分段發酵模式對郫縣豆瓣甜瓣子發酵過程中微生物及產品品質的影響

李雄波，鄧維琴，李 恒,2，范智義，李潔芝,2，陳 功,2,*

（1.四川省食品發酵工業研究設計院有限公司，四川 成都 611130；2.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山 620030）

郫縣豆瓣是以蠶豆、辣椒、面粉和食鹽等為原料釀制而成的傳統調味品，其生產工藝包括3 個重要發酵階段：紅辣椒→辣椒胚發酵階段、蠶豆→甜瓣子發酵階段和辣椒胚-甜瓣子混合發酵階段[1]。其中，蠶豆→甜瓣子發酵階段又可分為制曲和甜瓣子發酵兩個重要工序，制曲是指蠶豆瓣經漂燙處理后與面粉、曲精混合發酵制得豆瓣曲的過程[2]，甜瓣子發酵則是指豆瓣曲與一定比例鹽水混合后發酵得到成熟甜瓣子的過程[3]。甜瓣子作為郫縣豆瓣重要的物質成分之一，傳統釀造工藝以自然發酵為主，該方式發酵周期一般在6 個月以上，有的甚至超過1 a。因此，部分企業為縮短發酵時間，采用高溫（30～40 ℃）發酵，但高溫條件下優勢微生物迅速增殖，而其他微生物生長弱勢，加之發酵時間較短，導致高溫發酵甜瓣子風味不如自然發酵甜瓣子風味醇厚[4]。

溫度是影響發酵進程和產品品質的重要因素。日本高鹽稀態發酵醬油普遍采用低溫發酵工藝，即先10～15 ℃發酵15～30 d，然后溫度上升至25～30 ℃繼續發酵3～12 個月[5]。張海珍[6]研究發現日式低溫型高鹽稀態發酵工藝所釀醬油產品品質好，尤其是風味化合物種類和含量較高，但發酵周期較長。張靈[7]研究發現采用先低溫后高溫發酵的豆瓣醬，其營養物質和理化指標均優于先高溫后低溫發酵豆瓣醬，且先低溫后高溫發酵模式能有效縮短發酵時間。這主要是由于豆瓣醬在先低溫后高溫發酵過程中細菌菌群組成更豐富[8]。此外，食鹽含量也是影響發酵的重要因素之一。食鹽含量過高會抑制酶活性及酵母菌、乳酸菌等有益微生物的生長，延長發酵周期；食鹽含量過低則對雜菌抑制作用弱，導致腐敗菌滋生[9]。Su等[10]認為NaCl對蛋白酶活性有很強的抑制作用，當NaCl從5%提高到14%，蛋白酶活性下降73%。本項目組前期研究結果表明，甜瓣子中食鹽含量越低，發酵速度越快，但低鹽甜瓣子（食鹽質量分數為6%和9%）存在總酸含量過高、產品品質較差等弊端[3]。

本研究在借鑒日式低溫型醬油發酵工藝基礎上，結合項目組前期研究成果，合理調整甜瓣子發酵過程中溫度和食鹽含量，建立2 種“先低鹽后高鹽、先低溫后高溫”的分段發酵模式，并比較發酵特性，以期為企業改善甜瓣子品質提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆、食鹽、面粉 市售；曲精（米曲霉3.042）濟寧玉園生物有限公司；平板計數瓊脂、孟加拉紅培養基（生化試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、37%甲醛溶液、鹽酸（均為分析純） 成都市科隆化學品有限公司；組胺、腐胺、酪胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、乙腈、脯氨酸（均為色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；丹磺酰氯（色譜純） 美國霍尼韋爾公司；正己烷、甲醇、丙酮（均為色譜純） 德國Merck公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純） 阿法埃莎（中國）化學有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010氣相色譜-質譜（gas chromatographmass spectrometry，GC-MS）聯用儀 日本島津公司；DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫公司；固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭） 美國Supelco公司；LC-2030高效液相色譜儀日本島津公司；DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；PHSJ-4F型pH計 梅特勒型-托利多國際貿易（上海）有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZF-75L-H高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；SPX-150B-4生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 制曲

