高產α-半乳糖苷酶乳酸菌發酵對鷹嘴豆酸面團生化特性及其面包烘焙品質的影響

武 盟，曹偉超，程 新，馬子琳，羅 昆，徐 巖，黃衛寧,*，李 寧，高鐵成

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學生物工程學院，釀造微生物與應用酶學研究室，教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400）

面包等烘焙食品是世界主流食品，使用鷹嘴豆粉替代小麥粉可以提高面包蛋白質含量，補充小麥等谷物缺少的賴氨酸[1]。但鷹嘴豆含有大量的棉子糖、水蘇糖，Gangola等[2]報道2 種糖總量質量分數約為1.85%～2.78%（以干物質計），這些抗營養因子會降低營養物質在人體內的消化吸收[3]，引起脹氣、腹瀉等癥狀。此外，鷹嘴豆面包較差的質構和風味特性也嚴重限制其消費者可接受性[3]。酸面團是公認安全的生物發酵技術，在發酵過程中積累的有機酸、氨基酸可以賦予產品特殊風味[4]。眾多國內外學者選擇使用酸面團發酵技術降低棉子糖、水蘇糖含量和改善面包烘焙和風味品質。Martínez-anaya[5]將酸面團技術應用在面包中，提升了面包風味；Galli等[3]使用植物乳桿菌預發酵鷹嘴豆粉，減少豆粉中63.22%的棉子糖和水蘇糖；蘇曉琴[6]使用布氏乳桿菌發酵綠豆酸面團，制作的面包比容及質構得到顯著提升，但其菌株缺少α-半乳糖苷酶活性，未能將豆粉中的棉子糖、水蘇糖去除。α-半乳糖苷酶可切割棉子糖和水蘇糖的α-1,6糖苷鍵，將其水解為半乳糖和蔗糖。因此使用高產α-半乳糖苷酶乳酸菌發酵鷹嘴豆酸面團可能是減少鷹嘴豆粉棉子糖含量、改善面包風味及質構特性的有效手段。

本研究利用高產α-半乳糖苷酶乳酸菌發酵鷹嘴豆粉，探究其對鷹嘴豆酸面團生化特性及鷹嘴豆面包烘焙特性的影響，為改善鷹嘴豆面包品質的相關研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉子糖、水蘇糖標準品（色譜純） 美國Fluka公司；乳酸、乙酸標準品（色譜純） 美國Sigma公司；面包粉 中糧面業（秦皇島）鵬泰面粉有限公司；發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）C2-8篩選自茅臺酒曲；干酵母 安琪酵母股份有限公司；黃油 中糧食品營銷有限公司；白砂糖、食鹽 市售；鷹嘴豆粉新疆天山奇豆生物科技有限責任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SPC-40SP型醒發箱、SM-523型烤箱 新麥機械（無錫）有限公司；1100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫公司；CT 3型質構儀 美國Brookfield公司；80 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；TSQ Quantum XLS三重四極桿氣相色譜-質譜聯用儀美國賽默飛世爾科技公司；Smart Tongue電子舌系統美國Isenso公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆酸面團（chickpea sourdough，CSD）的制作

參考楊文丹等[7]的方法制備酸面團。發酵乳桿菌C2-8在MRS培養基中培養至指數生長期后期（18 h），取10 mL發酵菌液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，無菌生理鹽水洗滌2 次，獲得菌泥。取50 g鷹嘴豆粉和50 g滅菌蒸餾水，加入獲得的菌泥，制備CSD，在37 ℃培養24 h。

1.3.2 酸面團有機酸含量的測定

根據王益姝[8]的方法測定酸面團有機酸含量。在0～24 h內每4 h稱取10.0 g酸面團樣品，加入20.0 mL超純水，高速攪拌5 min，之后在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液過水相0.22 μm膜后，通過HPLC測定樣品中的乳酸和乙酸含量。流動相：0.01 mol/L磷酸氫二銨（pH 2.8）緩沖液-甲醇（97∶3，V/V）；柱溫25 ℃；流速0.7 mL/min；紫外檢測器波長：215 nm；進樣量：20.0 μL。每個樣品重復3 次，取平均值。

