隴西臘肉傳統制作過程中細菌群落演替對脂肪水解及氧化的影響

李彥虎，贠建民，趙風云，張紊瑋，艾對元

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

傳統隴西臘肉一般在每年冬至來臨之際至來年立春集中制作，主要以豬肉為原料，剔除中軀鮮肉肩胛骨、肱骨或胸肋骨，分割成10～15 kg的肉胚塊，采用干腌法腌制（香辛料、5%食鹽）、經自然風干工藝加工而成的一種發酵肉制品[1]。隴西臘肉因其獨特的臘香味深受人們喜愛，這種臘香味的形成與脂肪水解、氧化具有著密不可分的聯系[2-3]。

研究腌臘肉制品風味產生途徑發現，脂肪的水解、氧化對腌臘肉制品風味形成的貢獻很大[4-5]。脂肪分子在內源性脂肪酶的作用下產生游離脂肪酸，游離脂肪酸以及脂肪又將通過3 種氧化途徑（自動氧化、酶促氧化、光氧化）使得脂肪大分子徹底降解生成小分子，如醛、醌、醇、脂肪酸、烴類，同時賦予了腌臘肉制品獨特的臘香味[6-9]。以上研究說明非生物因子在脂肪水解及氧化過程中扮演了重要的角色。

傳統腌臘肉制品制作過程中富集了大量的微生物，并且這些微生物展現了許多重要的功能。已經明確的功能主要包括：促使蛋白質降解形成肽和氨基酸[10-13]；增加產品揮發性組分含量[14]；抑制生物胺的產生[15]；以及促進碳水化合物分解[16]；促進脂肪的降解及氧化[17]。除此之外，腌臘肉制品微環境中豐富的微生物組還有許多潛在功能尚待挖掘。近年來，腌臘肉制品中微生物研究手段也隨著基因測序技術的進步而蓬勃發展，基于高通量測序技術的免培養方法為全面、真實地了解環境中微生物群落結構提供了可能[18]。高通量測序技術已逐漸應用于香腸[19]、火腿[20]、風干肉[21]等發酵肉制品微生物種群特性的研究中。

目前，關于微生物因素在發酵肉制品脂肪代謝過程中發揮重要作用的研究已成該領域研究熱點之一，如培根[22]、酸魚[23]、意大利發酵腸[24]、酸肉[25]等，而鮮見隴西臘肉中的此類研究。因此，研究隴西臘肉制作過程中細菌群落演替對脂肪水解及氧化的影響十分必要。本實驗以傳統隴西臘肉為材料，采用高通量測序技術重點研究并分析臘肉制作過程中細菌群落演替現象，并結合氣相色譜-質譜聯用技術檢測制作過程中揮發性脂肪酸組成以及肉過氧化值和酸價的變化，以期明確隴西臘肉制作過程中細菌群落演替對脂質水解及氧化的影響規律，為解析脂肪代謝影響因素以及進一步揭示隴西臘肉風味形成機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隴西臘肉，采自甘肅省隴西縣大胡子傳統臘肉生產基地。

E.Z.N.A. Soil DNA提取試劑盒 美國Omega公司；Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒 美國Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 美國Illumina公司。其余有機試劑均為國產色譜純。

1.2 儀器與設備

7000D三重四極桿氣相色譜-質譜聯用儀（配有電子電離源和NIST質譜數據處理系統）、PAL3自動三合一進樣器系統 美國Agilent公司；Q32866型Qubit 2.0熒光計 美國Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；SW-CJH-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；754PC紫外-可分光光度計上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臘肉樣品采集

本實驗跟蹤采集隴西臘肉一個批次（約6～8 t）生產完整過程。根據制作周期確定5 個時間點（表1）。采樣完成后樣品置于冰盒內當天運回實驗室進行分樣，每份樣品不少于500 g。每個時間點的樣品采集3 個平行樣品，然后均勻混合，準確稱取樣品（規格：10 g/管）分裝于若干個無菌取樣管，并按照不同采樣時期編號，以上過程均在超凈工作臺內完成，經液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱，以備微生物檢測以及脂肪酸等指標的測定。