參考陳廷廷等[2]方法進行，并稍作調整。將蠶豆瓣放入沸水中漂燙3 min后立即撈出，用冷水冷卻到室溫，瀝干水分后與17%面粉和0.003%曲精混勻（均以干蠶豆瓣計），平鋪于簸箕內，蓋上棉布，放入30 ℃曲房中制曲48 h，12 h翻曲一次，即得豆瓣曲。

1.3.2 甜瓣子發酵

每組稱取2.5 kg豆瓣曲和2.5 kg鹽水混勻制得醬醅，通過調節食鹽添加量控制醬醅中的食鹽含量，醬醅裝入玻璃缸中后轉移至培養箱進行發酵。分段發酵模式1：前期食鹽質量分數為6%，12 ℃發酵12 d；中期食鹽質量分數為6%，37 ℃發酵4 d；后期食鹽質量分數為15%，37 ℃發酵14 d。分段發酵模式2：前期和中期食鹽質量分數為9%，其余條件與模式1相同。對照組采用傳統高溫發酵工藝，即在食鹽質量分數為15%條件下，37 ℃發酵30 d。定期對甜瓣子進行攪動養護，并取樣以供檢測分析使用。其中，模式1和模式2前期低溫低鹽發酵，主要是為了抑制各類微生物的生長，保證蛋白酶等酶類充分水解底物，為后續微生物進一步發酵奠定基礎；中期高溫低鹽發酵，促進有益酵母菌和乳酸菌的生長代謝[11]，使得氨基酸態氮及其他風味物質含量迅速提升；后期高溫高鹽發酵，高鹽條件抑制雜菌的生長，高溫條件促進甜瓣子后熟。

1.3.3 理化指標的測定

總酸含量的測定：根據GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》中酸度計法。

氨基酸態氮含量的測定：根據GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》中酸度計法。

1.3.4 微生物總數的測定

細菌總數的測定：根據GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中方法稍作調整，對甜瓣子中細菌總數計數用含有0.003%納他霉素的平板計數培養基傾注培養。

霉菌總數的測定：根據GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數》中平板計數法進行計數。

1.3.5 揮發性成分的測定

參照鄧維琴等[12]描述的頂空固相微萃取-GC-MS聯用技術進行檢測，并稍作調整，在樣品中加入2 μL 0.5 μg/mL的4-甲基-2-戊醇溶液作為內標物。揮發性化合物的鑒定由NIST11譜庫檢索結果與人工圖譜解析共同確定，化合物含量采用內標進行半定量分析。

1.3.6 生物胺的測定

根據陳功等[13]建立的豆瓣醬中生物胺高效液相色譜法進行測定。

1.3.7 感官評價

選取10 名（男5 名，女5 名）經過一定甜瓣子感官評定訓練的人員組成評價小組，評價人員從香氣、滋味、色澤、體態4 個方面對甜瓣子進行感官評分，以平均分作為產品指標的評分。感官評定標準見表1。

表1 甜瓣子的感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of broad bean paste mash

1.4 數據處理

數據采用Excel 2010進行統計分析，采用Origin 2010進行作圖。

2 結果與分析

2.1 甜瓣子發酵過程中微生物數量的變化

圖1 不同發酵模式下甜瓣子中霉菌總數（A）和細菌總數（B）的變化Fig.1 Changes in mold count (A) and total bacterial count (B) in broad bean paste mash in different fermentation modes