1.3.3 酸面團棉子糖及水蘇糖含量的測定

樣品制備：精確稱取10.00 g發酵0、8、16、24 h酸面團樣品，使用石油醚回流除去脂肪，以料液比1∶10（V/V）加入80%乙醇溶液，80 ℃回流1 h，抽濾后收集濾液。濾渣中加入100 mL水并攪拌1 h，之后抽濾。2 次濾液合并，使用質量分數10%醋酸鉛溶液沉淀蛋白，之后于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，重復2 次至蛋白除盡，再用草酸除去沉淀蛋白留下的鉛。之后真空濃縮到100 mL，進行HPLC分析[9]。每個樣品重復操作3 次，取平均值。

色譜條件：色譜柱為Bridge BEH Amide柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（70∶30，V/V）；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20.0 μL；示差折光檢測器，檢測池溫度35 ℃[9]。

1.3.4 酸面團還原糖含量的測定

根據張可欣[10]的方法測定還原糖含量。稱取2.5 g發酵第0、8、16、24小時酸面團樣品，加入0.1 mol/L NaOH溶液5 mL使淀粉酶失活，之后加入17.5 mL蒸餾水，45 ℃振蕩水浴1 h，冷卻后定容至50 mL，靜置沉淀2 h。吸取適量上清液于50 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L乙酸鋅溶液和0.1 mol/L亞鐵氰化鉀溶液各1 mL，以沉淀蛋白質淀粉等大分子，定容后靜置30 min取上清液，上清液即為測定液。取1 mL上清液于10 mL試管中，加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，補水至5 mL，混勻后沸水浴5 min，流水冷卻，最后加水至10 mL混勻，在520 nm波長下測定吸光度。根據吸光度和葡萄糖標準曲線計算還原糖含量。

1.3.5 酸面團游離氨基酸水平的測定

根據劉若詩[11]的方法測定酸面團游離氨基酸。稱取10.00 g面團樣品，加入25 mL質量分數5%的三氯乙酸溶液高速勻漿30 s，在10 000 r/min離心10 min，兩層濾紙過濾，上清液于10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后即為測定液。

HPLC測試條件：醋酸鈉-乙腈-甲醇（1∶2∶2，V/V）；紫外檢測器波長：338、262 nm；色譜柱：ODS Hyoersil柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃。每個樣品重復3 次。

1.3.6 鷹嘴豆酸面團面包（chickpea sourdough bread，CSB）的制作

表1 CB和CSB的配方Table 1 Formulations of chickpea bread and chickpea sourdough bread

實驗組為CSB，對照組為普通鷹嘴豆面包（chickpea bread，CB）。面包的配方見表1。參照楊紫璇等[12]的方法并略作修改。流程：提前溶解糖和鹽，除黃油外將所有原料倒入攪拌缸，慢攪3 min，快攪1 min；加入黃油，之后慢攪2 min，快攪3 min。取出面團滾圓，松弛5 min，分割成90 g，再次松弛10 min后整形，置于面包模具，在醒發箱中醒發100 min，醒發箱參數：溫度38 ℃，相對濕度85%，放入烤箱烘烤20 min，烘烤溫度：上火170 ℃，下火200 ℃。

1.3.7 面包全質構分析

面包室溫冷卻2 h后，用切片機將面包切成10 mm厚度的薄片，將中間的兩片疊加，使用質構儀測定質構。參數：50%形變，觸發點負載5 g，測試速率3.00 mm/s，探頭型號TA36，循環次數2 次[13]。

1.3.8 面包比容測定

面包室溫冷卻2 h后，用油菜籽法[13]測定面包比容。

1.3.9 面包揮發性風味化合物的測定

稱取5.0 g面包樣品置于20 mL樣品瓶，蓋上蓋子，插入已經老化的固相微萃取頭，60 ℃頂空萃取40 min，進行氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用分析[14]。

