N末端結構模塊缺失對嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL酶學性質的影響

曾 靜，何礎闊，郭建軍，袁 林,*

（1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570228）

在淀粉酶法制糖工業中，由液化轉入糖化時需要降低溫度并加酸降低糖漿的pH值。并且糖化過程中使用了多種水解酶，這些因素使得淀粉制糖的生產成本增加，同時降低了生產效率[1-4]。此外，淀粉中α-1,6-糖苷鍵不僅抵抗α-淀粉酶和β-淀粉酶的水解作用，還阻礙鄰近α-1,4-糖苷鍵的水解，從而導致α-(β)-極限糊精的產生，進而顯著降低淀粉糖化的程度和效率[4]。若某種淀粉水解酶在液化條件下可以同時進行糖化，則既可以省去調節pH值的過程以簡化工藝、降低成本，又可以有效地防止微生物污染，并且在液化的高溫下，還可以獲得較高的反應速率。因此，將液化過程和糖化過程合并，以便獲得一種在液化條件下具有較強的水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵能力的淀粉水解酶成為從業者亟待解決的問題。

III型普魯蘭多糖水解酶是一種雙功能淀粉水解酶，具有α-淀粉酶和普魯蘭酶的功能，可同時水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵[5-7]。嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶能夠在高溫的液化條件下進行糖化作用，可使淀粉酶法制糖工業的液化過程和糖化過程合二為一，從而大大降低生產成本，提高生產效率[8-9]。嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶在淀粉酶法制糖流程中具有很大應用優勢，因此有關嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶的研究已成為淀粉水解酶研究中的新熱點。

來源于極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensisKOD1的嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL的酶學性質完全符合淀粉酶法制糖工業的需求，并且已被證實可應用于液化與糖化一步法制備麥芽糖漿[10-14]。因此，TK-PUL在淀粉酶法制糖工業中具有重要的應用價值。此外，TK-PUL以單一活性中心同時水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的雙功能催化機制研究也具有重要理論研究價值。TK-PUL的氨基酸序列和三級結構顯示，TK-PUL屬于糖苷水解酶類的第13家族（GH13_20），其由N末端結構模塊N1（Ser18～Ile77）、結構模塊N2（Glu78～Phe180）、結構模塊N（Tyr181～Glu280）和催化結構域GH13_20（Gly281～Gly762）組成[15]。結構模塊N與催化結構域GH13_20緊密結合，并且經實驗證實結構模塊N是TK-PUL發揮催化活性所必需的（缺失結構模塊N的突變體沒有催化活性，結果未顯示）。結構模塊N1和結構模塊N2與結構模塊N和催化結構域GH13_20的結合較為松散，這2 個結構模塊甚至不能以晶體形式呈現，在TK-PUL晶體結構中未能顯示[15]。TK-PUL中結構模塊N1和N2屬于未知功能結構域，其對TK-PUL酶學性質的影響有待進行研究。本研究通過對TK-PUL的N末端進行截短突變，并比較TK-PUL與突變體的酶學特性，來確定N末端結構模塊N1和N2對TK-PUL酶學性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌Escherichia coliJM109、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisRIK1285、TK-PUL表達載體pBE-S-Atkp均由本實驗室保存；KOD-Plus-neo DNA聚合酶日本Toyobo公司；DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker 美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A.美國Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow美國GE Healthcare公司；普魯蘭糖、γ-環糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖原 美國Sigma公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、咪唑 生工生物工程（上海）股份有限公司；實驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Mastercycler gradient聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統 北京君意東方電泳設備有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒的構建及鑒定

