基于網絡藥理學探討葶藶大棗瀉肺湯治療慢性心力衰竭的作用機制?

馮思穎，吳威妮，褚慶民，邱藝俊，李思寧△

1 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510000；2 廣州中醫藥大學第一附屬醫院

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種心臟疾病的嚴重階段或晚期階段，由心臟結構改變或功能失常導致，常見癥狀有活動耐量下降、呼吸困難、咳嗽咳痰、難以平臥、雙下肢水腫等。CHF 是臨床常見的危急重癥，根據心臟收縮/舒張功能障礙，可分為收縮性心力衰竭與舒張性心力衰竭，根據其不同臨床表現，可分為左心力衰竭、右心力衰竭、全心力衰竭［1］。目前患有CHF 的人數處于上升階段，且與年齡相關，患病率隨年齡增長而增加［2］。有研究［3］表明，55 歲人群中30%的人會發生心力衰竭，其5 年生存率為35%，住院后1 年死亡率為25%。目前對于CHF 的治療，主要控制基礎病，口服β-受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、醛固酮拮抗劑等［1］，可有效控制心衰發展，但仍存在不良反應多、經濟負擔重的缺點。因此，發揮中藥簡、驗、廉、便的作用顯得尤為重要。

根據癥狀特點，可將CHF 歸于中醫“心衰病”“喘證”“心悸”“水腫”范疇。葶藶大棗瀉肺湯出自《金匱要略》，可瀉肺行水，下氣平喘，是治療CHF的常用方，越來越多的研究證實其療效可靠［4-5］。但其作用機制尚不明確。通過網絡藥理學，可將藥物作用從分子、細胞到組織和有機體水平揭示藥物-基因-靶點-疾病之間的交互網絡關系［6］。本研究基于網絡藥理學理論，預測葶藶大棗瀉肺湯治療CHF 的機制，以期為臨床實踐提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 葶藶子、大棗活性成分獲取中藥系統藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）是一個大型數據整合平臺，既可對多種中藥進行活性成分分析及靶點獲取，還可建立藥物-靶點網絡及藥物-疾病網絡，有助于揭示中草藥的作用機制及中醫理論本質［7］。在TCMSP 平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別以“葶藶子”“大棗”為檢索詞檢索，獲得其化學成分，限定其口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，篩選出其活性成分。并通過Pubchem平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索出每一個活性成分的Canonical SMILES碼。

1.2 活性成分作用靶點獲取Swissarget Prediction 是一個用于生物活性小分子靶預測的網絡平臺，預測可在5 種生物中進行，可輸入活性成分SMILES 進行檢索［8］。將活性成分的Canonical SMILES 碼輸入SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetpre-diction.ch/），限定物種為“Homo sapiens”，篩選出每個活性成分的關鍵靶點蛋白名稱、基因名稱等信息。

1.3 CHF 相關靶點獲取以“chronic heart failure”為檢索詞，在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）中搜索CHF的相關靶點。

1.4 藥物-疾病交集靶點獲取將葶藶子、大棗相關靶點信息及CHF 相關靶點信息導入FUNRICH軟件，獲得的交集靶點即為葶藶子、大棗作用于CHF的預測靶點，并制作Venn圖。

1.5 構建中藥活性成分-靶點網絡使用Cytoscape 3.7.1 軟件對中藥活性成分-靶點網絡進行分析，體現中藥活性成分與藥物-疾病共同靶點之間的相互聯系，且根據化合物與靶點連接情況篩選出中藥作用于CHF的關鍵化合物。

1.6 PPI 網絡的構建及關鍵靶點篩選STRING數據庫可用于分析生物的蛋白質-蛋白質關聯［9］，將獲得的藥物與疾病共同靶點信息輸入STRING數據庫（https：//string-db.org/），選擇研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設定為隨機等置信度，數值為“confidence（0.990）”，并選擇隱藏網絡中斷開連接的節點，其余參數保持默認設置，得到葶藶子、大棗作用于CHF的PPI（靶蛋白相互作用）網絡。并通過Degree 值篩選出關鍵靶點。

1.7 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析將藥物-疾病交集基因導入DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），輸入靶基因名稱列表，設定其物種為“Homo sapiens”，進行基因本體論（gene ontology，GO）分類富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 葶藶子、大棗活性成分分析葶藶大棗瀉肺湯由葶藶子和大棗2味中藥組成，以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共獲得活性成分42 個，對其進行分析，發現其中11 個活性成分沒有靶點或無法搜索到其靶點。其余31 個活性成分包括谷固醇、山柰酚、細胞毒素、光千金藤堿、繡線菊堿A、香豆雌酚等。取其OB值前5位列出，見表1。

表1 葶藶大棗瀉肺湯中OB值前5位活性成分

2.2 活性成分潛在靶點預測將31 個活性成分Canonical SMILES 碼輸入SwissTarget Prediction，刪除重復項，得到556個預測藥物靶點。