色譜條件[15]：DB-5MS毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm），載氣為氦氣，以10 mL/min恒流1 min后，在分流比10∶1的模式下分流。升溫程序：40 ℃保溫2 min，以升溫速率6 ℃/min升溫至160 ℃后保溫2 min，之后以升溫速率10 ℃/min升溫至230 ℃后保溫7 min。

質譜條件：電離方式為電子電離，電子能量為70 eV，溫度設定在230 ℃。GC-MS分析圖通過計算機和人工檢索處理，與NIST Library和Wiley Library進行數據匹配。

1.3.10 電子舌對面包的滋味分析

參考何曉赟[16]的電子舌測試方法對面包的滋味進行分析。取100 g面包樣品并粉碎，加入300 mL去離子水，均質10 min之后，在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液通過Smart Tongue電子舌系統進行測試。將100 mL樣品液倒入100 mL燒杯中，數據采集中以清洗液（蒸餾水）和萃取液（樣品上清液）交替進行，為使傳感器響應值趨于平穩，每個樣品采集時間為120 s，每隔1 s 采集一個數據，采集完畢清洗20 s。為減少測量誤差，取最后10 s測量值的平均值作為各傳感器的后續處理數據。

1.3.11 面包感官評定

感官評價：20 位經培訓的人員（男女比例1∶1）組成感官評定小組，采用9 分嗜好法對面包的外觀、顏色、風味、口感、內部結構和整體可接受度進行評定[12]，其中1～9分別表示極度不喜歡、非常不喜歡、正常不喜歡、輕微不喜歡、不喜歡也不討厭、略微喜歡、正常喜歡、非常喜歡和極度喜歡。

1.4 數據分析

所有實驗數據通過Excel 2013、Origin 2018和進行統計分析，使用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酸面團發酵過程中有機酸含量的變化

圖1為CSD發酵過程中有機酸含量的變化。就乳酸含量變化而言，發酵0～12 h乳酸含量緩慢增長，12～16 h乳酸生成速率加快，在發酵至第24小時基本穩定。最終產生62.67 mmol/kg乳酸和15.53 mmol/kg乙酸。酸面團發酵熵（乳酸與乙酸的比值）為4.03，接近最適范圍（1.5～4）[3]。酸面團酸度會影響多種內源性水解酶活力，有機酸的積累會降低酸面團pH值影響豆粉內源性蛋白酶[17]和α-半乳糖苷酶活性[3]，進而影響蛋白和棉子糖的酶解。此外，有機酸積累也對面包風味及質構產生影響[4]。

圖1 發酵過程中CSD有機酸含量變化Fig.1 Changes in organic acid contents during chickpea sourdough fermentation

2.2 酸面團發酵過程中棉子糖、水蘇糖及還原糖含量的變化

由圖2可知，隨著發酵的進行，CSD棉子糖、水蘇糖逐漸被降解，水蘇糖的降解速率一直高于棉子糖，Gote等[18]發現與棉子糖相比，水蘇糖與α-半乳糖苷酶有更高的親和力，C2-8可能會優先水解水蘇糖，Carrera-Silva等[19]也認為水蘇糖誘導酶的能力強于棉子糖；發酵8～16 h，棉子糖水蘇糖含量進一步降低；發酵16 h后，隨著棉子糖濃度的降低，降解速率變慢，而水蘇糖仍以很高的速率降解，發酵24 h左右CSD棉子糖和水蘇糖完全被降解。與國內外學者的研究結果[3,20-23]相比，使用C2-8降解CSD中的棉子糖和水蘇糖，所需的發酵時間更短，降解率更高。這可能是由于C2-8本身具有較高的α-半乳糖苷酶活性，酸面團酸度也會影響酶活性[3]。隨著發酵的進行，CSD有機酸逐漸積累，酸度逐漸降低，接近酶的最適酸度，α-半乳糖苷酶活性提高，此外酸化作用也會促進棉子糖和水蘇糖降解[3]。

