藥物流產出血模型小鼠雌、孕激素水平與Th17/Treg亞群的關系

胡曉燕，郭桂芝，肖婷婷

藥物流產是避孕失敗后常見的一種妊娠終止方式。有研究者指出藥物流產后9%~10%的患者存在大出血，其中1%~3%的大出血患者需接受緊急治療；藥物流產后的出血量也明顯高于負壓吸引流產手術［1-2］。米非司酮能夠與孕酮（P）受體結合，降低P與人絨毛膜促性腺激素水平，形成子宮收縮、子宮軟化，達到終止妊娠的作用，但用藥后卻存在雌、孕激素失調的現象，導致子宮內膜修復障礙、前列腺素對子宮的收縮作用降低，在一定程度上延長了藥物流產后出血時間［3］。Th17、調節性T細胞（Treg）為近年來新發現的T細胞亞群，兩者能夠維持機體平衡并參與自然流產過程。有研究者指出Th17/Treg亞群也能夠參與到藥物流產的過程中，且Th17/Treg亞群的偏移對減少子宮出血具有重要的意義，但其在藥物流產過程中與雌、孕激素間的關系卻仍有待探討［4］。為明確藥物流產過程中Th17/Treg亞群與雌、孕激素間的關系，本研究開展動物實驗，并在實驗中加用宮清顆粒，旨在分析宮清顆粒在減少藥物流產出血中的作用并探討其機制，為藥物流產后子宮出血的治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、造模及分組 清潔級Balb/c雌鼠32只，雄鼠64只，購自山東大學實驗動物中心，（9.43±1.20）周齡，體質量（21.10±1.20）g，其中雌性小鼠無交配史，雄性小鼠具有正常的生育能力。小鼠購入后置于溫室（24℃）內自由飲水、攝食，相對濕度控制為60%~65%，每日給予12 h光照與12 h暗室，雄雌小鼠按2∶1比例于每日19：00合籠，次日9：00觀察雌性小鼠陰栓，發現陰栓之日記為妊娠第1天。通過隨機數字表法將32只雌性小鼠分為正常妊娠組（A組）、小劑量米非司酮組（B組）、大劑量米非司酮組（C組）、米非司酮+宮清顆粒組（D組），每組8只。

1.2 用藥方式 取米非司酮750μg研磨成粉狀，置于10 mL橄欖油中，制成米非司酮橄欖油溶液（75 mg/L），參照文獻［5］，分別將1.5 mg·kg-1·d-1和0.88 mg·kg-1·d-1作為米非司酮大劑量（流產率70%）和小劑量（流產率50%）。于妊娠第6天起，B、C組小鼠分別使用0.88 mg·kg-1·d-1、1.5 mg·kg-1·d-1米非司酮橄欖油灌胃，連續3 d；D組行1.5 mg·kg-1·d-1米非司酮灌胃的同時加用宮清顆粒（浙江愛生藥業有限公司，國藥準字Z20010177,10 g/袋）308.16 mg·kg-1·d-1，持續5 d，灌胃開始時間同B、C組。

1.3 標本采集 B、C、D組小鼠灌胃之日起于小鼠陰道內置入20 g定量棉球，每24 h更換1次，棉球取出后置入EP管，于4℃下保存；妊娠第11天4組小鼠經4%戊巴比妥鈉麻醉后取眼球血，隨后頸脫臼處死小鼠，取子宮組織，裁剪為1 mm×1 mm大小，以200目銅網研磨、過濾，經PBS沖洗1次后以Fiocoll密度梯度離心分離單個細胞，并送至實驗室。

1.4 實驗室檢查

1.4.1 子宮出血量測量 采用改良堿性正鐵血紅素法檢測子宮出血量。以氫氧化鈉（NaOH）洗脫收集B、C、D組定量棉球中的血漬，經堿化血紅蛋白光電比色法轉化為堿性正鐵血紅蛋白，分光光度計測量548 nm吸光度（A）值，再通過同樣的方法測得自身靜脈血A值，計算小鼠出血量。

1.4.2 血清檢測 通過放射免疫法檢測血清雌二醇（E2）、P水平，試劑盒由北京華英生物技術研究所生產（批號

20090620）。

1.4.3 Th17、Treg亞群及Th17/Treg比值檢測 收集子宮組織單個核細胞后將細胞密度調整為1×106個/mL，置入佛波酯（30μg/L）、離子霉素（1 mg/L）、莫能菌酸鈉（1.7μg/L）后于37℃、5%CO2環境下孵育4 h；隨后收集細胞，PBS沖洗2次，去上清后加入小鼠血清，再次溫室避光孵育30 min；加入外標抗體PC5-CD3、FITC-CD4、FITC-CD25、PC5-CD25（美國BD Pharmigen公司）至細胞懸液，4℃避光孵育30 min，PBS沖洗2次后去上清；BD固定穿膜試劑盒固定穿膜后置入外標抗體PE-IL-17A、PE-Foxp3（美國BD Pharmigen公司），4℃避光環境下孵育30 min；經穿膜緩沖液沖洗2次后去上清，PBS重懸細胞后轉管，采用流式細胞術雙染色法上機（FACS Calibur流式細胞儀，BD）檢測，以Winmidi 2.9分析Th17（CD3+CD4+IL-17A+）、Treg（CD4+CD25+Foxp3+）亞群及Th17/Treg比值。

