利用牡蠣制備DPP-IV抑制肽及其活性分析

陳 宏，章 騫,2，陳玉磊,2，翁 凌,2，張凌晶,2，謝少浩，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

牡蠣，又稱生蠔、蠣黃、海蠣子等，是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類(lèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)牡蠣產(chǎn)量達(dá)514萬(wàn) t，占貝類(lèi)總產(chǎn)量的35.6%，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。牡蠣肉營(yíng)養(yǎng)豐富，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、糖原、牛磺酸以及多種微量元素[2]。研究表明，利用牡蠣肉提取生物活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤和降血壓等活性功能[3-5]。福建牡蠣年產(chǎn)量達(dá)190萬(wàn) t，但目前牡蠣主要以鮮食和傳統(tǒng)粗加工為主[6-8]，因此，利用現(xiàn)代食品生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)牡蠣的精深加工和高值化利用，有助于牡蠣資源的高值化開(kāi)發(fā)利用。

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素激素（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）能夠促進(jìn)機(jī)體的胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，在人體血糖平衡調(diào)節(jié)中具有重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）可將GLP-1和GIP氨基末端的兩個(gè)氨基酸切除，使其失去生理功能，影響血糖調(diào)節(jié)[10]。因此，抑制DPP-IV活性有利于控制血糖水平。目前，以DPP-IV為治療靶點(diǎn)，已開(kāi)發(fā)出如西格列汀、維達(dá)列汀和沙格列汀等多種合成藥物，它們對(duì)II型糖尿病具有良好的治療效果，但這些藥物往往伴隨著一定的副作用[11]。據(jù)報(bào)道，食源性的DPP-IV抑制肽具有易吸收、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在II型糖尿病的預(yù)防方面?zhèn)涫荜P(guān)注[12]。目前，已有許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同來(lái)源的蛋白質(zhì)中獲得DPP-IV抑制肽[13]。牡蠣富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是制備功能活性肽的理想原料，此外，牡蠣還含有豐富的鋅元素[2]，而鋅元素具有調(diào)節(jié)胰島素合成、分泌和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等作用[14]。因此，利用牡蠣制備降血糖功能性食品更具有優(yōu)勢(shì)。

本研究以長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）為原料，以DPP-IV抑制率為指標(biāo)，利用商品酶酶解牡蠣肉制備酶解液，分析其對(duì)DPP-IV的抑制效果。進(jìn)一步對(duì)活性組分進(jìn)行分離純化和肽氨基酸組成鑒定，并對(duì)其進(jìn)行合成驗(yàn)證，以期為牡蠣的功能性食品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮長(zhǎng)牡蠣購(gòu)于廈門(mén)市夏商國(guó)際水產(chǎn)交易中心。

商品酶（木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、胰酶（4 000 U/g）、中性蛋白酶（400 000 U/g）） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g） 諾維信生物技術(shù)有限公司；DPP-IV 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Sephadex G-15凝膠柱美國(guó)GE Healthcare公司；熒光底物甘氨酰-脯氨酸-MCA（Gly-Pro-MCA） 日本Peptide Institute公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；合成肽HDGKGLFYNSYPD QEGKSDGTETSTNLHQKLYYHVLGTPQSEDVLCAE FP、APSTM和ILAPPER 合肥塞曼諾生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；5417R小型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Infinite?M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；GF-1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國(guó)Agilent公司；Triple TOF 6600質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解條件優(yōu)化

1.3.1.1 商品酶的篩選

牡蠣肉與20 mmol/L緩沖液按料液比1∶2（g/mL）搗碎，選取5 種商品酶（木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶）在各自最適的pH值（相應(yīng)的緩沖液）和溫度下，加酶量為牡蠣肉質(zhì)量的0.5%，酶解時(shí)間為150 min，制備得到酶解液，分別測(cè)定酶解液對(duì)DPP-IV的抑制活性，篩選最適的商品酶[15]。

1.3.1.2 加酶量的確定

選取對(duì)DPP-IV抑制效果最好的蛋白酶，在其最適反應(yīng)溫度和pH值條件下優(yōu)化加酶量。在加酶量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%條件下酶解牡蠣肉，測(cè)定酶解液對(duì)DPP-IV的抑制活性。