如圖2所示，CSD還原糖含量不斷增加，發酵0～16 h期間急劇增長，16～24 h增長變緩，第24小時含量達到11.50%。CSD還原糖含量與棉子糖、水蘇糖含量呈負相關，可能是由于α-半乳糖苷酶可以將棉子糖、水蘇糖等非還原性糖水解為半乳糖和蔗糖[24]，蔗糖進一步水解生成果糖和葡萄糖等還原性糖，從而增加還原性糖含量。葡萄糖等還原性糖的積累不僅有利于乳酸菌生長，還可以在面包面團發酵期間為酵母提供碳源，促進其發酵產氣，從而提高面包比容[25]。

圖2 CSD發酵過程棉子糖、水蘇糖和還原糖含量變化Fig.2 Changes in raffinose, stachyose and reducing sugar contents during chickpea sourdough fermentation

2.3 酸面團發酵前后游離氨基酸含量的變化

圖3 CD和CSD的游離氨基酸含量Fig.3 Free amino acid contents of CD and CSD

面團中的游離氨基酸代表其營養價值水平，同時也是面包揮發性風味化合物的前體物質[4]。圖3為未發酵鷹嘴豆面團（chickpea dough，CD）和發酵24 h CSD的游離氨基酸含量。發酵前CD的總游離氨基酸含量為220.01 mg/100 g，經乳酸菌發酵24 h后，CSD的達到497.51 mg/100 g，是CD的1.26 倍。CSD的必需氨基酸含量為198.00 mg/100 g，是CD含量的4.96 倍，乳酸菌發酵后必需氨基酸占總游離氨基酸比重也明顯提高，從CD的15.09%提高到CSD的39.80%。谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸對于增強鮮味至關重要[26]，經乳酸菌發酵后分別提高了20.50、40.02、26.11、18.05 mg/100 g，亮氨酸和苯丙氨酸可生成異戊醇和苯乙醇[4]。

賴氨酸是堿性必需氨基酸，在谷物中含量很低，且在加工過程中易被破壞，是第1限制性氨基酸[1]，鷹嘴豆粉中含有較多賴氨酸，經C2-8發酵后賴氨酸含量進一步提高，CSD從CD的2.51 mg/100 g提高到21.05 mg/100 g，提高了7.4 倍。乳酸菌發酵可以明顯提高面包的游離氨基酸含量以及必需氨基酸所占比重，一方面是酸面團的酸性環境激活了谷物內源性的蛋白酶，促進蛋白水解[17]；另一方面是乳酸菌本身的肽酶可以將蛋白酶水解后的多肽分解為游離氨基酸和一些風味物質前體[27]。

2.4 面包的比容及質構

圖4 CSB（左）及CB（右）的圖片Fig.4 Pictures of CSB (left) and CB (right)

表2 CB和CSB的比容及質構Table 2 Specific volume and texture properties of CB and CSB

比容和質構是評價面包烘焙品質的重要指標。由圖4可知，乳酸菌C2-8發酵后明顯提高CB的比容，CSB較CB比容提高4.60%。酸面團的酸度會影響面包的比容，若酸度過高，可能會使面包中的面筋蛋白和淀粉等與面包結構相關的物質水解，面包結構弱化，比容降低，適宜的酸度有利于酵母發酵，增加面團面筋膠體的膨潤和吸水，軟化面筋，增大延伸性[27]。乳酸菌發酵產生的代謝產物也可被酵母消耗，例如棉子糖和水蘇糖可被酶解為葡萄糖和果糖，提高酵母發酵產氣能力，增加面包比容[25]。兩種面包的回復性及內聚性無顯著差異（表2）。與CB相比，CSB硬度降低18.49%，咀嚼性降低15.64%。彈性與面包品質呈正相關，硬度、咀嚼性與面包品質呈負相關[28]。全質構數據表明，酸面團發酵技術整體改善了CB的質構特性。

2.5 面包的揮發性風味化合物分析

表3 CB和CSB的揮發性風味化合物Table 3 Volatile flavor compounds identified in CB and CSB

續表3

表4 CB和CSB揮發性風味化合物類別統計Table 4 Statistics of volatile flavor compounds in CB and CSB