1.4.4 逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測小鼠子宮組織白細胞介素（IL）-17A、IL-10、轉化生長因子（TGF）-βmRNA水平 異硫氰酸胍一步法提取子宮組織單個核細胞的總RNA，采用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，隨后取反轉錄產物2μL作為模板，并采用PCR儀進行擴增。IL-17A、IL-10、TGF-β及內參β-肌動蛋白（β-actin）引物均由上海博尚生物技術有限公司合成。IL-17A引物：上游5'-TCCACCGCAAT?GAACACC-3'，下游5'-CACCAAGCAGTTTGGGAC-3'，產物大小420 bp。IL-10引物：上游5'-ACCTGGACAACATACT?GC-3'，下游5'-TGGCTTGTTCCTCACTACTCTC-3'，產物大小301 bp。TGF-β引物：上游5'-CTGGTTGAGAGAAGAG?GAAA-3'，下游5'-AAGGAAAGGTAGGTGATAGT-3'，產物大小513 bp。β-actin引物：上游5'-ATGGATGACCATATG?GCT-3'，下游5'-ATGAGGTACTCTGTGAGGT-3'，產物大小569 bp。PCR總反應體系25μL，包括DNA模板5.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCl22μL，上、下游引物各0.25μL，10 mmol/L dNTP 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，焦炭酸二乙酯（DEPC）水14μL。反應條件：95℃預變性5 min；94℃1 min，58～60℃1 min，72℃1 min，于26個循環后70℃延伸10 min。以β-actin為內參，經Alpha凝膠成像系統分析圖像，計算IL-17A、IL-10、TGF-βmRNA相對表達水平。

1.5 統計學方法 選用SPSS 19.0統計軟件對數據進行處理，采用Kolmogorov-Smirnov法檢驗正態性，正態分布資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；采用Pearson相關分析血清相關指標與子宮組織相關指標的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠子宮出血量比較 藥物流產后B、C、D組小鼠子宮出血量分 別 為（30.85±4.70）μL、（24.87±3.94）μL、（19.57±2.28）μL，3組子宮出血量依次減少（n=8，F=17.866，P＜0.01）。

2.2 各組血清E2、P水平比較 藥物流產后，A、B、C、D組小鼠E2水平依次升高，而P水平依次降低（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of serum E2 and P levels after drug abortion between the four groups表1 藥物流產后各組小鼠血清E2、P水平比較（n=8，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05；表2、3同

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2.3 藥物流產后各組小鼠子宮組織Th17、Treg、Th17/Treg亞群比值比較 藥物流產后，A、B、C、D組小鼠Th17亞群、Th17/Treg亞群比值依次升高，Treg亞群依次降低（均P＜0.05），見表2。

2.4 各組小鼠子宮組織IL-17A、IL-10、TGF-β mRNA的相對表達量比較 藥物流產后，A、B、C、D組小鼠IL-17A mRNA的相對表達量依次升高，而IL-10、TGF-βmRNA的相對表達量依次降低（均P＜0.05），見表3、圖1。

Tab.2 Comparison of Th17,Treg and Th17/Treg subgroup ratios in mouse uterine tissues after medical abortion between the four groups表2 藥物流產后各組小鼠子宮組織Th17、Treg、Th17/Treg亞群比值比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of Th17,Treg and Th17/Treg subgroup ratios in mouse uterine tissues after medical abortion between the four groups表2 藥物流產后各組小鼠子宮組織Th17、Treg、Th17/Treg亞群比值比較 （n=8，±s）

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Tab.3 Comparison of IL-17A,IL-10 and TGF-β mRNA levels in mouse uterine tissues after drug abortion between the four groups表3 藥物流產后各組小鼠子宮組織IL-17A、IL-10、TGF-βmRNA的相對表達量比較（n=8，%，±s）

Tab.3 Comparison of IL-17A,IL-10 and TGF-β mRNA levels in mouse uterine tissues after drug abortion between the four groups表3 藥物流產后各組小鼠子宮組織IL-17A、IL-10、TGF-βmRNA的相對表達量比較（n=8，%，±s）

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Fig.1 The gel electrophoresis of IL-17A,IL-10 and TGF-βDNA of mouse uterine tissues圖1 小鼠子宮組織IL-17A、IL-10、TGF-βDNA凝膠電泳圖

2.5 血清E2、P與子宮組織相關指標的相關性分析 血清E2與Th17、Th17/Treg和IL-17A水平呈正相關，與Treg、IL-10和TGF-β水平呈負相關；血清P與Treg、IL-10和TGF-β水平呈正相關，與Th17、Th17/Treg和IL-17A水平呈負相關（均P＜0.05），見表4。