1.3.1.3 酶解時(shí)間的確定

在最適反應(yīng)溫度和pH值條件下優(yōu)化牡蠣肉酶解時(shí)間。在酶解時(shí)間分別為30、60、90、120 min和150 min時(shí)，測(cè)定酶解液對(duì)DPP-IV的抑制活性。

1.3.2 DPP-IV抑制活性測(cè)定

參照Sato等[16]的方法并略作修改，依次將pH 8.0、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（50 μL）、DPP-IV（10 μL）、抑制劑（10 μL）加入到黑色酶標(biāo)板混勻，在37 ℃孵育5 min，加入10 μmol/L熒光底物Gly-Pro-MCA溶液（30 μL）啟動(dòng)反應(yīng)，繼續(xù)在37 ℃條件下孵育30 min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm）。DPP-IV抑制率計(jì)算如下式所示：

式中：F對(duì)照為對(duì)照組的熒光強(qiáng)度；F樣品為實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度。

1.3.3 分子質(zhì)量分布測(cè)定

參考Wu Qiang等[17]的方法。色譜條件：GF-1260 Agilent HPLC純化系統(tǒng)；色譜柱為T(mén)SK G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量10 μL；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃。用標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值和保留時(shí)間繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程。不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)溶液：魚(yú)小清蛋白II，11 950 Da；50肽，5 617.97 Da；桿菌肽，1 422.69 Da；Gly-Gly-Arg-Tyr，451.48 Da；Tyr，181.19 Da。

1.3.4 超濾

稱取牡蠣肉，按牡蠣肉-緩沖液（pH 8.0）1∶2（g/mL）搗碎均勻，根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化的酶解條件為：胰酶加酶量0.8%、pH 8.0、溫度37 ℃、酶解90 min，結(jié)束后用100 ℃沸水浴中滅酶10 min，10 000×g離心10 min，取上清液。將上清液用3 kDa超濾膜超濾，分別收集內(nèi)、外液，冷凍干燥，測(cè)定其對(duì)DPP-IV的抑制活性。

1.3.5 Sephadex G-15分離

將冷凍干燥的組分用超純水復(fù)溶，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后。將濾出液上樣于超純水平衡好的Sephadex G-15凝膠柱（1.5 cm×100 cm），測(cè)定各組分中多肽的濃度以及各組分對(duì)DPP-IV的IC50值，重復(fù)多次收集IC50值低的組分，冷凍干燥備用。

1.3.6 反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離

將Sephadex G-15凝膠柱分離得到的IC50最低組分進(jìn)一步用RP-HPLC分離。純化條件：GF-1260 Agilent HPLC純化系統(tǒng)；色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A：含0.1%三氟乙酸的超純水，流動(dòng)相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈，洗脫條件：0～2 min，100% A，0% B；2～15 min，100%～75% A，0%～25% B；15～25 min，75%～50% A，25%～50% B；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣體積20 μL；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃。按出峰時(shí)間重復(fù)多次收集各組分，測(cè)定各組分對(duì)DPP-IV抑制活性，選取對(duì)DPP-IV抑制活性高的組分用質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列。

1.3.7 質(zhì)譜鑒定

參照Z(yǔ)hang Jing等[18]的方法。將純化得到的多肽組分重新溶解于Nano-LC流動(dòng)相A（0.1%甲酸，2%乙腈）中，進(jìn)行在線液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。樣品先經(jīng)過(guò)脫鹽保留后再經(jīng)分析柱（C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 ?）Chrom XP Eksigent）分離，洗脫梯度：0～30 min，8%～38%流動(dòng)相B（0.1%甲酸，95%乙腈）。

1.3.8 DPP-IV抑制肽的合成

純度為95%以上的兩種肽段Ala-Pro-Ser-Thr-Met（APSTM）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER）委托合肥塞曼諾生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.3.9 合成肽的DPP-IV抑制活性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證合成肽對(duì)DPP-IV的抑制活性，取不同濃度的合成肽，參照1.3.2節(jié)方法，以抑制肽濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，DPP-IV抑制率為縱坐標(biāo)，經(jīng)回歸分析，計(jì)算得出合成肽對(duì)DPP-IV的半抑制濃度（IC50）[19]。