米曲霉被普遍認為是豆醬、面醬、郫縣豆瓣以及韓國大醬等發酵食品中的優勢微生物[4]。如圖1A所示，發酵起始時甜瓣子中霉菌總數在6.90（lg（CFU/g））左右。對照組中霉菌總數在整個發酵過程都呈逐漸下降的趨勢，發酵結束時霉菌總數為6.15（lg（CFU/g）），這與黃豆醬中霉菌變化規律一致[14]。分段發酵模式1和模式2中霉菌總數先穩定在6.89～7.12（lg（CFU/g））之間，之后快速下降，這主要是由于發酵中期溫度升高，微生物代謝活躍，有機酸、CO2等代謝產物不斷積累，造成發酵體系中酸度增加，含氧量下降，使得霉菌開始快速消亡，這在其他醬類產品中也常有報道[14-15]。此外，后期食鹽含量提高，高鹽環境不利于霉菌的生長[16]，進一步加速了霉菌的消亡。模式1和模式2中霉菌開始快速消亡的時間分別在12 d和16 d，這種差異是由于模式2發酵前中期食鹽含量相對較高，其發酵速度不及模式1，有害代謝產物積累速度較慢所致。

傳統發酵食品的發酵速度和產品品質與細菌的數量、菌群等密切相關[17]。如圖1B所示，起始發酵時甜瓣子中細菌總數較高，在7.27～7.36（lg（CFU/g））之間。對照組中細菌總數呈先下降后緩慢上升至趨于平穩的變化趨勢，發酵結束時細菌總數為7.10（lg（CFU/g）），和本項目組前期研究結果一致[3]，其主要原因是發酵過程中不耐受高溫高鹽條件的細菌逐漸消亡，而耐受性較強的細菌逐漸成為優勢菌群。2 種分段發酵模式中細菌總數變化情況相似，發酵前中期（0～16 d）細菌總數在7.25～7.36（lg（CFU/g））之間小范圍波動，發酵后期（16～30 d）細菌總數逐漸下降，發酵結束時分別為7.08（lg（CFU/g））和6.98（lg（CFU/g））。模式1和模式2前期發酵體系處于低溫環境，微生物生長代謝活動較弱，細菌數量波動較小；發酵中期溫度升高，有利于乳酸菌和酵母菌等微生物的代謝[11]，但乳酸菌和酵母菌的代謝產物又抑制了部分菌株的生長[18-19]，因此細菌數量整體趨于穩定；發酵后期，由于食鹽含量升高，不耐鹽的菌株生長被抑制，因此細菌總數呈現下降趨勢。

2.2 甜瓣子發酵過程中理化指標的變化

總酸是衡量甜瓣子品質的重要理化及衛生指標，郫縣豆瓣醬中限量為2.0%[20]。同時，甜瓣子中總酸主要由各種有機酸組成，是重要的滋味物質和多種風味物質的前體物質。如圖2A所示，對照組中總酸含量在發酵前期（0～12 d）快速上升，中后期（12～30 d）則逐漸趨于穩定，發酵結束時總酸質量分數為0.87%，與劉永琪[21]研究豆瓣醬中總酸變化情況一致。分段發酵模式1和模式2中，總酸含量在發酵前期（0～12 d）變化趨勢與對照組一致，但兩者總酸含量始終略低于對照組，這是由發酵溫度和食鹽含量的差異導致。3 種發酵模式前期，甜瓣子中總酸含量均快速上升，這是由于發酵初期體系中蛋白酶、淀粉酶等各類酶系含量豐富，使得淀粉、蛋白質等大分子物質快速水解形成單糖、氨基酸等小分子物質，而乳酸菌、酵母菌等微生物能快速利用這些小分子物質產生有機酸等酸性物質[22-23]。發酵中后期（12～30 d），模式1和模式2中總酸含量變化情況與對照組顯著不同，兩者總酸含量先快速上升后逐漸趨于平穩，發酵結束時總酸質量分數分別為0.96%和0.92%。有研究表明，低鹽甜瓣子（食鹽質量分數為6%和9%）發酵過程中總酸質量分數遠超過限量值2.0%，產品有明顯酸味，品質較差[3]。本研究模式1和模式2中總酸質量分數低于限量值2.0%，符合產品品質要求，且模式1和模式2中總酸質量分數明顯高于對照組，這可為甜瓣子中酯類化合物形成提供物質基礎，使其風味更加濃郁。