2.3 CHF 靶點從Gene Cards 數據庫檢索到8232個疾病靶點。

2.4 藥物-疾病交集靶點將556 個化合物靶點與8232 個CHF 相關靶點基因進行映射，得到498個共同靶點基因。

2.5 構建中藥活性成分-靶點網絡將共同靶點基因及葶藶大棗瀉肺湯有效活性成分利用Cytoscape 3.7.1 軟件進行中藥活性成分-靶點網絡構建及分析，得出與共同靶點有聯系的活性成分共23個，其中葶藶子8個，大棗13個，葶藶子、大棗共有活性成分2 個（quercetin、beta-sitosterol）。網絡中有521個節點（其中中藥活性成分節點23個，靶基因節點498個）和2834條邊，由于圖中包含節點及邊數較多，難以完整直觀體現，現選葶藶子及大棗共同化合物成分且Degree值位于第二的化學物進行中藥活性成分-靶點網絡展示（quercetin）。Degree 值較高的前5 位化合物中，最高為富馬堿（Fumarine），其次為槲皮素（quercetin），山柰酚（kaempferol），二荷亞麻酸（Dihomo linolenic acid）和穆坪馬兜鈴酰胺（Moupinamide），這些活性成分可能是葶藶大棗瀉肺湯發揮治療CHF 的關鍵，見表2、圖1。

表2 葶藶大棗瀉肺湯關鍵活性成分基本信息

圖1 中藥活性成分-靶點網絡圖（quercetin）

2.6 PPI 網絡構建及關鍵靶點篩選將映射得到的498 個交集靶點導入STRING 數據庫進行PPI網絡分析，基于confidence（0.990），網絡中發生蛋白相互作用的靶點有132個，177條邊代表了蛋白間的相互作用。將得出的PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行分析，根據Degree 值大小，推測葶藶子、大棗治療冠心病與CKD1、AKT1、CCNB1、STAT3、CCNA2、CDC25C、PLK1、CKD2、CCNB2、CDC25A等靶基因關系較大，見圖2—3。

圖2 葶藶大棗瀉肺湯關鍵靶點網絡圖

圖3 葶藶大棗瀉肺湯治療慢性心衰靶蛋白PPI網絡圖

2.7 GO 功能分析498 個藥物-疾病交集靶點作用了175 個生物學過程（P＜0.05），選取P值排名前20 的功能信息。結果顯示，葶藶子、大棗活性成分主要富集在信號轉導、蛋白質磷酸化、對藥物的反應、凋亡過程負調控、細胞增殖正調控、炎癥應答、蛋白質磷酸化、細胞增殖、肽基?酪氨酸磷酸化、肽基?絲氨酸磷酸化、ERK1和ERK2級聯的正調控、血小板激活、細胞遷移的正調控、胞質鈣離子濃度的正調控、配體受體信號通路、白細胞游走、對乙醇的應答、膽堿能突觸傳遞、G 蛋白偶聯受體信號通路（偶聯到環核苷酸第二信使）、血管收縮的正向調節等生物活動過程中。結果顯示，細胞成分（cellular constituent，CC）分析富集基因數量較大的有等離子體膜、胞體、質膜整體組分、核漿、細胞膜等；分子功能（molecular function，MF）分析富集基因數量較大的有蛋白結合、ATP 結合、蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等，見圖4—6。

圖4 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點GO通路富集分析的BP分析

圖5 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點GO通路富集分析的CC分析

圖6 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點GO通路富集分析的MF分析

2.8 KEGG 通路富集分析通路富集分析發現，該489個靶點主要富集在121條通路上（P＜0.05），其中20 條通路與CHF密切相關，其中前20 條主要通路包括神經活性配體-受體相互作用、癌癥通路、PI3K/Akt 信號通路、癌癥中的蛋白多糖、cAMP信號通路、黏著斑、鈣離子信號通路、胰島素抵抗、血清能突觸、前列腺癌、甲狀腺激素信號通路、T細胞受體信號通路、孕酮?介導的卵母細胞成熟、HIF-1 信號通路、急性髓樣白血病、胰腺癌、神經膠質瘤、催乳素信號通路、癌癥的中心碳代謝、非小細胞肺癌，提示葶藶大棗瀉肺湯可通過多條通路作用于CHF，見圖7。

圖7 葶藶大棗瀉肺湯活性成分潛在靶點KEGG通路富集分析

3 討論

本研究基于網絡藥理學方法，應用相關數據庫及軟件對葶藶大棗瀉肺湯治療CHF 的作用機制進行探討。葶藶子、大棗共有42 種活性成分，共包括有556 個基因靶點，與CHF 的交集靶點有498個，進一步提煉分析出葶藶大棗瀉肺湯治療CHF的生物進程、細胞功能、分子功能，發現涉及信號轉導、蛋白質磷酸化、對藥物的反應、凋亡過程負調控、細胞增殖正調控、炎癥應答、蛋白質磷酸化、細胞增殖、肽基?酪氨酸磷酸化、肽基?絲氨酸磷酸化、ERK1和ERK2級聯的正調控、血小板激活、細胞遷移的正調控、胞質鈣離子濃度的正調控、配體受體信號通路、白細胞游走、對乙醇的應答、膽堿能突觸傳遞、G 蛋白偶聯受體信號通路（偶聯到環核苷酸第二信使）、血管收縮的正向調節等分子功能，這與CHF的發生發展有一定聯系。