1.3.10 分子對(duì)接

DPP-IV（1WCY）的三維結(jié)構(gòu)從PDB（Protein Data Bank）獲取，抑制肽結(jié)構(gòu)式利用ChemDraw 17.0軟件構(gòu)建，并優(yōu)化其結(jié)構(gòu)。利用AutoDock 4.2.6，將兩個(gè)肽段分別與DPP-IV進(jìn)行對(duì)接，并利用Discovery Studio 4.5分析對(duì)接結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 商品酶的篩選

將牡蠣肉分別用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶最適pH值對(duì)應(yīng)的20 mmol/L緩沖液進(jìn)行酶解，制備酶解液。5 種蛋白酶酶解條件及其產(chǎn)物的DPP-IV抑制率如表1所示。由表1可知，胰酶酶解制備的酶解液對(duì)DPP-IV的抑制率最高，達(dá)到73%，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶制備的酶解液對(duì)DPP-IV的抑制率相當(dāng)（63%～64%），木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物抑制效果最差（47%）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用胰酶作為工具酶開(kāi)展研究。

表15 種蛋白酶酶解條件及酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率Table 1 Conditions for enzymatic hydrolysis of oyster with five proteases and DPP-IV inhibitory rates of the resulting hydrolysates

2.2 酶解液分子質(zhì)量分布

在pH 8.0、溫度37 ℃條件下，優(yōu)化胰酶的加酶量和酶解時(shí)間進(jìn)行牡蠣酶解液的制備，測(cè)定不同加酶量和酶解時(shí)間下酶解液的分子質(zhì)量分布。由圖1A可知，在酶解150 min的條件下，隨著胰酶加酶量增加，分子質(zhì)量＞500 Da的各個(gè)組分所占比例微弱減少，分子質(zhì)量＜500 Da的組分所占比例相應(yīng)增加。可能是由于酶解時(shí)間較長(zhǎng)，分子質(zhì)量分布比例變化不明顯。由圖1B可知，在加酶量為0.8%的條件下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，大量蛋白質(zhì)底物逐漸被胰酶降解，分子質(zhì)量＞500 Da的組分占比從酶解30 min的34%下降到酶解150 min的15%，相應(yīng)地，分子質(zhì)量＜500 Da的組分增加到85%。相比于Le Maux等[20]利用豬彈性蛋白酶酶解β-乳球蛋白獲得不同水解度的酶解產(chǎn)物，分子質(zhì)量＜1 kDa的組分占比在70%以下，本研究制備的酶解液小分子質(zhì)量組分占比更高。

圖1 加酶量和酶解時(shí)間對(duì)酶解液分子質(zhì)量分布的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage and hydrolysis duration on the molecular mass distribution of hydrolysates

2.3 胰酶酶解條件優(yōu)化

進(jìn)一步探究不同加酶量和酶解時(shí)間制備的酶解液對(duì)DPP-IV抑制活性的影響，對(duì)胰酶酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。由圖2A可知，隨著加酶量增加，DPP-IV抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，這可能是由于酶過(guò)量時(shí)，一部分DPP-IV抑制肽被降解為更短的肽段或者氨基酸而降低或失去抑制活性[5,21]。選擇加酶量為0.8%進(jìn)一步優(yōu)化酶解時(shí)間。由圖2B可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，DPP-IV抑制率先上升后逐漸趨于平穩(wěn)，推測(cè)是在酶解前期，牡蠣蛋白被胰酶降解，產(chǎn)生較多的DPP-IV抑制肽，盡管在90 min后仍有分子質(zhì)量低于500 Da的小肽產(chǎn)生（圖1B），由于底物中高分子質(zhì)量組分的減少，反應(yīng)趨于平緩。綜上，最終確定胰酶酶解條件為加酶量0.8%、酶解時(shí)間90 min。

圖 2加酶量和酶解時(shí)間對(duì)DPP-IV抑制率的影響Fig.2 Effects of enzyme dosage and hydrolysis duration on DPP-IV inhibitory rates of hydrolysates