表1 樣品信息Table 1 Information about bacon samples tested in this study

1.3.2 臘肉微生物總DNA的提取與測序

采用DNA提取試劑盒，參照說明書從樣品中提取DNA；然后使用Qubit 2.0分光光度計對提取的DNA進行定量，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取結果。PCR擴增16S rRNA V3-V4區，引物序列：338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。Illumina MiSeq高通量測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.3 高通量測序數據處理[26-28]

采用Mothur（version 1.31.2）和QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，version 1.7.0）軟件處理及分析高通量測序數據。使用UCHIME（version 4.2）軟件鑒定和去除嵌合體序列。將序列分配入對應樣本，使用UCLUST算法進行序列聚類，以97%的序列相似度作為劃分閾值，將樣品聚類成可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。利用Mothur（version 1.31.2）軟件進行α多樣性分析，其中包括Simpson指數、Chao1指數和Shannon指數，并在不同的分類水平上對群落結構進行統計分析。并使用R（version 2.15.3）軟件進行可視化。通過PICRUSt（version 1.0）軟件對群落基因功能特征進行預測。

1.3.4 脂肪酸價、過氧化值的測定

參照GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》[29]測定臘肉酸價；參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[30]測定臘肉過氧化值。

1.3.5 游離脂肪酸測定

游離脂肪酸提取及甲酯化[31]：準確稱取肉樣品1 g，裝入具塞試管，并加入0.7 mL 10 mol/L氫氧化鉀溶液和5.3 mL無水甲醇，于55 ℃恒溫水浴1.5 h，每隔20 min振搖試管5～10 s，水浴結束后取出試管，自來水冷卻至室溫，然后加入0.58 mL 12 mol/L H2SO4溶液，55 ℃繼續水浴1.5 h，同時每20 min振搖5 s，用自來水冷卻，加入3 mL正己烷萃取，搖勻后轉移至離心管，3 000 r/min離心5 min，用0.22 μm有機膜過濾上清液，每個樣品不低于1 mL，進行氣相色譜-質譜檢測。

氣相色譜條件：色譜柱：VF-WAX ms毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率上升至180 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升溫至245 ℃，保持15 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa，液體進樣，進樣量1 μL；分流比10∶1。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z265；激活電壓1.0 V；質量掃描范圍m/z40～400。溶劑延遲4 min。

采集到的質譜數據經NIST12數據庫檢索定性，將匹配度大于800作為鑒定依據，通過峰面積歸一化法計算各組分相對峰面積。

1.4 數據處理

理化實驗數據經3 次平行實驗后得到，采用Excel軟件對數據進行統計處理，Origin 9.0繪制圖表，SPSS 19.0進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同時期臘肉中細菌群落多樣性分析

表2 臘肉樣品中細菌α多樣性分析Table 2 α Diversity of bacteria in bacon samples

基于Illumina MiSeq雙端測序法對隴西臘肉樣品中提取的微生物總DNA的V3-V4區進行測序，并對測序結果進行整理、過濾。結果顯示，所有樣品共檢出186 866 條有效16S rRNA基因序列（表2）。所有樣本的覆蓋范圍86.3%～95.4%不等，這表明測序深度能夠代表臘肉中存在的細菌系統型大部分已經被捕獲。采用QIIME軟件按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，所有樣品中總共得到580 個OTU，OTU數可以反映出樣品中細菌的豐度。通過Chao1指數和Simpson、Shannon指數分析樣品中微生物組的α多樣性（表2）。Chao1指數是群落豐度指數，Chao1指數越大，表明樣品微生物群落豐度越高；Shannon指數是群落分布多樣性指數，Shannon、Simpson指數越大，表明樣品微生物多樣性越高。結果表明，所有樣品中的Chao1指數及Shannon、Simpson指數在T90樣品中最大，表明T90樣品中微生物群落豐度以及多樣性最高，T60樣品次之，這說明在風干期隴西臘肉中微生物豐度和多樣性最高，也間接顯示隴西臘肉風干階段是重要的后發酵時期，這可能是由于腌制期氯化鈉本身的毒害作用以及滲透壓升高對細菌的抑制作用導致腌制期內細菌豐度和多樣性低于風干期。加之，本實驗室前期研究成果表明，腌制中期pH值（5.87）低于風干期（6.16），說明pH值也是影響腌制期與風干期微生物差異的原因；另外，從腌制期到風干期水分活度逐漸降低，至成品期時水分活度降至0.831，但腌制中期時水分活度為0.96，適宜于絕大多數微生物生長，可見水分活度不是影響該時期細菌多樣性變化的主要原因[32]。