根據TK-PUL的基因編碼序列（Gene ID：3235344），設計本研究中構建重組質粒所用引物，如表1所示。以重組質粒pBE-S-Atkp為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，獲得編碼突變體M1的基因Atkp-m1。PCR擴增體系為：10×buffer I 5 μL；dNTP 5 μL；MgSO45 μL；引物各2 μL；模板1 μL；KOD-Plusneo DNA聚合酶2 μL；ddH2O 28 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸1 min，35 個循環；68 ℃延伸10 min。擴增產物經NdeI和XbaI雙酶切，連接至經相同雙酶切處理的重組質粒pBE-S-Atkp，構建重組質粒pBE-S-Atkp-m1。以重組質粒pBE-S-Atkp為模板，以P3和P2為引物進行PCR擴增，獲得編碼突變體M3的基因Atkp-m3。重組質粒pBES-Atkp-m3的構建方法同上。采用NdeI和XbaI雙酶切重組質粒，鑒定外源基因的插入情況。

采用大引物全質粒PCR技術[16]構建表達突變體M2的重組質粒pBE-S-Atkp-m2。以重組質粒pBE-S-Atkp為模板，采用突變引物P4和公用引物P5進行大引物的擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果。然后再以重組質粒pBE-S-Atkp為模板，采用上步獲得的PCR產物（大引物）進行全質粒擴增。擴增產物經DpnI酶處理后，轉化大腸桿菌E. coliJM109感受態細胞，涂布含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板進行篩選，經測序鑒定是否為突變基因Atkp-m2。

將所得重組質粒均送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序，并將測序結果與TK-PUL的基因序列進行比對，確證重組質粒中插入基因的序列正確性。

表1 構建重組質粒所用引物Table 1 Primer sequences used for the construction of recombinant plasmids

1.3.2 重組蛋白質的誘導表達和純化

將重組質粒轉入枯草芽孢桿菌B. subtilisRIK1285，獲得重組枯草芽孢桿菌。B. subtilisRIK1285感受態細胞的制備和轉化采用改進的Spizizen法[17]進行。

接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養基中，250 mL三角瓶中培養，裝液量20 mL，37 ℃振蕩培養過夜。然后轉接該培養物于新鮮LB液體培養基中，用250 mL三角瓶進行培養，其中培養基的裝液量為25 mL，接種量為3%，培養溫度為37 ℃，轉速為200 r/min，培養時間為48 h。待培養結束后，將培養物于室溫12 000 r/min離心5 min，收集發酵液上清。

采用Ni2+親和層析柱對發酵上清液中目的蛋白質進行純化，用200 mmol/L咪唑緩沖液洗脫，即得到純化后的重組蛋白質。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測重組蛋白質的純度[18]，并采用Bradford法[18]測定重組蛋白質的濃度。

1.3.3α-淀粉酶活性測定和普魯蘭酶活性測定

以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，分別測定III型普魯蘭多糖水解酶的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將10 μL酶液（10 μg/mL）與490 μL含1 mg/mL可溶性淀粉或普魯蘭多糖的pH 4.5、50 mmol/L 4-嗎啡啉-乙烷磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）緩沖液混合，于100 ℃反應30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[19]測定反應體系中還原糖量。酶活力單位（U）定義：在一定反應條件，每分鐘催化產生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位。

1.3.4 最適反應pH值及pH值穩定性測定

將酶液與不同pH值的底物（10 mg/mL的可溶性淀粉或普魯蘭多糖）混合，于100 ℃反應30 min測定不同pH值下α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將所測得的最高酶活力定義為100%，并以相對酶活力對pH值作圖，確定其最適反應pH值。采用不同緩沖液配制質量濃度均為10 mg/mL的不同pH值的底物：50 mmol/L MES緩沖液（pH 3.0～7.0）、50 mmol/L 3-嗎啡啉-丙磺酸緩沖液（pH 7.0～9.0）。

將酶液用不同pH值（3.0～9.0）緩沖液稀釋，將其在不同pH值條件下于37 ℃處理2 h，然后用10 mg/mL的緩沖液稀釋，并根據如上反應體系測定樣品的比活力。將未處理樣品的比活力定義為100%，計算處理后樣品的相對酶活力，并以相對酶活力對pH值作圖，評價酶的pH值穩定性。

1.3.5 最適反應溫度及熱穩定性測定

按照1.3.3節中反應體系混合酶液和底物，分別于40～110 ℃反應30 min，測定不同溫度下α-淀粉酶活力和普魯蘭酶活力。將所測得的最高酶活力定義為100%，以相對酶活力對溫度作圖，確定其最適反應溫度。

