基于基因組挖掘技術的新型谷氨酸脫羧酶基因挖掘及表達鑒定

李 祥，解玉麗，賈園園，張 閃，王紅艷，劉先吏，羅湘艷，唐存多,2,*

（1.南陽師范學院 昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，河南 南陽 473061；2.車用生物燃料技術國家重點實驗室，河南 南陽 473061）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是廣泛存在于自然界中的一種非蛋白質氨基酸，在醫藥、食品和化工行業均有較大的應用前景[1-2]。在醫藥行業，GABA作為一種抑制性神經遞質[3]，可用于調節血壓和治療精神疾病[4-6]。在食品行業，GABA可作為重要的食品添加劑，用于制備各種具有鎮靜安神、降壓補腦功效的功能性食品[7-8]。在化工行業，可用作生物可降解塑料——尼龍4的前體物質，進行可降解塑料的合成[9-10]。目前，GABA的合成方法主要包括化學合成、植物富集和生物合成法[2,11-12]。傳統的化學合成法能耗高、污染大，不利于可持續發展[13]。植物富集法又受限于原料中GABA含量較低，難以大規模生產。而生物合成法不受資源、環境和空間的限制，更綠色、更環保，它已在GABA合成領域最受青睞[1]。

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是磷酸吡哆醛依賴性酶，在L-谷氨酸不可逆脫羧生成GABA的過程中起關鍵作用[14]。GAD廣泛存在于各種生物體中，許多微生物均已檢測到GAD活力[15]。由于乳酸菌用于食品發酵的歷史悠久，且還具備一定的保健潛力，因此許多有關GABA和GAD的研究都聚焦于乳酸菌，主要包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）[16]、副干酪乳桿菌（L. paracasei）[17]、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）[18]、清酒乳桿菌（L. sakei）[19]、植物乳桿菌（L. plantarum）[20]、酵素乳桿菌（L. zymae）[21]、發酵乳桿菌（L. fermentum）[15]和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）[22]。然而，受限于乳酸菌生長速度緩慢，難以實現高密度發酵，因此從乳酸菌中提取GAD難以滿足GABA的大規模生產需求[15]。為了獲得足夠的GAD，以滿足GABA工業生產的需求，挖掘乳酸菌來源的GAD并實現在大腸桿菌（Escherichia coli）中高效異源表達受到了廣泛關注[15,23]。迄今為止，盡管已有許多關于GABA和GAD的研究報道，但它們產業化程度仍不高，大多數都停留在實驗室水平的研究階段。這主要歸因于GAD的催化活性低、穩定性和pH值適應性差，以及生物催化法制備GABA酶的使用成本太高。如何獲得催化活性高、穩定性好的優良GAD已成為企業和科研人員當前所面臨的巨大挑戰，也是降低生物催化法制備GABA生產成本所必須突破的瓶頸[24-25]。

自然界中蘊藏著豐富的未被人工培養微生物及未被發掘新型酶資源，發掘這些未知的酶類并加以適當改造以滿足工業化生產的需求，吸引了廣大科研工作者的關注[26]。隨著高通量測序技術的不斷發展，基因組序列數據也日益豐富，為新酶的挖掘提供了豐富的基因資源[27-28]?；蚪M挖掘技術可以繞過傳統的微生物分離篩選及蛋白的分離純化等過程，實現從基因組數據庫到真實酶數據庫的跨越，進一步豐富了可被利用或改造的酶資源[29-30]。

本研究擬借助基因組挖掘技術，從公認安全的（generally recognized as safe，GRAS）有益細菌的基因組中挖掘新型的GAD基因，利用E. coli作為宿主，構建能夠高效表達重組GAD基因工程菌，并進行全細胞催化L-谷氨酸合成GABA的研究，旨在為實現GABA高效、廉價的綠色生物合成奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

L-谷氨酸、磷酸吡哆醛、硼酸、苯酚、次氯酸鈉、GABA標準品 北京索萊寶科技有限公司；三乙胺、苯異硫氰酸酯（phenylisothiocyanate，PITC） 麥克林化學試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純） 天津科密歐化學試劑有限公司；一站式His標記蛋白質微量純化套裝 北京天恩澤基因科技有限公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.1.2 菌株、質粒與培養基