2.2 不同時期臘肉中細菌群落分類統計分析

圖1 細菌門水平（A）和屬水平（B）相對豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria at the phylum (A) and genus level (B)

為揭示各時期樣品群落動態演替規律，統計樣品中菌群相對豐度。如圖1A所示，總共有15 個細菌門被檢出，但平均相對豐度大于1%的菌門有6 個。整個過程中，Proteobacteria和Firmicutes占優勢，Proteobacteria的相對豐度最高，占63.84%～81.34%，Firmicutes占8.9%～30.4%，Actinobacteria相對豐度為1.3%～5.2%，Cyanobacteria相對豐度為0.1%～5.5%，其他菌門相對豐度均低于0.1%。屬分類水平下，樣品中共檢測到414 個細菌屬，相對豐度位于前25 位的菌群分布見圖1B。在整個過程中Brochothrix、Carnobacterium、Lactobacillus、Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Cupriavidus平均相對豐度最高，為優勢菌。董蘊等[33]研究發現湖北恩施地區臘肉中優勢細菌屬為Staphylococcus、Psychrobacter、Pseudoalteromonas、Brochothrix、Cobetia、Acinetobacter，與本研究結果相似。由于隴西臘肉整個制作過程肉胚溫度均低于10 ℃，這可能是嗜低溫菌群成為優勢菌的主要原因，如Brochothrix、Pseudoalteromonas、Psychrobacter，而且本實驗中優勢菌群存在明顯的演替現象。例如，Psychrobacter在T15樣品中達到最高相對豐度（56%），隨后逐漸降低。Brochothrix在T30樣品達到最高相對豐度（17.9%）。Lactobacillus相對豐度在T60樣品最高（8.5%），T90樣品又降至5.3%。Pseudoalteromonas相對豐度由T0樣品0.6%增加至T90樣品的5.2%。Carnobacterium相對豐度由T0樣品的5.5%降低至T90樣品的0.8%。Cupriavidus在T0樣品中達到最高，隨后逐漸降低。除此之外，Staphylococcus相對豐度在T15樣品最高（5.6%），隨后逐漸降低。Micrococcus由T0樣品的1.4%降至T90樣品的0.4%。Streptococcus由T0樣品的1.4%降至T90樣品未檢出。

圖2 屬水平細菌豐度熱圖Fig.2 Heat map showing bacterial community abundance at the genus level

為了更直觀地呈現隴西臘肉制作過程中優勢細菌的群結構及豐度變化，使用R軟件，對相對豐度位于前50 位的細菌屬繪制熱圖（圖2）。通過聚類，可以將高豐度和低豐度的分類單元加以區分，并以顏色梯度反映樣本之間的群落組成相似度。所有樣品分為3 組（T0-T15、T30、T60-T90），即腌制期、腌制后期、風干期。隨著不同工序的進行，原料肉從加入腌料腌制到自然風干過程中，細菌發生交替性變化，并且，各時期樣品中優勢菌群各不相同。腌制期由于臘肉基質中滲透壓（氯化鈉濃度）的變化使得此時期主要以耐鹽細菌為主，由圖2可以看出，腌制中期主要為Corynebacterium、Macrococcus、Faecalibacterium、Claudia、Oscillospira、Ruminococcus、Chryseobacterium；腌制后期主要以Micrococcaceae、Arthrobacter、Streptococcus、Staphylococcus為主。風干期至成品期最主要的變化是由于水分活度的變化，到成品期時水分活度為0.831，此時細菌主要為耐低水分活度的微生物以及不同類型微生物代謝產物形成相互抑制，使復雜的細菌群組得到進一步優化與組合，因此，風干期以Planococcus、Amycolatopsis、Flavobacterium、Erwinia、Planomicrobium為主。