用50 mmol/L MES、pH 4.5緩沖液將樣品稀釋至適當濃度，將其于100 ℃保溫，分時間梯度取出部分樣品，根據1.3.3節中反應體系測定α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。將未處理的酶液的酶活力定義為100%，計算樣品的相對酶活力，以相對酶活力對時間作圖，評價酶的熱穩定性。

1.3.6 動力學常數測定

用50 mmol/L MES緩沖液（pH 4.5）配制不同質量濃度的底物（可溶性淀粉、普魯蘭多糖、γ-環糊精、玉米淀粉或糖原），分別向不同質量濃度底物中加入6 U酶液，按照1.3.3節中反應體系測定酶活力。根據雙倒數作圖法以底物質量濃度的倒數為橫坐標，以比活力的倒數為縱坐標作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計算米氏常數Km、最大反應速度Vmax和反應常數kcat。可溶性淀粉質量濃度梯度設定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL；普魯蘭多糖質量濃度梯度設定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL；γ-環糊精質量濃度梯度設定為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL；玉米淀粉質量濃度梯度設定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL；糖原質量濃度梯度設定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL。

1.3.7 底物特異性測定

用50 mmol/L MES緩沖液（pH 4.5）將樣品稀釋至適當濃度，分別以1 mg/mL普魯蘭多糖、γ-環糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、糖原為底物，于100 ℃反應30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應，然后采用DNS法測定反應體系中還原糖量，計算重組酶作用于不同底物時的比活力。將所測得的最高比活力定義為100%，計算重組酶作用于不同底物時的相對酶活力。

1.4 數據處理

酶學性質研究實驗中，每個實驗做3 個平行。運用軟件SigmaPlot 12.5對實驗數據進行統計分析并作圖，數據均以表示。

2 結果與分析

2.1 N末端結構模塊相關缺失突變體的構建、表達與純化

TK-PUL的分子結構顯示其由結構模塊N1-結構模塊N2-結構模塊N-催化結構域GH13_20順序連接組成（圖1A）[15]。利用NCBI網站的保守結構域數據庫[20]（conserved domain database，CDD）對TK-PUL中結構模塊N1和結構模塊N2進行分析，結果顯示結構模塊N1屬于未知功能結構域，結構模塊N2屬于CBM48家族[21-24]。已有研究表明，糖苷水解酶中的非催化結構域對其底物特異性、底物結合能力、底物降解能力以及結構穩定性等起到重要作用，并對糖苷水解酶的催化特性顯示不同程度的影響[25]。本研究為了確定TK-PUL中未知功能結構模塊N1和N2對其酶學性質的影響，對TK-PUL的N末端進行截短突變，構建了缺失結構模塊N1的突變體M1、缺失結構模塊N2的突變體M2以及同時缺失結構模塊N1和N2的突變體M3，各突變體的結構模式圖如圖1A所示。

圖1 重組蛋白質結構模式圖及SDS-PAGE檢測圖Fig.1 Schematic representation and SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

將各突變體于枯草芽孢桿菌表達系統中進行表達，目的蛋白質TK-PUL、M1、M2以及M3均得到成功表達，且主要位于發酵上清液中。采用Ni2+親和層析法對發酵上清液中的目的蛋白質進行純化，得到純化后的重組蛋白質TK-PUL、M1、M2以及M3。如圖1B所示，TK-PUL、M1、M2以及M3的表觀分子質量分別約為84、78、72、65 kDa，大小均與理論值相符。

2.2 N末端結構模塊相關缺失突變體的最適反應pH值及pH值穩定性

為了研究N末端結構模塊對TK-PUL最適反應pH值及pH值穩定性的影響，本研究比較了TK-PUL及其N末端結構模塊缺失突變體的最適反應pH值及pH值穩定性，結果如圖2、3所示。由圖2可知，以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時，TK-PUL及其N末端結構模塊缺失突變體的最適反應pH值均約為4.5，并且各重組酶的最適反應pH值曲線的變化趨勢基本相同。這表明N末端結構模塊的缺失不影響TK-PUL的最適反應pH值。