由表3、4可知，CB和CSB分別檢測出50、49 種風味物質，主要包括醇類，醛類、酯類、酸類、酮類、烷烴類以及芳香雜環類化合物。烘烤過程中的高溫使酶及微生物失活，美拉德反應及脂肪酸氧化成為風味化合物的主要來源[29]，如2-庚烯醛和2,4-癸二烯醛由脂肪酸氧化生成[30]，糠醛是美拉德反應標志產物，酸性環境下有利于糠醛的生成[31]。

圖5 CB和CSB揮發性風味化合物分布雷達圖Fig.5 Radar chart for the composition of volatile flavor compounds in CB and CSB

圖5 為2 種面包揮發性風味化合物類別分布雷達圖。乳酸菌發酵后，CSB的醇類、酸類、酯類、酮類風味化合物峰面積較CB有明顯提高，分別提高11.78%、298.12%、103.78%、47.81%。CSD總游離氨基酸含量明顯高于CD，證明了乳酸菌發酵可以明顯提高面團總游離氨基酸含量。這可能是由于酸面團發酵積累了有機酸，從而影響面團的酸化程度并改善了蛋白水解作用，生成的肽和氨基酸為面包風味物質的前體，例如苯丙氨酸可通過Ehrlich途徑生成苯乙醇[32]。結合表3分析，兩種面包之間醇類主要差異物質為乙醇、苯乙醇和蘑菇醇，CSB的這3 種醇均高于CB，其中苯乙醇峰面積是CB的2.04 倍。乙醇具有酒香，苯乙醇具有玫瑰香氣，蘑菇醇具有蘑菇、玫瑰、薰衣草和干草香氣，且風味閾值較乙醇和苯乙醇低[4]。酸類主要差異物為乙酸，CSB的乙酸含量是CB的7.21 倍，這是C2-8發酵過程有機酸積累的結果。CSB的3-羥基-2-丁酮峰面積較CB高47.77%。3-羥基-2-丁酮又名乙偶姻，是一種重要的食用香料，可以賦予面包乳香味。雖然酯類物質峰面積較低，但其風味閾值也相對較低，對風味的貢獻不可忽略[33]，CSB的酯類風味化合物峰面積為41.85×107，是CB的2.04 倍，這可能也與棉子糖降解對酵母的發酵促進作用有關，棉子糖和水蘇糖的降解為酵母提供果糖和葡萄糖等風味前體物質[4]。CSB的乳酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丁酰乳酸丁酯、丁位癸內酯峰面積分別較CB顯著增加（P＜0.05）。乳酸乙酯具有果香，CSB高含量的乳酸乙酯可能與其本身發酵生成的乳酸以及酵母發酵產生的乙醇有關；Birch等[34]報道癸酸乙酯具有椰子香型香氣，乙酸乙酯具有水果香味，丁酰乳酸丁酯具有柔和的奶油和烤面包香氣，丁位癸內酯強烈的奶香、堅果香、香甜的水果香氣。此外，乳酸菌發酵也提高了面包癸醛、椰子醛以及吲哚的峰面積，低濃度的癸醛具有果香味，椰子醛具有強烈的椰子香味，低濃度的吲哚也有香味[34]。綜合考慮，乳酸菌發酵明顯提高面包揮發性風味化合物的峰面積，CB的風味得到改善。