圖2 不同發酵模式下甜瓣子中總酸（A）和氨基酸態氮（B）質量分數的變化Fig.2 Changes in total acid (A) and amino acid nitrogen (B) contents of broad bean paste mash in different fermentation modes

甜瓣子中氨基酸態氮主要來自蛋白酶分解原料中蛋白質形成，其是重要的風味物質，與甜瓣子的色、香、味等密切相關，是衡量甜瓣子品質和發酵程度的最主要指標。如圖2B所示，對照組甜瓣子中氨基酸態氮質量分數在發酵前期（0～12 d）快速增加，由0.17%增加至0.65%，之后隨著發酵的進行氨基酸態氮含量幾乎穩定，與劉永琪[21]研究結果一致。這主要是由于制曲階段以米曲霉為代表的微生物大量繁殖產生蛋白酶[24]，因此發酵初期蛋白酶活性相對較高，分解蛋白質產氨基酸能力較強，但是隨著發酵的進行，高溫高鹽條件使得蛋白酶逐漸失活，因此氨基酸態氮質量分數未能進一步增加。模式1和模式2中氨基酸態氮含量變化情況在發酵前期（0～12 d）與對照組幾乎一致，雖然模式1和模式2中鹽含量相對更低，但發酵溫度也更低，低溫不是酶作用的最適溫度[25]，因此3 種發酵模式初期蛋白酶水解反應速率差異不大。然而，模式1和模式2中氨基酸態氮含量在發酵中期（12～16 d）快速上升，這是由于低溫條件可以長時間保留酶的活性[26]，當發酵中期溫度升高時，酶促反應速率顯著提高。發酵后期（16～30 d），模式1和模式2中氨基酸態氮含量呈緩慢下降或保持穩定的趨勢，這主要是由于蛋白酶失活和美拉德反應消耗氨基酸所導致[21]。發酵結束時，模式1、模式2和對照組中氨基酸態氮質量分數分別為0.76%、0.83%、0.66%，其中模式1和模式2中氨基酸態氮含量高于對照組，在一定程度上更有利于甜瓣子風味及色澤的形成。

2.3 生物胺含量分析

生物胺是一類具有生物活性的脂肪族、芳香族或雜環結構的含氮低分子質量有機化合物[26]，在人體生長發育過程中發揮著重要作用[27]，但過量攝入可能會引發中毒等健康問題[28]。根據實際情況，部分學者建議食品中生物胺總量應不超過1 000 mg/kg[28]。本項目組前期研究發現，低鹽甜瓣子發酵過程中生物胺含量超過限量，這主要是由于甜瓣子發酵過程中微生物菌群高度復雜多樣，潛在產胺微生物眾多，加之低鹽條件對微生物抑制作用較弱，因此容易導致生物胺污染。

圖3 不同發酵模式甜瓣子中生物胺含量Fig.3 Contents of biogenic amines in broad bean paste mash in different fermentation modes

圖3 為發酵結束時甜瓣子中生物胺含量情況，模式1、模式2和對照組甜瓣子中生物胺總量分別為122.93、126.50、176.12 mg/kg，三者均未超過1 000 mg/kg。Chun等[16]研究發現，韓國大醬中食鹽含量越低，生物胺含量越高。模式1和模式2發酵前期和中期均處于低鹽環境，但生物胺總量卻低于對照組，說明分段發酵可以保障產品中生物胺含量在安全范圍內。有研究表明，發酵溫度越接近微生物生長代謝的最適溫度，越有利于微生物代謝形成生物胺[29]。分段發酵過程中，甜瓣子長時間處于低溫環境，不利于微生物分泌生物胺，而對照組整個發酵過程都處于37 ℃環境中，從而導致微生物代謝形成生物胺較旺盛。對照組甜瓣子中8 種生物胺均被檢出，其中主要的生物胺為腐胺、尸胺、組胺、酪胺及亞精胺，含量分別為33.89、18.44、37.37、36.80、20.45 mg/kg。曾雪晴等[30]研究郫縣豆瓣醬中生物胺時發現，郫縣豆瓣醬中生物胺總量范圍在86.85～611.83 mg/kg之間，腐胺、尸胺、組胺及酪胺是豆瓣中主要的生物胺，與對照組中結果較為相似。模式1和模式2甜瓣子中生物胺含量及組成相似，模式1發酵甜瓣子中腐胺、尸胺和酪胺為主要的生物胺，含量分別為36.79、13.35、46.06 mg/kg，色胺未檢出；模式2發酵甜瓣子中腐胺和酪胺為主要的生物胺，含量分別為32.12、70.24 mg/kg，色胺和組胺未檢出。此外，對照組甜瓣子中組胺含量較高（37.37 mg/kg），與部分學者建議食品中組胺限量50～100 mg/kg[28]較為接近，可能存在一定風險；而分段發酵模式1和模式2甜瓣子中組胺含量較低或未檢出。總之，與對照組相比，分段發酵（模式1、模式2）甜瓣子中生物胺總含量更低，種類更少。