攜帶原核表達質粒的E. coliBL21/pET28a菌株由本課題組保藏[9]，主要用作GABA生物合成反應的陰性對照。

LB培養基：10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉和5 g/L酵母提取物，制作固體平板時添加15 g/L瓊脂粉，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，用于E. coli的培養。

1.2 儀器與設備

PowerPac? HC/Mini-PROTEAN?蛋白電泳系統、UNIVERSAL Hood凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Hypersil C18柱 美國Thermo Scientific公司；UV1000紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新型GAD的基因挖掘

以研究比較透徹、催化活性較高的L. brevis來源GAD（LbGAD）蛋白序列為探針[31-32]，以GRAS有益細菌（主要包括乳酸菌、腸球菌）的基因組序列為搜索對象進行BLAST分析，從搜索到的序列中找出一系列基因組信息來源且未經表達鑒定、假定的GAD蛋白。然后，對這些潛在的GAD蛋白序列利用ClustalX2和MEGA6.0軟件進行多序列比對和進化樹的構建?；趯M化樹的分析，選定幾個代表性的序列借助Optimizer服務器以E. coliK12菌株的密碼子使用頻率表為依據，進行密碼子優化。經過對目標基因和表達質粒多克隆位點的酶切位點分析后，在目標基因的上下游分別加上合適的酶切位點，最后委托蘇州泓迅生物科技有限公司進行全基因的合成。

1.3.2 重組E. coli的誘導表達

采用低溫、低誘導劑濃度的誘導策略進行[33]。分別將E. coliBL21/pET28a和攜帶不同GAD編碼基因的重組E. coli單菌落接種至4 mL含50 μg/mL卡拉霉素的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養14 h，以2%接種量轉接至100 mL新鮮LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min再培養約2.5 h，加入1 mol/L IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導培養20 h；取10 mL菌液于8 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體，將菌體重懸后進行超聲破碎，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[33]。重組酶的純化按照一站式His標記蛋白質微量純化套裝試劑說明書進行。

1.3.3 酶活力分析

由于PITC衍生化所需的時間較長[34]，不利于GABA的快速定量，因此本研究中重組GAD活力的快速測定參照比色法[35-36]略作修改。酶活力測定的反應體系為1 mL，包含0.01 mmol/L磷酸吡哆醛、20 mmol/LL-谷氨酸、200 mmol/L pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，37 ℃保溫2 min后加入100 μL稀釋適當倍數的酶液，迅速混勻后反應5 min，迅速放入沸水浴終止反應。取400 μL反應液，依次加入400 μL 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸緩沖液、1.0 mL 6%苯酚和1.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯大于7.5%），充分振蕩后，沸水浴中反應10 min迅速在冰浴中冷卻顯色20 min，待呈現藍綠色后加入2.0 mL 60%乙醇溶液，最后在643.5 nm波長處測定吸光度，以底物溶液中加入等量蒸餾水為對照組。由此快速測定反應生成GABA的量，以測定GAD活力。在測定條件下每分鐘生成1 μmol GABA所需的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.3.4 重組酶的溫度特性分析

參照1.3.3節方法，分別在30～60 ℃（以5 ℃為間隔）測定各重組酶的催化活性以獲得最適反應溫度；將各重組酶分別在20～60 ℃（以5 ℃為間隔）保溫1 h，然后在各自最適反應溫度下測定各自的殘留酶活力，以冰浴保存1 h后的殘余酶活力為100%，以此考察各重組酶的熱穩定性。

1.3.5 重組酶的pH值特性分析

參照1.3.3節方法，在各自最適反應溫度下，分別在pH 2.0～6.0（以0.5為間隔）下測定各重組酶的催化活性以獲得最適反應pH值；將各重組酶分別在pH 2.0～6.0（以0.5為間隔）緩沖液中冰浴1 h，然后在各自最適反應溫度和最適反應pH值下測定各自的殘留酶活力，以未經處理為100%，以此考察各重組酶的pH值穩定性。

1.3.6 重組酶的動力學參數

將輔酶磷酸吡哆醛的終濃度定為0.01 mmol/L，逐步提高底物的終濃度，測定各酶在不同底物濃度下的反應速率，利用Origin 9.0軟件進行非線性擬合，得出各酶對底物的Km、Kcat和Vmax值。