圖2 重組酶的最適反應pH值Fig.2 Optimal pH of recombinant enzymes

重組酶的pH值穩定性測定結果顯示（圖3），不同重組酶的pH值穩定性有明顯差異。以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時，TK-PUL和各突變體均于pH 5.5具有最高的穩定性，TK-PUL和突變體M1具有相近的pH值穩定性，突變體M2和M3具有相近的pH值穩定性。其中，以可溶性淀粉為底物時，在pH 3.0～5.5的范圍內，突變體M1的pH值穩定性略低于TK-PUL的pH值穩定性；在pH 5.5～9.0的范圍內，兩者的pH值穩定性基本一致。以普魯蘭多糖為底物時，在pH 3.0～9.0的范圍內，突變體M1的pH值穩定性略低于TK-PUL的pH值穩定性。在pH 3.0～9.0的范圍內，突變體M2和M3的pH值穩定性明顯低于TK-PUL和突變體M1的pH值穩定性。以上研究結果表明，結構模塊N1對TK-PUL的pH值穩定性的影響較小，結構模塊N2對TK-PUL維持pH值穩定性非常重要。

綜合以上研究結果，TK-PUL中結構模塊N1的缺失不影響TK-PUL的最適反應pH值，并且對其pH穩定性的影響較小；結構模塊N2的缺失不影響TK-PUL的最適反應pH值，但是導致TK-PUL的pH值穩定性降低，即結構模塊N2對于TK-PUL維持pH值穩定性非常重要。據研究報道，來源于普魯蘭芽孢桿菌B. acidopullulyticus的普魯蘭酶BaPul的N末端未知功能結構域X25和結構域CBM41不影響其最適反應pH值，但是結構域X25和結構域CBM41影響BaPul的pH值穩定性[26]。其中結構域X25對其維持pH值穩定性發揮正向促進作用，而結構域CBM41不利于其維持pH值穩定性。這表明，不同糖苷水解酶中類似的結構模塊發揮不同作用，對酶學特性產生不同影響。

圖3 重組酶的pH值穩定性Fig.3 pH stability of recombinant enzymes

2.3 N末端結構模塊相關缺失突變體的最適反應溫度及熱穩定性

如圖4所示，TK-PUL及各突變體具有相同的最適反應溫度（100 ℃），但是重組酶具有不同的相對酶活力。在40～110 ℃的范圍內，特別是70～110 ℃的范圍內，各重組酶從大到小的相對酶活力大小依次排序為：M3、M2、M1、TK-PUL。該結果表明，TK-PUL及各突變體具有相同的最適反應溫度，但是N末端結構模塊相關缺失突變體的熱穩定性明顯高于TK-PUL。同時，重組酶的熱穩定性測定結果（圖5）顯示，N末端結構模塊相關缺失突變體于100 ℃的半衰期均長于TK-PUL的半衰期。其中，100 ℃各重組酶從大到小的熱穩定性大小依次排序為：M3、M2、M1、TK-PUL。TK-PUL、M1、M2、M3于100 ℃的半衰期分別約為2.00、2.30、2.50、2.55 h。與TK-PUL相比，結構模塊N1缺失的突變體M1于100 ℃的半衰期延長至TK-PUL的1.15 倍，結構模塊N2缺失的突變體M2于100 ℃的半衰期延長至TK-PUL的1.25 倍，結構模塊N1和N2均缺失的突變體M3于100 ℃的半衰期延長至TK-PUL的1.27 倍。

已有研究表明，蛋白質分子中柔性結構區域通常與蛋白質的熱穩定性呈負相關，柔性結構區域的缺失可能提高蛋白質的熱穩定性[27]。TK-PUL的N末端結構模塊N1和N2不能在其晶體結構中呈現，結構模塊N1和N2屬于柔性結構區域[15]。本研究中TK-PUL的結構模塊N1和N2與其熱穩定性呈負相關，結構模塊N1和N2的缺失有利于TKPUL提高熱穩定性。類似的現象也見于缺失位于N末端的柔性結構域CBM41的普魯蘭酶BaPul突變體[27]和缺失位于N末端的結構域N1的淀粉普魯蘭酶gt-apu突變體[28]。

