PBS漂洗，羊抗兔二抗（1∶500）孵育40 min，PBS漂洗，蛋白酶K溶液37℃孵育15 min，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，常規封片。光學顯微鏡下（×100）觀察TH陽性細胞呈棕黃色。每張切片隨機讀取3個高倍鏡（×100）視野，計算黑質致密部TH陽性細胞數量及比例，取平均值。

1.3.5 原位缺口末端標記（TUNEL）法檢測細胞凋亡率 腦組織切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min，充分脫蠟，梯度乙醇浸洗3次，每次5 min，而后采用含3%H2O2的甲醇浸洗10 min，含蛋白酶K的Tris溶液中室溫孵育20 min。采用ApopTag?（Chemicon，美國）原位細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3.6 ELISA檢測炎性因子水平 將腦組織進行勻漿裂解，14 000 r/min離心30 min，收集上清。上清包被于ELISA板中，4℃孵育過夜；棄去上清液后PBST洗3次，加入10%BSA于37℃封閉2 h；PBST洗滌3次，加入兔抗小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β一抗37℃孵育2 h；PBST洗3次，加入HRP標記的二抗37℃孵育2 h；PBST洗滌3次后，加入TMB底物顯色，結果用酶標儀讀數，每個樣品重復3次。

1.3.7 Western blot檢測蛋白表達 將腦組織進行勻漿裂解，14 000 r/min離心30 min，收集上清。采用核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（碧云天，上海）提取蛋白。經SDS-PAGE凝膠電泳后，將樣品轉移至硝酸纖維素膜上；分別加入TLR4、MyD88、NF-κB p65一抗，4℃孵育過夜；PBS洗滌后加入HRP標記的二抗37℃孵育2 h，使用ECL Plus化學發光試劑盒（碧云天，上海）進行免疫印跡顯像，使用Image J軟件分析數據。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯胺酮對小鼠神經行為學的影響 神經行為學檢測結果顯示，與NC組相比，PD組步長、步頻降低，速度變化率顯著升高，且MNSS評分顯著升高，PD小鼠腳步細密，步態紊亂，符合PD的行走特征，且出現了神經功能缺損，提示建模成功；與PD組相比，PD+Keta-L組步長、步頻增加，速度變化率下降，且MNSS評分顯著降低（P＜0.05），而PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組間各神經行為學參數比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of neurological behavior scores between five groups表1 各組神經行為學評分比較 （n=10，±s）

Tab.1 Comparison of neurological behavior scores between five groups表1 各組神經行為學評分比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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2.2 氯胺酮對PD小鼠神經元形態的影響 HE染色顯示，與NC組相比，PD組小鼠腦組織結構紊亂，腦內黑質神經元數量減少，形態由均勻橢圓形轉化為不規則形，核仁染色明顯，胞漿染色變深，呈凋亡樣改變；PD+Keta-L組和PD+Keta-M組腦組織紊亂結構得到改善，且異常形態細胞比例顯著降低；而PD+Keta-H組相較于PD組無明顯改善，見圖1。

2.3 氯胺酮對PD小鼠神經細胞TH陽性表達的影響 免疫組化染色結果顯示，與NC組相比，PD組TH陽性細胞比例及陽性著色強度均顯著降低（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組染色強度增高，TH陽性細胞比例增多（P＜0.05），而PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表2。

2.4 氯胺酮對PD小鼠神經細胞凋亡率的影響 TUNEL檢測細胞凋亡結果顯示，與NC組相比，PD組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組細胞凋亡率降低，而PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表2。

2.5 氯胺酮對PD小鼠腦組織炎癥因子水平的影響 與NC組相比，PD組TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組各指標顯著下降，但PD+Keta-M組、PD+Keta-H組與PD組比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

Fig.1 The brain tissues of mice in each group observed by HE staining(×400)圖1 HE染色觀察各組小鼠腦組織（×400）

Fig.2 TH expressions in nerve cells of each group detected by immunohistochemistry(×100)圖2 免疫組化檢測各組神經細胞中TH表達（×100）

Fig.3 The apoptosis rate of nerve cells in each group detected by TUNEL(×400)圖3 TUNEL檢測各組神經細胞凋亡率（×400）

Tab.2 Comparison of the proportion of TH positive cells and cell apoptosis rate between the five groups表2 各組TH陽性神經細胞比例及細胞凋亡率比較（n=10，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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Tab.3 Comparison of inflammation factor levels between five groups表3 各組炎癥因子水平比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of inflammation factor levels between five groups表3 各組炎癥因子水平比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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2.6 氯胺酮對小鼠腦組織TLR4相關蛋白表達的影響 Western blot檢測結果顯示，與NC組相比，PD組TLR4、NF-κB p65和MyD88的表達水平顯著上升（P＜0.05）；與PD組相比，PD+Keta-L組中TLR4、NF-κB p65和MyD88蛋白表達量明顯下降（P＜0.05），PD+Keta-M組TLR4及MyD88表達低于PD組（P＜0.05），NF-κB p65表達與PD組比較無明顯改變；PD+Keta-H組與PD組間各蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖4、表4。

Fig.4 Comparison of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 expression levels between five groups圖4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平比較