1.3.7 重組E. coli全細胞轉化L-谷氨酸合成GABA

為了提高GABA生產的時空得率，本研究采用邊誘導邊轉化的“雙邊工藝”方式進行。參照1.3.2節條件分別對E. coliBL21/pET28a和攜帶不同GAD編碼基因的重組E. coli進行前期的種子培養，加入1 mol/L IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L后，緊接著添加L-谷氨酸至終質量濃度為6 g/L，添加磷酸吡哆醛的母液至終濃度為0.5 mmol/L，先在16 ℃、200 r/min條件下培養24 h，然后在30 ℃、200 r/min條件下培養24 h，期間每4 h取樣檢測GABA生成量。

1.3.8 GABA的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

GABA的精確定量采用柱前PITC衍生HPLC進行[34]，稱取GABA標準品溶解于超純水中，取不同體積的標準品溶液加入到10 mL的離心管中，制成不同濃度梯度的GABA標準液，然后分別加入500 μL 0.1 mol/L PITC-乙腈、500 μL 1 mol/L三乙胺-乙腈，充分混勻后室溫放置反應1 h，反應結束后加入3 mL 50%乙腈溶液，混合均勻，再加入5 mL正己烷，混合均勻后靜置10 min，取下層溶液，用0.22 μm濾膜過濾，取20 μL濾液進行HPLC分析，獲得各濃度GABA峰面積后，進行線性擬合獲得回歸方程及相關系數。HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱，檢測波長254 nm，柱溫25 ℃，流動相為體積分數10%的甲醇溶液，流速1 mL/min。采用同樣的方法對轉化產物和L-谷氨酸分別進行衍生化和HPLC分析，根據產物的保留時間進行定性分析，同時根據測得產物峰面積，由獲得的回歸方程進行定量分析。

1.3.9 常用網站及軟件

NCBI（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/）數據庫和Basic Local Alignment Search Tool（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）：用于蛋白質、基因序列及蛋白質3-D結構的搜索；Optimizer（http://genomes.urv.cat/OPTIMIZER/）：用于密碼子的優化；ClustalX2：用于蛋白質的多序列比對；MEGA6.0：用于進化樹的構建；DNAMAN：用于基因序列及限制性酶切位點分析。

1.4 數據統計及圖表繪制

圖片均用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進行色階、對比度調節及標注等處理。簡單的數據處理及分析均借助Origin 9.0進行。

2 結果與分析

2.1 GAD的基因挖掘

圖1 探針及潛在的GAD進化樹Fig.1 Phylogenetic tree for the probe and putative glutamate decarboxylases

如圖1所示，以在進化樹上的距離為依據選取了4 個有代表性的序列，包括L. lactisCICC20209、E. sulfureus、L. senmaizukei和L. brevisATCC 367來源的4 個潛在的GAD，并將其分別命名為LlGAD、EsGAD、LsGAD和LbGAD。其中，LsGAD與已報道的GAD相似度最高為82.01%（序列號為BAN05709.1）[31]，而EsGAD與報道的GAD相似度最高為70.18%（序列號為KRN72673）[37]，相似度表明這2 個酶在基因序列上均具有一定的新穎性。對選定的4 個基因進行了密碼子優化，然后對目標基因和pET28a多克隆位點的酶切位點進行分析，在目標基因上下游分別加上BamH I和XhoI酶切位點后，委托蘇州泓迅生物科技有限公司進行全基因合成，并克隆至pET28a上，構建出一系列攜帶潛在GAD編碼基因的重組E. coli，分別命名為E. coliBL21/pET28a-LsGAD、E. coliBL21/pET28a-LlGAD、E. coliBL21/pET28a-EsGAD和E. coliBL21/pET28a-LbGAD。

