小柴胡湯化裁方對AD 小鼠記憶認知能力及海馬神經元形態的影響?

陳 靖，王 卉△，劉曉丹，許欣竹，劉文俊，謝 鑫

1 遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847；2 中國中醫藥國際合作中心

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種認知功能障礙及漸進性記憶障礙的神經系統退行性病變，其特征性病理主要標志是β淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉積形成的細胞外老年斑和由Tau蛋白過度磷酸化形成的神經細胞內神經原纖維纏結（NFTs）及神經元丟失伴膠質細胞增生［1］。

相關研究［2-4］證實，有效心理干預可緩解高齡癡呆患者抑郁表現，改進各項生活功能。而情志不暢，氣機升降失常，易生濕釀痰，導致經絡失養，誘導發生AD，加重病情，小柴胡湯是調暢氣機代表方劑，本研究觀察疏肝理氣，補腎填精的小柴胡湯化裁方對AD 小鼠水迷宮測試學習記憶能力和海馬組織形態學的影響。

1 材料

1.1 動物SPF 級雄性昆明種小鼠（遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供）60 只，體質量20～30 g，SPF 級飼料喂養，自由飲水，溫度20～25℃，濕度55%～65%。

1.2 藥物尼莫地平（亞寶藥業，國藥準字H14022821，規格：20 mg×50 s）；小柴胡湯化裁方（柴胡40 g，黃芩15 g，人參15 g，半夏15 g，炙甘草10 g，生姜10 g，大棗4枚，肉蓯蓉20 g，熟地黃20 g），適量水煎，大火煎沸后，再用小火煎20～30 min。頭煎30 min，第二次煎煮20 min，合并兩次藥液，在室溫條件下濃縮成含生藥1 g/mL的藥液備用。

1.3 試劑Aβ1-42（Sigma）；4%多聚甲醛（武漢博士德）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（Solarbio 公司，貨號：G1120）。

1.4 設備Morris 水迷宮視頻分析系統（成都泰盟公司）；DW-5 型腦立體定位儀（成都泰盟公司）；BX-50型光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.5 方法

1.5.1 造模及分組給藥 將小鼠隨機分為正常組、模型組、西藥組及中藥高、中、低劑量組，每組5 只。除正常組外，其他各組參考文獻［5］制備AD小鼠模型，實驗前將Aβ1-42用生理鹽水稀釋成5 μg/μL，放37℃恒溫水浴鍋中孵育7 天，老化呈凝聚絲狀。各組小鼠用5%的水合氯醛麻醉，固定于腦立體定位儀上，常規消毒后，切開頭皮，以雙側海馬CA1 區為給藥點，定位點位于前囟后2.3 mm，矢狀縫兩側旁開1.8 mm，進針深度為顱骨表面向下2.0 mm。用微量進樣器向每只小鼠雙側海馬各注入5 μg/μL Aβ1-42。進針速度為1 mm/min，注射速度為1 μg/min，留針5 min后以同樣速度緩慢拔出進樣器。術后消毒縫皮，常規飼養。造模后7天開始給藥，中藥組灌胃小柴胡湯化裁方高（40 g/kg）、中（20 g/kg）、低（10 g/kg）劑量（按照人與小鼠體表面積比換算給藥等效劑量），西藥組灌胃尼莫地平15 mg/kg，正常組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續21天。

1.5.2 Morris 水迷宮實驗 學習記憶檢測：藥物干預后采用Morris 水迷宮對小鼠進行行為學檢測，測試內容包括第1～4 天的定位航行和第5天的空間探索。Morris 水迷宮裝置為一直徑為100 cm，高約70 cm的圓形桶，將第三象限設置為目標象限，象限中心放置逃生平臺，距離液面以下2 cm。在整個實驗期間位置保持不變。水池上方約2 m 處放置攝像機，自動釆集小鼠游泳圖像，將所收集實驗信號輸入計算機，利用圖像自動采集和分析系統對實驗小鼠的運行軌跡、逃避潛伏期、各平臺象限的游泳時間和路程等參數進行自動分析處理。定位航行：將小鼠面對池壁從1、2、3、4 象限分別緩慢放入水中，逃逸潛伏期以90 s計算，可人為將其拿到平臺上并停留10 s 后，再從另一象限入水。第5 天進行空間探索實驗，移去平臺，小鼠從選定象限頭朝池壁入水，記錄小鼠90 s 內穿越原平臺所在位置的次數。