2.6 面包的滋味分析

圖6 CB和CSB的滋味分析雷達圖Fig.6 Radar chart for taste analysis of CB and CSB

由圖6可知，CSB酸味明顯高于CB，這與C2-8發酵產生的乙酸有關，適宜的酸味可以改善面包口感，并且掩蓋豆粉的豆腥味[6]。CSB的咸味也高于CB，咸味不僅與面包中鹽的添加量有關，也與乳酸菌發酵密切相關[35]，Zhao等[36]報道羅伊氏乳桿菌發酵積累的部分游離氨基酸，例如谷氨酸，可以提高面包咸味，從而減少面包鹽含量，低鈉食品可以減少患高血壓和心血管疾病的風險[35]。谷氨酸的積累不僅可以增加面包咸味，還能夠提高面包鮮味，此外丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸的積累對于增強鮮味也至關重要，這也可以解釋CSB較CB有更好的鮮味和鮮味回味[26]。CSB較CB甜味明顯提高，谷氨酸是鮮味氨基酸與甘氨酸的甜味有協同效應，而且Lock[37]報道α-半乳糖苷酶可以提高酶解后豆粉的甜味并掩蓋苦味，Lindsay[38]認為大多數苦味物質擁有與甜味分子相同的受體，棉子糖、水蘇糖降解后半乳糖和蔗糖的增加降低了面包的苦味，這可能是通過甜味分子競爭苦味受體而實現的。Heenan等[39]報道某些揮發性風味化合物與面包滋味可能存在正負相關性，CSB較高的乙酸含量會提高面包酸味，酸面團發酵后反式-2-壬烯醛、3-羥基-2-丁酮、糠醛含量的提高可能會提高面包的甜味，苯乙醇可能與甜味負相關，乙酸、乳酸乙酯可能與面包的苦味正相關，CSB較低的辛酸、壬醛、癸醛則有可能獲得消費者對面包新鮮度的積極評價。乳酸菌發酵后明顯提高面包的甜味、酸味、咸味、鮮味和鮮味回味，面包的滋味品質得到整體改善。

2.7 感官評定

感官評定的口感指標與面包質構密切相關，是評估消費者接受度的重要參數。由圖7可見，乳酸菌發酵后，CB比容和質構得到明顯改善，CSB外觀飽滿、質地松軟、不粘牙不掉渣，外觀和口感評分優于CB，并且CSB因更濃的香氣及更好的滋味獲得更高的風味評分，這與風味及滋味分析結果一致。還原糖含量的增加促進了面包的美拉德反應，面包顏色更深，因此除色澤外CSB均獲得較高評分，整體可接受度達到7.2 分。

乳酸菌發酵酸面團過程中，蛋白水解的游離氨基酸是揮發性風味物質的前體化合物，這些氨基酸對面包的咸味、鮮味等滋味也有積極影響。乳酸菌發酵可以改善面包甜味、酸味、咸味、鮮味和鮮味回味等滋味，掩蓋豆粉的豆腥味[6]。C2-8發酵將棉子糖、水蘇糖降解為半乳糖和蔗糖，這些次級代謝產物為酵母發酵提供能量，促進其發酵產氣，增大產品比容并且生成更多香氣物質[25]，發酵還可以減少豆粉中膳食纖維對面筋的破壞[6]，使面包質構更加均勻、松軟，改善面包口感。總體而言，乳酸菌發酵可以明顯改善CB感官特性，提高其消費者可接受度。

圖7 CB和CSB的感官評定圖Fig.7 Sensory evaluation of CB and CSB

3 結 論

發酵24 h后酸面團產生62.67 mmol/kg乳酸和15.53 mmol/kg乙酸，酸面團棉子糖及水蘇糖完全被降解，還原糖達到11.50%，總游離氨基酸含量、必需氨基酸比重及賴氨酸含量較CD顯著提高（P＜0.05）。烘焙品質方面，CSB比CB比容提高4.60%，硬度降低18.49%，咀嚼性降低15.64%。風味特性方面，乳酸菌發酵后明顯提高醇類、酸類、酯類、酮類風味化合物峰面積，其中苯乙醇峰面積提高1.04 倍，咸味、鮮味、酸味等滋味均優于CB，風味特性整體得到改善。除色澤評分外，CSB其他感官評定指標得分均高于CB，整體可接受度達到7.2 分。實驗證明，使用高產α-半乳糖苷酶乳酸菌發酵CSD在增加有機酸、游離氨基酸含量，減少鷹嘴豆粉棉子糖、水蘇糖含量，改善面包風味及質構特性等方面具有良好的應用潛力。