2.2 重組E. coli的誘導表達及純化

分別將E. coliBL21/pET28a、E. coliBL21/pET28a-LsGAD、E. coliBL21/pET28a-LlGAD、E. coliBL21/pET28a-EsGAD和E. coliBL21/pET28a-LbGAD按照1.3.2節方法進行誘導表達。將100 mL發酵液中的菌體離心收集，然后超聲破碎，高速離心20 min后收集裂解上清液，將上清液過0.45 μm濾膜后用一站式His標記蛋白質微量純化套裝進行純化，并用10 kDa截留分子質量的超濾離心管進行咪唑去除和產物濃縮，最終分別將各重組蛋白定容至1.5 mL。將裂解上清液和純化后產物分別進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示，E. coliBL21/pET28a-EsGAD、E. coliBL21/pET28a-LbGAD、E. coliBL21/pET28a-LsGAD和E. coliBL21/pET28a-LlGAD的裂解上清液在約53 kDa處有明顯的特異性條帶，與理論分子質量一致，表明這4 個潛在的GAD均成功實現了在E. coli中的可溶性表達，其中E. coliBL21/pET28a-EsGAD的蛋白可溶性表達水平最差。純化產物均在約53 kDa處出現了單一條帶，表明經過親和層析獲得了電泳純的4 個重組酶，可以用于后續酶學特性的分析。

圖2 代表性重組GAD的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of representative recombinant glutamate decarboxylases

酶活力測定結果顯示，E. coliBL21/pET28a-EsGAD、E. coliBL21/pET28a-LbGAD、E. coliBL21/pET28a-LsGAD和E. coliBL21/pET28a-LlGAD發酵液中GAD活力分別為8.38、28.97、34.17 U/mL和38.91 U/mL，LsGAD和LlGAD在E. coli中的表達水平明顯高于探針LbGAD的表達水平，這表明在催化L-谷氨酸生成GABA的反應中前兩者可能會有更高的效率。經純化后，reEsGAD、reLbGAD、reLsGAD和reLlGAD對L-谷氨酸的比活力分別為114.35、108.63、139.60 U/mg和46.62 U/mg，其中reLsGAD比活力最高，約為探針（reLbGAD）的1.4 倍。

2.3 重組GAD的溫度特性

由圖3A可知，LsGAD的最適反應溫度最低，僅為40 ℃，它更接近于菌體的最適生長溫度。結果表明在生理條件下，LsGAD較其他GAD可能會更具催化潛力。如圖3B所示，4 個重組GAD的熱穩定性均欠佳，游離酶在40 ℃保溫1 h后殘留酶活力均只有50%左右，這會限制它在GABA生物合成中的應用，在今后研究中有必要通過固定化、定向進化或理性設計等手段對其熱穩定性進行改造，以滿足工業化生產的需求[38-39]。在本研究中，將采取全細胞催化的方法進行GABA的生物合成，以提高GAD在反應條件下的穩定性。

圖3 重組GAD的最適溫度（A）和熱穩定性（B）Fig.3 Optimal temperature (A) and temperature stability (B) of recombinant glutamate decarboxylases

2.4 重組GAD的pH值特性

圖4 重組GAD的最適pH值（A）和pH值穩定性（B）Fig.4 Optimal pH (A) and pH stability (B) of recombinant glutamate decarboxylases

由圖4A可知，4 個重組GAD均為嗜酸性酶，它們的最適pH值在4.0～5.5之間，其中LsGAD的pH值適應性最廣，在4.5～6.0之間均能保持80%以上的相對酶活力，具有更大的應用潛力。由圖4B可知，4 個重組GAD對pH值較為敏感，當稍微偏離其最適pH值時，其穩定性明顯下降，因此在使用過程中一定要嚴格控制反應體系的pH值。

2.5 重組GAD的動力學參數分析

表1 重組GAD對L-谷氨酸的動力學參數Table 1 Kinetic parameters for the activity of recombinant glutamate decarboxylases toward L-glutamic acid

表1結果顯示，與探針及其他2 個重組GAD相比，LsGAD對L-谷氨酸的Km值最低，僅為3.37 mmol/L，表明它對L-谷氨酸具有更高的親和力。而LsGAD的Kcat/Km值為10.27 L/（mmol·s），也明顯高于探針及其他2 個重組谷氨酸脫氫酶，這表明LsGAD較其他幾個GAD可能會具有更高催化效率。