2.4 揮發性成分分析

甜瓣子中揮發性成分包括酯類、醇類、醛酮類、酚類、酸類和雜環類等化合物[31]。通過GC-MS分析3 種模式發酵甜瓣子中揮發性成分，總離子流圖見圖4，揮發性成分種類及含量見表2，GC-MS分析結果見表3。

圖 4不同發酵模式甜瓣子中揮發性成分GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram of volatile components in broad bean paste mash in different fermentation modes

由圖4可知，3 種發酵模式甜瓣子中揮發性成分離子出峰時間較類似，但強度存在較大差異，表明有共同揮發性成分，但含量差異較大。由表2、3可知，3 種發酵模式甜瓣子中檢測鑒定出39 種揮發性成分，其中共有成分14 種，包括3-甲基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、苯乙醇、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、壬醛、苯甲醛、丙酮、乙酸、3-甲基丁酸、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、十六烷酸甲酯、十四烷和二十一烷。結合劉平[32]和李治華[33]等研究結果表明，芳樟醇、苯乙醇、壬醛和苯甲醛等是郫縣豆瓣的特征風味物質之一。

表2 不同發酵模式甜瓣子中揮發性成分種類及含量Table 2 Types and contents of volatile components in broad bean paste mash in different fermentation modes

表3 不同發酵模式甜瓣子中揮發性成分GC-MS分析結果Table 3 GC-MS analysis of volatile compounds of broad bean paste mash in different fermentation modes

對照組中共鑒定出20 種揮發性成分，總含量為19.61 ng/g，其中含量較高的化合物主要有3-甲基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、苯乙醇、丙酮、乙酸、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、亞油酸乙酯。董丹等[34]從發酵2 個月甜瓣子中檢測出85 種揮發性成分，其中亞油酸乙酯、苯乙醇、乙酸、異戊酸等含量較高，與本研究存在一定異同，可能是發酵時間不同導致。模式1中共鑒定出26 種揮發性成分，總含量為31.85 ng/g，模式2中共鑒定出30 種揮發性成分，總含量為24.60 ng/g，兩者主要差異是模式1中酯類化合物種類和含量更豐富，而模式2中醇類化合物含量更高。3 種發酵模式甜瓣子中揮發性成分主要以醇類、醛酮類、酸類和酯類為主；而酚類和烷烴類含量較低，且三者之間差異較小。模式2中醇類化合物含量最高，而模式1中最低，但模式1中苯乙醇含量較高（1.09 ng/g），苯乙醇被認為是醬類產品中主要香氣成分之一[32]，其能賦予產品花香和蜂蜜氣味等香氣[31]。醛酮類化合物屬于不穩定的羰基類化合物，能賦予產品一定的花果香[35]，使甜瓣子整體風味更醇厚。模式1和模式2中醛酮類化合物種類豐富，含量較高，而對照組中醛酮類化合物種類和含量都不及模式1和模式2。酸類化合物給甜瓣子帶來不愉快的味道，一般只起調和作用[34]，模式1和模式2中酸類化合物含量較高，可能給甜瓣子風味帶來不利影響。酯類化合物是甜瓣子中主要的呈香成分，其能賦予甜瓣子特殊的甜香和果香[35]，同時能很好地掩蓋甜瓣子中有機酸帶來的不愉快氣味[36]。模式1、模式2和對照組中分別鑒定出酯類化合物7、5、3 種，含量分別為10.34、2.71、2.71 ng/g，模式1中酯類化合物含量是模式2和對照組的3.8 倍。甜瓣子中酯類主要通過高級脂肪酸和醇酯化反應形成[34]，這也可能是導致模式1中醇類化合物含量較低的原因。模式1甜瓣子中揮發性成分總含量最高，尤其是酯類化合物，而模式2中揮發性成分總含量次之，但化合物種類最多。Chun等[16]研究發現，低鹽大醬中揮發性成分含量高、種類多，與微生物生長密切相關。分段發酵（模式1、模式2）過程中，環境因素不斷變化，為微生物多樣性提供更多可能，復雜的菌群結構有利于多種代謝產物的形成，這些代謝產物再經過后期發酵過程中的各種化學反應產生了較多種類的風味物質。