圖4 重組酶的最適反應溫度Fig.4 Optimal temperature of recombinant enzymes

圖5 重組酶于100 ℃的熱穩定性Fig.5 Thermal stability of recombinant enzymes at 100 ℃

2.4 N末端結構模塊相關缺失突變體的比活力和動力學常數

本研究測定并比較了TK-PUL及其N末端結構模塊相關缺失突變體于100 ℃以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時的比活力和動力學常數，依此確定N末端結構模塊N1和N2對TK-PUL的底物結合能力和底物降解能力的影響。由表2可知，與TK-PUL相比，突變體M1的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力的比值基本不變，但是其α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力均得到提高，其中α-淀粉酶比活力提高至TK-PUL的1.11倍，普魯蘭酶比活力提高至TK-PUL的1.12 倍。另外，表3顯示，與TK-PUL相比，突變體M1以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物的Km值基本不變，kcat值明顯提高。這些結果表明，結構模塊N1的缺失不影響TK-PUL的底物結合能力，并且有利于提高其底物降解能力。

表2 TK-PUL及其突變體于100 ℃的比活力Table 2 Specific activities of TK-PUL and its mutants at 100 ℃

表3 TK-PUL及其突變體的動力學常數（1）Table 3 Kinetic parameters for specific activities of TK-PUL and its mutants (1)

由表2可知，與TK-PUL相比，突變體M2和M3的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力均下降，但是這2 個突變體的α-淀粉酶比活力與普魯蘭酶比活力的比值均有提高。其中突變體M2的α-淀粉酶比活力為TK-PUL的80.58%，普魯蘭酶比活力為TK-PUL的65.40%，α-淀粉酶比活力與普魯蘭酶比活力的比值為TK-PUL的1.22 倍；突變體M3的α-淀粉酶比活力為TK-PUL的84.60%，普魯蘭酶比活力為TK-PUL的70.89%，α-淀粉酶比活力與普魯蘭酶比活力的比值為TK-PUL的1.18 倍。突變體M3的比活力略高于突變體M2的比活力。由表3可知，突變體M2和M3以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時的kcat值幾乎不變，Km值明顯提高。相對于TK-PUL，突變體M2以可溶性淀粉為底物時的Km值提高至TK-PUL的1.52 倍，以普魯蘭多糖為底物時的Km值提高至TK-PUL的1.78 倍；突變體M3以可溶性淀粉為底物時的Km值提高至TK-PUL的1.47 倍，以普魯蘭多糖為底物時的Km值提高至TK-PUL的1.77 倍。即結構模塊N2的缺失不影響TK-PUL的底物降解能力，但是導致其底物結合能力下降，進而導致其比活力降低。

結合突變體M2和M3的α-淀粉酶比活力和普魯蘭酶比活力的比值的變化情況（即α-淀粉酶比活力的下降比率低于普魯蘭酶比活力的下降比率），以及突變體對可溶性淀粉和普魯蘭多糖的結合能力的變化情況（即對可溶性淀粉的結合能力的下降比率低于對普魯蘭多糖的結合能力的下降比率），可以得出以下結論：結構模塊N2通過影響了TK-PUL對不同底物的親和力（即TK-PUL的底物選擇性），影響其α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。結構模塊N2對TK-PUL底物選擇性的影響，類似于來源于Anoxybacillussp. WB42的淀粉普魯蘭酶Pul WB42中N末端結構域N1[29]以及來源于堿湖生菌屬Alkalilimnicolasp. NM-DCM-1的淀粉普魯蘭酶PulD7中N末端結構域CBM48[30]對酶底物選擇性的影響。缺失結構域N1后，Pul WB42的α-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值由83%降至18%[29]；缺失結構域CBM48的PulD7只有α-淀粉酶活性而喪失普魯蘭酶活性[30]。