KEGG 通路富集分析發現20 條通路與CHF 發病顯著相關。葶藶大棗瀉肺湯可能作用于以下通路，從而對CHF的治療發揮作用。

環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是普遍存在的第二信使，可維持線粒體穩態，調節線粒體動力學，并調節細胞應激反應和其他信號傳導途徑［10］。其對于心臟，cAMP 是心臟生理學及病理生理學的關鍵調控因子，其介導的信號轉導復合物是腎上腺素能應激時心率、心臟收縮力和舒張力的重要調控因子之一，持續的激活cAMP通路，可能會導致心力衰竭進展［11］。

PI3K的活化和其下游的AKT是心臟保護作用重要信號傳導途徑。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是AKT 的下游靶點，用雷帕霉素抑制mTOR 可預防心臟肥大，抑制心臟衰竭［12］。在心力衰竭中，AKT 的短期活化可有利于血管的形成、抑制細胞自噬、調節心肌能量代謝、調節鈣離子通道、影響心肌炎癥反應等，但長期的AKT 活化會導致心肌細胞功能損傷，因此，維持AKT的平衡尤為重要［13］。

胰島素抵抗和心臟胰島素代謝信號傳導的相關減少正在成為心力衰竭發展的主要因素，導致心臟胰島素抵抗發展的主要因素是氧化應激，高血糖，高脂血癥，脂肪因子/細胞因子分泌失調和腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統（RAAS）及交感神經系統的不適當激活［14］。PI3K/Akt 通路被認為在胰島素效應中起重要作用［15］。在胰島素抵抗和2 型糖尿病患者中，由于線粒體功能障礙導致的線粒體氧化磷酸化減少，抑制胰島素誘導PI3K 活性，并導致胰島素刺激后AKT2 活性降低，從而對心肌細胞產生不利影響［16］。

心肌細胞重塑和轉換的途徑，重點是Ca2+信號傳導、自噬和細胞凋亡。Ca2+處理，通過自噬進行細胞內循環，以及通過細胞凋亡進行程序性細胞死亡，這些都是正常心臟功能所必需的［17］。Ca2+信號傳導在心肌細胞中受到高度調節，并決定了心肌收縮的力量。Ca2+循環是指細胞內Ca2+的釋放和再攝取，可驅動肌肉收縮和放松。在衰竭的心臟中，Ca2+循環被徹底改變，導致收縮性受損和致命的心律失常［18］。失敗的心肌細胞的標志是改變的激發-收縮偶聯，包括減少的Ca2+瞬變，以及那些瞬變的延遲發作和衰變。這些變化最終導致心肌收縮力減弱，收縮延遲，放松減緩［17］。

CHF 被認為是循環系統中T 細胞活化和炎性細胞因子產生增加的慢性炎癥狀態。有研究［19］將CHF 患者和健康對照組T 細胞和單核細胞中細胞因子的基因表達和表面活性標記物的表達進行對照，CHF 患者的T 細胞表面活化標志物CD69 和CD25 表達增加，認為T 細胞可能是慢性心衰炎癥反應的一部分，預防不必要的T 細胞活化可能成為治療CHF的新靶點。

甲狀腺激素極大地影響心臟的能量穩態［20］。長期過量甲狀腺激素暴露可能對心臟形態和功能產生不利影響，因為其可能增加左心室質量、動脈硬化和左心房大小，并可能誘發舒張功能障礙，從而影響左心室功能。而甲狀腺功能減退癥的特點是由于心率和腦卒中量的降低而導致的低心排血量。

由于舒張功能受損和血容量減少，心臟預負荷降低。雖然耗氧量減少，但其心臟能量效率卻受到損害［21］。HIF-1 是一種轉錄因子，在所有動物物種中均作為氧穩態的主要調節劑［22］。疾病與HIF-1 可相互影響，循環系統將血液分配到每個組織，并輸送氧氣和營養。血液循環紊亂會減少氧氣的輸送，從而導致組織缺氧，這種缺氧發生在多種心血管疾病中，包括動脈粥樣硬化，肺動脈高壓和心力衰竭。盡管可由于心血管疾病而誘發組織缺氧，但缺氧信號本身具有調節組織重塑過程或心血管疾病嚴重性的能力。HIF-1 在心力衰竭（氧供需不匹配）情況下可被激活，可活化的肌細胞調控與氧供應、代謝、收縮特性有關的基因，在負荷誘導的心肌肥厚的形成和重構中發揮作用［23］。

本研究通過網絡藥理學分析及文獻查閱，發現葶藶大棗瀉肺湯有可能通過多條途徑作用于CHF，且大部分作用通路均與CHF 有密切聯系，但是由于現代對葶藶子、大棗的研究不多，因此其具體活性成分作用機制尚不明確，有待進一步研究。但可以確定葶藶大棗瀉肺湯可通過多成分、多靶點、多通路治療CHF，其具體機制需要開展相關研究進行驗證。