1.5.3 HE 染色 取4%多聚甲醛固定的海馬組織，固定組織脫水、透明，樣本浸蠟包埋，石蠟包塊切片，脫蠟處理，蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察AD小鼠海馬組織形態。

1.6 統計學方法采用SPSS 23.0軟件分析數據，計量資料以表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水迷宮實驗結果各組逃避潛伏期隨著訓練天數的增加而逐漸下降，前3天各組無明顯差異，第4天，與正常組比較，模型組潛伏期增加（P＜0.05），提示AD 小鼠出現空間學習障礙；與模型組比較，中藥高劑量組和西藥組潛伏期縮短（P＜0.05）。模型組小鼠穿越平臺次數少于正常組（P＜0.05），說明癡呆小鼠記憶力下降；與模型組比較，中藥各組癡呆小鼠穿越平臺次數均不同程度增加，中藥高劑量組和西藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1—2。

表1 各組小鼠水迷宮實驗結果（）

表1 各組小鼠水迷宮實驗結果（）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

圖1 小鼠逃避潛伏期

圖2 小鼠空間探索次數

2.2 海馬組織HE染色結果模型組小鼠海馬神經細胞增加，錐體神經細胞帶不完整，神經元喪失，部分為膠質細胞所取代。正常組細胞排列緊密，核染均勻，與模型組比較，中藥高、中劑量組和西藥組海馬神經細胞形態及神經元喪失減輕，膠質細胞呈散在分布。見圖3。

圖3 海馬組織HE染色結果（×200）

3 討論

AD 是一種進行性、發病隱匿的神經系統性病變之一［6-9］，淀粉樣蛋白沉積后誘導膠質細胞活化，神經元損傷，促進上調炎癥反應［10］，并誘發學習記憶能力減退，病情呈進行性發展。相關研究顯示，在AD 致病因素中，抑郁情緒高于50%［11］，據此，BENNETT 等［12］提出抑郁癥可能是引發AD 的1項因素，此癥狀為AD的前驅病癥。

AD 病因復雜，較常見的學說包括Aβ 毒性假說、膽堿能學說、炎癥刺激反應學說、自由基損傷學說、Tau蛋白異常磷酸化等［13-15］。AD發病群體中抑郁癥可能是重要致病危險因素，并且抑郁癥癥狀在AD 臨床診斷之前就已出現。抑郁癥患者患AD 的發病率高于非抑郁癥者［16］。AD 發病機理以肝氣凝聚、髓海空虛、腎精缺乏為主。對于高齡者而言，腎精氣虛，不能充分滋養髓海，反應性降低，神情木訥。諸多消極因素包括空虛、抑郁、生活壓力等均會導致肝失疏泄，心理抑郁，經絡受阻，長期以往導致瘀、濕、痰等的形成，無法充分滋養腦海，導致認知困難。

本研究以小柴胡湯為基礎方化裁，可理氣開郁，補腎填精，切中AD 病機。水迷宮實驗顯示，模型組小鼠潛伏期增加，跨越平臺次數減少，中藥尤其是高劑量干預小鼠潛伏期縮短，跨越平臺次數增加，說明模型組小鼠學習記憶能力下降，而中藥干預有效。海馬區神經細胞HE 染色說明模型組小鼠符合AD 疾病發展規律，神經元缺失，細胞松散，導致負責學習記憶功能的海馬組織受損傷，進而出現行為學變化，高劑量中藥從AD 病機出發，能有效改善AD 小鼠學習記憶能力，保護海馬神經元組織。