以上研究結果表明，雖然TK-PUL的N末端結構模塊N1和N2不是其發揮催化活性所必需的結構模塊，但是這2 個結構模塊影響其底物降解能力和底物結合能力。缺失結構模塊N1的突變體的底物結合能力不變，底物降解能力提高；缺失結構模塊N2的突變體的底物降解能力不變，底物結合能力降低。

2.5 N末端結構模塊相關缺失突變體的底物特異性

TK-PUL及其N末端結構模塊相關缺失突變體的底物特異性測定結果顯示（表4），所有重組酶的最適反應底物均是普魯蘭多糖。TK-PUL與突變體M1的底物特異性基本一致，即缺失結構模塊N1不影響TK-PUL的底物特異性。與TK-PUL相比，突變體M2和M3對小分子γ-環糊精的相對酶活力略有下降，對可溶性淀粉的相對酶活力略有提高，對其他大分子底物如玉米淀粉和糖原的相對酶活力明顯下降。這表明，結構模塊N2影響TK-PUL的底物特異性。

為了明確結構模塊N2影響TK-PUL底物特異性的分子機制，本研究測定了TK-PUL分別以γ-環糊精、玉米淀粉、糖原為底物時的動力學常數，結果如表5所示。與TK-PUL相比，突變體M2和M3以γ-環糊精為底物時的kcat值幾乎不變，Km值略有提高；以玉米淀粉或糖原為底物時的kcat值幾乎不變，Km值明顯提高。此外，表3顯示，與TK-PUL相比，突變體M2和M3以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時的kcat值幾乎不變，Km值明顯提高。其中，突變體M2和M3對可溶性淀粉的Km值的提高倍數小于突變體M2和M3對普魯蘭多糖的Km值的提高倍數，使得突變體M2和M3對可溶性淀粉的相對酶活力略有提高；突變體M2和M3對γ-環糊精、玉米淀粉或糖原的Km值的提高倍數大于突變體M2和M3對普魯蘭多糖的Km值的提高倍數，使得突變體M2和M3對這些底物的相對酶活力降低。以上結果表明，結構模塊N2通過影響酶分子對底物的結合能力，改變酶分子的底物特異性。

綜上，結構模塊N2屬于CBM48家族。CBM家族的基本功能是結合底物、促進催化結構域與底物密切接觸，從而促進底物水解[23]。例如普魯蘭酶BaPul中N末端結構域CBM41參與酶與底物的結合，影響酶對底物的降解，從而影響其底物特異性[31]。本研究中結構模塊N2對TKPUL底物特異性的影響與此類似。

表4 TK-PUL及其突變體的底物特異性Table 4 Substrate specificities of TK-PUL and its mutants

表5 TK-PUL及其突變體的動力學常數（2）Table 5 Kinetic parameters for substrate specificities of TK-PUL and its mutants (2)

3 結 論

本研究對III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL進行N末端截短突變，通過比較TK-PUL與突變體的酶學性質，確定N末端結構模塊的功能。未知功能結構模塊N1的缺失不影響TK-PUL的最適反應pH值、最適反應溫度、酶的底物結合能力以及酶的底物特異性。并且結構模塊N1的缺失提高了酶的比活力和熱穩定性。結構模塊N1的缺失改良了TK-PUL的催化特性，結構模塊N1缺失突變體M1更適用于淀粉酶法制糖工業。結構域N2的缺失提高了酶的熱穩定性，但是降低了酶的pH值穩定性、酶的底物結合能力以及比活力。并且結構域N2通過影響酶對不同底物的結合能力，影響其底物選擇性，導致其α-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值發生變化。另外，TK-PUL中結構模塊N1和N2均不是其發揮催化活性所必需的結構區域。本研究揭示了TK-PUL的N末端結構模塊與其催化特性之間的相關性，拓展了對III型普魯蘭多糖水解酶的構效關系的了解，為其他淀粉水解酶的構效關系和分子改造研究提供了科學依據。