2.3 基因功能預測

表3 PICRUSt代謝功能預測分析Table 3 Metabolic function prediction with PICRUSt

PICRUSt軟件用于預測樣品中存在細菌的功能基因及其代謝途徑。隴西臘肉樣品中涉及代謝途徑有：氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、能量代謝、酶家族、聚糖生物合成與代謝、脂肪代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、核苷酸代謝、異種生物的生物降解和代謝（表3）。其中，平均基因豐度最高的代謝通路為氨基酸代謝（11.19%），其次，分別為碳水化和物代謝（9.46%）、能量代謝（5.77%）、輔助因子和維生素代謝（4.36%）和脂肪代謝（4.17%），說明隴西臘肉制作過程中細菌參與了主要營養素的代謝以及能量的合成，這些代謝產物的積累是臘肉風味形成的基礎。也有部分細菌參與了脂肪代謝，這從基因層面直接揭示了細菌與脂肪代謝的相關性。

2.4 優勢細菌對臘肉脂肪氧化的影響

圖3 隴西臘肉制作過程中酸價（A）和過氧化值（B）的變化Fig.3 Changes in AV (A) and POV (B) during the production of Longxi bacon

酸價可以間接反映脂肪中游離脂肪酸的含量，試樣中的游離脂肪酸主要來自脂肪的水解以及脂肪氧化產生的小分子脂肪酸。從圖3可以看出，隴西臘肉制作過程中酸價逐漸升高，酸價（以KOH計）由T0樣品0.36 mg/kg逐漸增加至T90樣品1.23 mg/kg，比原料肉中酸價增加了2.4 倍。說明隨著制作時間的延長脂肪逐漸發生水解，脂肪酸積累導致酸價升高。

過氧化值是反映脂肪氧化程度的參數，是不飽和脂肪酸中雙鍵與空氣中氧氣結合產物的量化指標，過氧化值高表明脂肪氧化的中間產物積累多。從圖3可以看出，在傳統隴西臘肉加工過程中，過氧化值逐漸升高，由T0樣品0.015 g/100 g增加至T90樣品0.034 g/100 g，比原料肉增加了97%。說明脂肪的氧化產物不斷累積。這可能是由于肉胚中乳酸菌和葡萄球菌代謝活動所致。研究證實Staphylococcus、Lactobacillus分泌豐富的酶系加速脂肪氧化，從而使得肉樣過氧化值升高[34-35]。另外，游離脂肪酸的積累也能促進脂肪氧化使得過氧化值升高[36]。

2.5 隴西臘肉制作過程中游離脂肪酸的變化

如表4所示，隴西臘肉中的脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸組成，且各時期相對含量有所不同，總占比83.84%～92.43%。游離脂肪酸中棕櫚酸、油酸、亞油酸能在后續加工貯藏過程中產生重要的揮發性物質，亞油酸氧化能產生2-戊基呋喃和2-庚酮等物質，且2-戊基呋喃是具有類火腿香型的揮發性物質[37-38]。

表4 隴西臘肉制作過程中游離脂肪酸的變化Table 4 Changes in free fatty acids during the production of Longxi bacon

整個制作過程中占飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）總含量最高的為硬脂酸和棕櫚酸。其中，硬脂酸在原料肉中（T0樣品）相對含量為9.75%，隨后相對含量逐漸升高，至成品肉（T90樣品）時高達12.7%。棕櫚酸在原料肉（T0）中相對含量最高（25.41%），之后逐漸降低。

值得注意的是，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）占脂肪酸總含量比例最高。整個制作過程中樣品MUFA含量最高為棕櫚油酸、油酸，其中，棕櫚油酸在原料肉（T0樣品）相對含量最高（7.5%），隨后逐漸降低；油酸在T30樣品中相對含量最高（40.46%）。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）中亞油酸所占比例最大，并且呈逐漸升高趨勢，在成品肉中相對含量達到最高（14.62%）。