2.4 超濾

牡蠣蛋白酶解液經(jīng)3 kDa超濾膜超濾，得到分子質(zhì)量＜3 kDa和＞3 kDa的兩個(gè)組分，分別測(cè)定兩個(gè)組分的IC50，由圖3可知，＜3 kDa組分的IC50值為1.41 mg/mL，顯著低于＞3 kDa組分的IC50值（56.89 mg/mL），兩者相差40.3 倍。主要原因是＞3 kDa組分是未被充分酶解的大分子多肽，不能進(jìn)入到DPP-IV活性部位，因此，選擇＜3 kDa組分進(jìn)行下一步分離純化。

圖3 超濾組分對(duì)DPP-IV的IC50Fig.3 IC50 of ultrafiltration fractions

2.5 Sephadex G-15分離

分子質(zhì)量＜3 kDa組分經(jīng)Sephadex G-15凝膠層析分離得到4 個(gè)組分，如圖4A所示，分別為F1、F2、F3和F4。將其分別凍干后，測(cè)定各組分的IC50值，結(jié)果如圖4B所示，F(xiàn)2和F3組分的IC50值相當(dāng)，分別為0.31 mg/mL和0.28 mg/mL，而F1和F4組分的IC50值均大于6 mg/mL。其中，F(xiàn)1組分可能是分子質(zhì)量較大的多肽，F(xiàn)4組分主要以氨基酸為主，因而其IC50值較高。綜上，選擇F3組分進(jìn)一步分離純化。

圖4 Sephadex G-15凝膠柱層析圖譜（A）及各組分對(duì)DPP-IV的IC50值（B）Fig.4 Sephadex G-15 gel chromatogram (A) and IC50 of all separated fractions (B)

2.6 RP-HPLC分離

F3組分繼續(xù)利用RP-HPLC分離，結(jié)果如圖5A所示。按分離度選取5 個(gè)組分F3-1、F3-2、F3-3、F3-4和F3-5，分別重復(fù)收集凍干，經(jīng)復(fù)溶后配制成0.5 mg/mL的溶液，測(cè)定其對(duì)DPP-IV的抑制活性。由圖5B可知，F(xiàn)3-4組分對(duì)DPP-IV的抑制率為34%，顯著高于其他組分。收集F3-4組分用質(zhì)譜鑒定其肽段序列。

圖5 RP-HPLC分離圖譜（A）及各組分對(duì)DPP-IV的抑制率（B）Fig.5 RP-HPLC chromatogram of fraction F3 (A) and DPP-IV inhibitory rates of its sub-fractions (B)

2.7 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

F3-4組分經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定分析，共得到10 個(gè)來(lái)源于牡蠣蛋白的肽段，包含6～12 個(gè)長(zhǎng)度不等的氨基酸殘基，從中篩選得到2 種多肽，如圖6所示，氨基酸序列分別為Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys（EITALAPSTMK，分子質(zhì)量1 161.36 Da）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER，分子質(zhì)量794.94 Da）作進(jìn)一步研究。

圖6 EITALAPSTMK（A）和ILAPPER（B）的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectra of EITALAPSTMK (A) and ILAPPER (B)

2.8 DPP-IV抑制肽抑制活性驗(yàn)證

圖7 合成肽APSTM和ILAPPER對(duì)DPP-IV的IC50值Fig.7 IC50 of synthetic DPP-IV inhibitory peptides APSTM and ILAPPER