2.6 GABA的生物合成

采用1.3.7節邊誘導邊轉化的“雙邊工藝”對L-谷氨酸進行全細胞催化的生物轉化，將反應產物按1.3.8節方法進行HPLC檢測，在保留時間為2.94 min和2.23 min處均有明顯的特征峰，表明已有部分L-谷氨酸（2.23 min）轉化為GABA（2.94 min）。6 g/L的L-谷氨酸在上述轉化工藝下的反應進程曲線如圖5所示，在前20 h的誘導時間段，4 個攜帶GAD基因的工程菌均能產生一定的GABA，其得率約為10%，再經過24 h的誘導后，GABA得率最高可達58%，最低約為40%，離理論得率仍有一定的差距，在后續研究中仍需對轉化條件進行系統的優化。但相比傳統的先誘導后轉化的分步工藝，該雙邊工藝節約了一定的轉化時間，提高了GABA的時空生產效率[15]。

圖5 不同E. coli工程菌催化下的GABA反應進程曲線Fig.5 Time course curves of GABA production catalyzed by engineered E. coli cells

3 討 論

隨著高通量測序技術的不斷發展，基因組數據在不斷豐富，迄今為止已有222 395 個原核生物的基因組序列被先后報道，且仍在呈遞增趨勢。海量基因組序列中包含了大量假定酶基因，為新酶的發掘提供了豐富資源[26]。采用基因組挖掘技術，可以快速地將假定酶變為真實酶，為生物催化提供更多的選擇[27]。

本研究采用基因組挖掘技術，以LbGAD的蛋白序列為探針，從乳酸菌屬和腸球菌屬的基因組中挖掘到了3 個假定的GAD（LsGAD、EsGAD和LlGAD），其中LsGAD與已報道的序列相似度最高為82.01%[31]，而EsGAD與已報道的序列相似度最高為70.18%[37]，均具有較高的新穎性。借助pET28a質粒將4 個基因實現了在E. coliBL21中的可溶性表達，E. coliBL21/pET28a-EsGAD、E. coliBL21/pET28a-LbGAD、E. coliBL21/pET28a-LsGAD和E. coliBL21/pET28a-LlGAD發酵液中GAD活力分別為8.38、28.97、34.17 U/mL和38.91 U/mL，LsGAD和LlGAD在E. coli中的表達水平明顯高于探針LbGAD的表達水平，表明其全細胞催化L-谷氨酸合成GABA的應用中可能更具優勢。此外，reLsGAD對L-谷氨酸的酶活力最高，可達139.60 U/mg，約為探針（reLbGAD）的1.4 倍。而reLlGAD對L-谷氨酸的酶活力最低，僅為46.62 U/mg，但是其可溶性的蛋白表達含量很高（圖3），所以體現出的酶活力表達水平仍然最高。

溫度特性結果顯示，LsGAD的最適反應溫度最低，僅為40 ℃，更接近于菌體的最適生長溫度，表明在生理條件下，LsGAD較其他GAD可能會更具催化潛力。pH值特性結果表明，4 個重組GAD均為嗜酸性酶，它們的最適pH值在4.0～5.5之間，其中LsGAD的pH值適應性最廣，在4.5～6.0之間均能保持80%以上的相對酶活力，可能會具有更大的應用潛力。此外，動力學參數結果顯示，LsGAD的Kcat/Km值為10.27 L/（mmol·s），也明顯高于探針及其他2 個重組GAD。從這些酶學特性的參數比較分析看，均體現出LsGAD的優越性，下一步選擇其做進一步研究，包括采用共表達質粒提高基因的拷貝數及在食品級乳酸菌表達系統中進行表達等。

最后，采用邊誘導邊轉化的“雙邊工藝”對L-谷氨酸進行全細胞催化的生物轉化，6 g/L的L-谷氨酸經過24 h轉化后，GABA得率最高可達58%。相比傳統的先誘導后轉化分步工藝，該雙邊工藝節約了一定的轉化時間，提高了GABA的時空生產效率[15]?？傊狙芯繉崿F了GAD從基因組數據到真實酶的跨越，獲得了數個性能優良的GAD，初步實現了GABA的生物合成，為實現GABA低成本、規?；纳锖铣商峁┮欢ǖ膮⒖肌?/p>