2.5 感官評定

表4 不同發酵模式甜瓣子的感官評分Table 4 Sensory evaluation scores of broad bean paste mash in different fermentation modes

感官評定是對產品品質最直觀地反映，因此對不同模式發酵的甜瓣子產品進行感官評定，結果如表4所示。可以看出，3 種發酵模式下，甜瓣子樣品在色澤、香氣、滋味和組織形態方面存在一些異同。模式1甜瓣子樣品感官評定得分最高（80.61±0.87），其醬酯香較濃郁，味鮮醇厚；模式2甜瓣子樣品得分次之（75.7±0.82），其體態和滋味與模式1差異較小，但香氣不及模式1甜瓣子濃郁；對照組甜瓣子樣品得分最低（62.46±1.11），其醬酯香和鮮味都不及分段發酵（模式1、模式2）甜瓣子，且略帶霉味，表明對照組甜瓣子還未完全發酵成熟，延長發酵時間，其感官品質能有所提升。此外，郫縣豆瓣要求瓣粒酥脆，但分段發酵（模式1、模式2）的甜瓣子產品質地偏軟，在組織形態方面存在一定不足。整體而言，分段發酵的甜瓣子感官品質優于對照組，尤其分段發酵模式1發酵的甜瓣子產品。

3 結 論

以傳統高溫發酵為對照，研究了2 種分段發酵模式（模式1、模式2）對甜瓣子發酵過程中微生物及產品品質的影響。結果表明，不同發酵模式條件下，發酵過程中微生物數量變化情況存在顯著差異，進而導致不同模式發酵的甜瓣子產品品質指標差異。發酵結束時，模式1、模式2和對照組甜瓣子中總酸質量分數分別為0.96%、0.92%、0.87%，氨基酸態氮質量分數分別為0.76%、0.83%、0.66%，三者總酸質量分數均低于限量值2.0%，產品品質符合要求，而分段發酵（模式1、模式2）甜瓣子中氨基酸態氮含量更高，則有助于提升產品品質。此外，分段發酵（模式1、模式2）甜瓣子中揮發性成分種類更多，含量更高，尤其是模式1發酵甜瓣子中揮發性成分含量最高。感官評價結果顯示，模式1發酵甜瓣子醬香濃郁，味鮮醇厚，整體感官品質最佳，模式2發酵甜瓣子次之，對照組則最差。3 種模式發酵的甜瓣子中生物胺含量均遠低于建議限量1 000 mg/kg，且分段發酵甜瓣子生物胺污染的風險更低。分段發酵模式1和模式2條件下甜瓣子均能正常發酵，產品符合有關標準，與對照組相比，分段發酵能進一步改善產品品質，且模式1優于模式2。因此，本研究推薦的一種理想的分段發酵模式為：前期食鹽質量分數為6%，12 ℃發酵12 d；中期食鹽質量分數為6%，37 ℃發酵4 d；后期食鹽質量分數為15%，37 ℃發酵14 d。