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到2 個(gè)具有潛在DPP-IV抑制活性的肽段EITALAPSTMK和ILAPPER。肽段EITALAPSTMK序列較長(zhǎng)，通過(guò)BIOPEP[22]在線預(yù)測(cè)模擬胃腸液消化后得到肽段APSTM。合成肽APSTM和ILAPPER，分子質(zhì)量分別為505.59 Da和794.94 Da。進(jìn)一步測(cè)定合成肽對(duì)DPP-IV的抑制活性，如圖7所示，2 種合成肽APSTM和ILAPPER的IC50值分別為354.81 μmol/L和16.98 μmol/L，其中，七肽ILAPPER的IC50值（16.98 μmol/L）接近于陽(yáng)性對(duì)照抑制肽Ile-Pro-Ile（Diprotin A）的IC50值（12.45 μmol/L）。APSTM的IC50值高于ILAPPER，可能是由于其N(xiāo)-端第2個(gè)氨基酸為Pro的肽段容易被DPP-IV降解有關(guān)[23]。此外，APSTM的IC50高于Liu Rui等[24]報(bào)道的肽段LAPSTM（140.82 μmol/L），可能是由于LAPSTM的N-末端的疏水性氨基酸殘基（Leu、Ala和Pro）較多，增強(qiáng)了與DPP-IV活性部位結(jié)合的特異性[25]。

2.9 分子對(duì)接

圖8 APSTM和ILAPPER與DPP-IV的分子對(duì)接Fig.8 Molecular docking of APSTM and ILAPPER with DPP-IV

分子對(duì)接廣泛應(yīng)用于研究配體與受體之間的相互作用，繼而揭示它們的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式[26]。DPP-IV的催化三連體為Ser630、Asp708和His740[27]，活性部位包含疏水口袋S1（Tyr631、Val656、Trp659、Tyr662、Tyr666和Val711）和電荷口袋S2（Arg125、Glu205、Glu206、Phe357、Ser209和Arg358）組成[28]。如圖8所示，APSTM中Ala的氨基有兩個(gè)氫原子與DPP-IV的S1口袋Tyr662和S2口袋Glu205、Glu206形成3 個(gè)氫鍵，且Tyr662與Pro的吡咯環(huán)形成氫鍵，與Ser630、Tyr666等氨基酸殘基形成的范德華力主要集中在APSTM的N-末端，與Trp629、His740形成π鍵。ILAPPER和DPP-IV的氫鍵作用力體現(xiàn)在：催化中心Ser630、His740與Arg的羧基，S2口袋的Glu205、Glu206與Ile的氨基氫原子，Arg125與Glu的羧基，以及Tyr547與Arg的羧基形成氫鍵，與活性位點(diǎn)的Tyr631、Ser209所形成的范德華力集中在ILAPPER的N-末端，與Arg125、His126、Phe357、Trp629和Tyr666形成π鍵。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DPP-IV抑制肽主要與其催化中心、S1和S2口袋等關(guān)鍵氨基酸形成相互作用力[29-31]。結(jié)合兩個(gè)肽段對(duì)DPP-IV的抑制活性，盡管它們均與DPP-IV的關(guān)鍵氨基酸Arg125、Glu205、Glu206形成氫鍵，以及范德華力均集中在N-末端，但I(xiàn)LAPPER與DPP-IV的催化中心Ser630形成作用力更強(qiáng)的氫鍵，且形成更多的π鍵。因此，ILAPPER對(duì)DPP-IV具有更好的抑制效果。

3 結(jié) 論

牡蠣含有豐富的蛋白質(zhì)，利用胰酶酶解可制備對(duì)DPP-IV具有抑制作用的產(chǎn)物。優(yōu)化酶解條件為胰酶加酶量0.8%、pH 8.0、溫度37 ℃、酶解時(shí)間90 min。酶解液經(jīng)超濾、Sephadex G-15和RP-HPLC分離純化得到最終組分F3-4，質(zhì)譜鑒定出2 種多肽的氨基酸序列EITALAPSTMK和ILAPPER，在線模擬胃腸液消化后，合成了APSTM和ILAPPER兩個(gè)肽段。結(jié)果顯示，兩個(gè)肽段對(duì)DPP-IV的IC50值分別為354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。通過(guò)分子對(duì)接模擬，2 個(gè)抑制肽主要與DPP-IV活性部位以氫鍵、范德華力和π鍵相互作用，而ILAPPER與DPP-IV的催化中心Ser630形成作用力更強(qiáng)的氫鍵并且形成更多的π鍵，因此ILAPPER的抑制效果較好。本研究分離純化的牡蠣肽具有DPP-IV抑制活性，為牡蠣肉的精深加工和高值化利用提供了理論依據(jù)。