Tab.4 Correlation analysis between serum E2,P indexes and uterine tissue related indexes in mice after medical abortion表4 藥物流產后各組小鼠血清E2、P與子宮組織相關指標的相關性分析 （r）

3 討論

3.1 血清E2、P在妊娠中的作用及藥物流產過程對其水平的影響 在正常的妊娠過程中卵巢、胎盤及垂體會分泌各種激素，如雌、孕激素，其中P能夠在妊娠過程中發揮維持蛻膜正常發育的重要作用，而藥物流產過程中米非司酮則是與孕激素受體結合，使P無法發揮作用，進而終止妊娠。同時，正常的妊娠也類似于成功的半同種異體移植，在此期間母體免疫系統進行精細的調控，為母胎建立免疫耐受環境，因此T細胞在妊娠過程中同樣發揮重要作用［6］。本次研究顯示，藥物流產后，A、B、C、D組小鼠E2水平依次升高，而P水平依次降低，提示藥物流產后米非司酮、宮清顆粒促使小鼠E2明顯上升、P明顯降低。米非司酮是藥物流產的常用藥物，能夠與雌孕激素受體結合，進而對血清E2、P產生影響，終止妊娠。宮清顆粒由生蒲黃、馬齒莧、益母草等組成，能夠發揮清熱化瘀、益氣養血的作用。本研究中D組的E2、P水平得到更好的改善，這對于藥物流產后小鼠而言具有較多益處：（1）提高E2水平，促使子宮內膜增生，對子宮創面進行修復。（2）降低P水平，促使妊娠黃體萎縮，減輕孕激素對子宮內膜產生的影響。（3）強化子宮對前列腺素的敏感性，使子宮收縮能力得到恢復，進而排出蛻膜組織。

3.2 藥物流產過程對Th17、Treg和Th17/Treg亞群比值及對子宮出血量的影響 本研究4組小鼠Th17、Th17/Treg、Treg亞群比值均存在明顯差異，表明米非司酮、宮清顆粒在藥物流產過程中誘導Th17/Treg亞群向Th17偏移。在既往的研究中，Saito等［7］指出，正常妊娠狀態下Treg亞群比值偏高，Th17/Treg亞群向Treg偏移。Liu等［8］對復發性流產動物模型的研究中指出復發性流產Th17比例偏高，Th17/Treg亞群向Th17偏移。上述研究能夠與本次研究結果相互借鑒。另外，4組小鼠的IL-17A、IL-10和TGF-β mRNA表達量也存在明顯差異，其中IL-17A是Th17的特征性細胞因子，可作用于機體防御病原微生物感染［9-10］；IL-10、TGF-β是Treg的特征性細胞因子，能夠對機體的免疫進行調控，維持母胎免疫耐受，當兩者含量降低時可參與到流產的過程中［11-12］。本研究中米非司酮、宮清顆粒誘導Th17/Treg亞群向Th17偏移可能與2種藥物抑制IL-10、TGF-βmRNA表達，上調IL-17A mRNA表達有關。

藥物流產過程中如何有效防治子宮出血已成為臨床研究的熱點。本研究表明，藥物流產后B、C、D組小鼠出血量依次減少，提示使用米非司酮行藥物流產存在子宮出血現象，但隨著用藥劑量的增加出血明顯減少，同時藥物流產時加用宮清顆粒可有效減少出血。分析原因與米非司酮、宮清顆粒誘導Th17/Treg亞群向Th17偏移有關。同時，在中醫學中藥物流產后的子宮異常出血可歸屬于“產后惡露不絕”范疇，治療時當以活血祛瘀、益血養氣為原則［13］。宮清顆粒能夠發揮清熱化瘀、益氣養血的作用，故D組小鼠產后出血改善效果更顯著。

3.3 藥物流產過程中血清相關指標與子宮組織相關指標的關系 相關性分析結果提示藥物流產過程中血清E2、P與Th17/Treg亞群關系密切，提示雌、孕激素可能與T細胞亞群偏移共同參與了藥物流產及子宮出血過程。當前臨床研究中也有研究者指出Th17/Treg亞群與原因不明復發性流產及多種自身免疫性疾病關系密切，認為Th17/Treg亞群失衡可導致胎盤滋養細胞與胎兒的損傷，Th17/Treg亞群失調對自身免疫性疾病的發生、發展具有促進作用［14-15］。上述研究提示Th17/Treg亞群失衡可參與到多種疾病的發生、發展中，在藥物流產后異常子宮出血的防治中應當對其予以關注。

綜上所述，藥物流產中米非司酮、宮清顆粒能夠提高血清E2水平，降低P水平，并抑制IL-10、TGFβmRNA，提升IL-17A mRNA表達，誘導Th17/Treg亞群向Th17偏移。