此外，隴西臘肉制作過程中原料肉至成品肉中ΣSFA所占比例在35.24%～39.8%之間，至成品肉時有所減少（減少8.6%），并且ΣMUFA相對含量較原料肉降低了10.34%，說明細菌參與下發生氧化降解，這也是制作過程中過氧化值上升的主要原因（圖3B）。不飽和脂肪酸（ΣPUFA+ΣMUFA）所占比例在55.14%～61.68%之間，尤其成品期ΣPUFA相對含量較原料肉增加了46%，說明PUFA是酸價上升的主要原因（圖3A）。各時期樣品中ΣPUFA/ΣSFA值在0.291～0.505之間（表4），成品肉時為0.465，較原料肉（0.291）有所增加，營養學家認為ΣPUFA/ΣSFA比值在0.4以上則肉品中脂肪酸組成較為均衡[39]，很明顯隴西臘肉脂肪酸組成滿足此條件。另外，飲食富含PUFA可以降低血液中的膽固醇水平[40]。

2.6 優勢菌群與游離脂肪酸的相關性分析

表5 優勢菌群與脂肪酸之間的相關性分析Table 5 Correlation analysis between dominant bacteria and fatty acids in Longxi bacon

選取隴西臘肉制作過程中的主要脂肪酸與優勢細菌屬進行相關性分析，結果如表5所示。主要脂肪酸含量變化與大部分優勢菌群呈顯著相關性，僅有少數菌群正、負相關性不明顯。隴西臘肉制作過程中與SFA相關的菌群主要是Lactobacillus、Streptococcus。其中，硬脂酸與Streptococcus豐度變化極顯著相關（P＜0.01），與Lactobacillus顯著相關（P＜0.05），棕櫚酸與Streptococcus顯著相關（P＜0.05）。Lactobacillus通過分泌脂酶加速脂肪降解，有利于硬脂酸的積累，而Streptococcus可能促進了棕櫚酸的氧化導致其在成品肉中含量有所下降[41]。MUFA總量與Streptococcus顯著相關（P＜0.05）。其中，棕櫚油酸與Carnobacterium顯著相關（P＜0.05），Staphylococcus極顯著相關（P＜0.01）。Carnobacterium[42]、Staphylococcus[34,43]同樣能分泌脂酶，這可能是造成棕櫚油酸氧化的原因，Staphylococcus作用更明顯。油酸與Brochothrix顯著相關（P＜0.05），Brochothrix[44]是肉品常見腐敗菌，說明Brochothrix可能主要通過油酸造成脂肪氧化酸敗導致肉品腐敗。PUFA總量與Streptococcus、Staphylococcus、Lactobacillus豐度變化顯著相關（P＜0.05）。其中，亞油酸與Staphylococcus、Cupriavidus、Carnobacterium豐度變化顯著相關（P＜0.05），說明這些菌群有能促進亞油酸的生成與積累[45]。

綜上，通過明晰優勢菌群與主要脂肪酸變化的相關性，有助于進一步通過定向調整或控制隴西臘肉制作過程中的工藝參數（如氯化鈉添加量、通風時間、環境溫度等）以提升臘肉品質，進而為臘肉風味形成提供理論依據。

3 結 論

本研究表明隴西臘肉制作過程中菌群演替存在明顯的時間異質性，傳統制作工序變化（腌制、自然風干）是優勢菌群Brochothrix、Carnobacterium、Lactobacillus、Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Cupriavidus演替的驅動力；脂肪代謝通路從基因層面直接揭示細菌參與了脂肪代謝；棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸是隴西臘肉中主要脂肪酸，總占比83.84%～92.43%；隴西臘肉制作過程脂肪酸變化與優勢細菌屬具有明顯相關性，Streptococcus、Staphylococcus、Lactobacillus、Cupriavidus、Carnobacterium、Brochothrix是參與脂肪代謝主要菌群；在此期間，Streptococcus、Lactobacillus主要參與SFA、PUFA的形成與轉化，Carnobacterium、Staphylococcus、Brochothrix、Cupriavidus主要參與了不飽和脂肪酸代謝，并與棕櫚油酸、油酸、亞油酸含量的變化密切相關；不飽和脂肪酸氧化可能是酸價、過氧化值上升的主要原因，優勢菌群主要通過不飽和脂肪酸的變化干預脂肪氧化。研究揭示了隴西臘肉制作過程中細菌群落演替與脂肪水解及氧化規律，為其品質提升以及傳統制作工藝向現代化轉變提供理論支撐。