3 討論

PD的發病機制目前尚不明確且無理想治愈方案。目前臨床已有許多治療方法可以改善PD患者的運動功能障礙、認知功能低下等癥狀。有研究報道，經顱電刺激［9］、干細胞［10］等可以有效改善PD神經行為學變化和保護多巴胺能神經元，但針對PD的新型治療方案、藥物的開發以及療效的提升仍需要深入研究。氯胺酮作為臨床常用的麻醉劑，對神經系統具有重要影響。綜合現有研究發現，氯胺酮對神經功能的影響與使用劑量有關，不同劑量的氯胺酮效果存在顯著差異。Meng等［11］研究顯示，大鼠6 h內腹腔分次注射共100 mg/kg的氯胺酮可引起明顯的認知損傷和記憶力下降。李建立等［12］研究顯示，75 mg/kg氯胺酮可以下調G蛋白偶聯受體30表達水平，從而誘導發育期SD大鼠的神經細胞凋亡。屈瀚等［13］研究顯示，70 mg/kg氯胺酮可以顯著損害7日齡大鼠的神經細胞和認知功能，其機制為促進Caspase-3上調、Tau磷酸化及神經細胞凋亡。徐世霞等［14］采用100 mg/kg氯胺酮對SD大鼠麻醉后行脾切除術，結果顯示氯胺酮麻醉會損害幼年大鼠的學習記憶功能，但其效果是暫時的。武長君等［15］研究發現，高劑量（60 mg/kg）和中劑量（30 mg/kg）氯胺酮長期使用會影響大鼠的學習記憶能力和引起神經元凋亡，而低劑量對神經元則無明顯影響。因此，氯胺酮對神經的損害與使用劑量有關，但不同研究結論并不一致。低劑量或亞麻醉劑量的氯胺酮具有神經保護作用，如Fan等［7］研究顯示，亞麻醉劑量（8 mg/kg）的氯胺酮對PD小鼠具有神經保護作用；而Chen等［16］給予難治性抑郁癥患者單次低劑量（0.5 mg/kg）氯胺酮，結果顯示療效良好且可以改善患者的注意力持續性和反應控制能力。目前關于氯胺酮對PD影響的研究尚少。王丹丹等［17］發現，25 mg/kg氯胺酮可以抑制PD小鼠黑質中α-突觸核蛋白的異常表達，從而改善PD小鼠癥狀。Vecchia等［4］也認為，適當劑量的氯胺酮可以顯著改善PD的抑郁癥狀和步態異常。部分研究認為，氯胺酮改善神經組織損傷的主要機制在于對氧化應激反應的抑制，進而抑制其導致的神經炎癥及細胞凋亡［18］，因此氯胺酮常用于創傷后應激反應的治療。MPTP誘導的PD小鼠模型病理機制在于連續給藥過程中造成的氧化應激損傷、炎癥反應和黑質紋狀體變性、細胞死亡，與大部分神經損傷病理機制類似。本研究發現，25 mg/kg氯胺酮干預小鼠的神經功能缺損評分相對于PD組顯著下降，步態異常也得到一定程度的改善。此外，TH是多巴胺能神經元內催化左旋多巴形成多巴胺的特異性蛋白，其表達降低和活性下降是PD發病的典型病理學表現［19］。本研究結果顯示，低劑量氯胺酮處理后可以在一定程度上改善MPTP造成的腦組織損傷，提高TH陽性表達比例，減少神經細胞凋亡，而中劑量和高劑量氯胺酮則無明顯效果，與其他研究結論基本一致［6-7，19］。

Tab.4 Comparison of expression levels of TLR4,MyD88,NF-κB p65 between the five groups表4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of TLR4,MyD88,NF-κB p65 between the five groups表4 各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與PD組比較，P＜0.05

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TLR家族是研究較為深入的模式識別受體家族，主要表達于免疫細胞及中樞神經系統，在神經免疫中發揮重要作用，其中TLR4主要表達于神經小膠質細胞，而小膠質細胞的激活和炎癥介質釋放在神經炎癥中發揮關鍵作用。神經炎癥是PD病理過程中的重要環節，臨床研究發現，PD患者腦內多個區域有神經炎癥反應，并且表現為IL-1β等炎性因子水平明顯升高［20］。PD神經炎癥與星形膠質細胞和小膠質細胞活化有關，可能是神經元損傷的普遍原因［21］。TLR4/NF-κB是經典的炎癥信號通路之一，已被證實其參與PD黑質內的神經炎癥［22］。Zhang等［23］研究發現，PD小鼠內存在小膠質細胞活化和NF-κB核移位，促使TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子釋放，導致神經炎癥和PD病情的進展。TLR4是病原體識別受體之一，其配體脂多糖（LPS）可以激活下游MyD88、TIRAP、TRIF等因子及NF-κB信號通路，是誘導包括TNF-α、IL-1β、IL-6在內的炎癥介質產生的主要原因，從而調控刺激炎癥反應的發生［24］。部分研究已經探討了氯胺酮對炎癥反應的影響。徐昕等［25］研究顯示，氯胺酮可以顯著降低腰椎間盤突出根性痛大鼠的炎癥因子水平，并可以抑制c-JNK/CXCL1信號通路的激活。Zou等［26］研究顯示，氯胺酮對氣道炎癥反應有一定保護作用，其機制與mTOR介導的自噬通路有關。本研究結果顯示，PD組中TNF-α、IL-6、IL-1β水平及TLR4、NF-κB、MyD88表達較NC組顯著升高，提示PD腦組織中炎癥反應水平較高；低劑量氯胺酮處理后各炎性因子水平相對于PD組均有所下降，提示低劑量氯胺酮對PD神經炎癥反應存在一定抑制作用，與其他研究基本一致［25-26］。值得注意的是，高劑量氯胺酮對PD神經炎性無明顯作用，而中劑量氯胺酮輕微降低了TLR4和MyD88蛋白的表達水平，提示氯胺酮對神經炎性的影響與劑量關系密切，最佳劑量仍需進一步研究確定。

綜上，低劑量氯胺酮對PD小鼠有神經保護作用，其機制可能與炎癥相關因子TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、NF-κB表達水平及由此導致的神經細胞凋亡的抑制和TH上調有關，而高劑量氯胺酮對PD小鼠無神經保護作用。