紅樹莓果汁降酸發酵過程中活性成分的變化

陳思睿，唐 瑩，董 丹，蔣 瑩，何紅英，王金玲,2,*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅樹莓屬薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（RubusL.）植物，果實中含有豐富的類黃酮、酚酸、丹寧等酚類化合物[1]，具有抗氧化[2]、抗炎、降血脂、降血糖等多種功效[3]。樹莓酮是紅樹莓的特征性香氣成分，能夠提供甜果香并具有一定預防肥胖和降血脂作用[4]。這些成分是影響紅樹莓功能和營養特性的重要因素[5]。

紅樹莓適合進行多類型的食品開發利用，然而高檸檬酸含量[6]影響了其口感風味，限制了相關產品的開發。生物降酸是指利用能以有機酸為碳源的微生物，分解果汁或果酒中的有機酸，是一種有效的降酸方法，同時還能夠增加果汁或果酒的風味[7]。降酸菌發酵動態過程中，果汁中營養成分會隨之發生變化。生物降酸的研究集中在總酸和有機酸含量的變化，而降酸對活性成分影響的研究很少。馬旭藝[8]對山葡萄酒采用化學法協同生物法降酸，僅研究了有機酸含量和比例組成的變化。李靜[9]在獼猴桃酒中接入植物乳桿菌降解蘋果酸，僅對成品的總酚含量進行了測定。

本研究探討利用陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）WJL-G4菌株降酸過程對紅樹莓果汁中活性成分的影響，測定發酵過程中活性成分的變化，采用相關性分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）法分析發酵過程與活性成分之間的關系，以期為闡明該降酸菌的發酵特征及其在高酸果汁降酸的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓：品種為秋福，購于黑龍江省尚志市，速凍處理后運回東北林業大學食品科學與工程實驗室凍藏。

降酸酵母菌：由本實驗室在紅樹莓鮮果中篩選分離得到，經菌株形態學觀察、生理生化實驗和分子生物學鑒定為陸生伊薩酵母，命名為陸生伊薩酵母WJL-G4[10]，以下簡稱為降酸菌。

檸檬酸培養基：(NH4)2SO42 g，KH2PO42.5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，酵母膏0.5 g，檸檬酸20 g，瓊脂粉25 g，溶于1 L蒸餾水。

熊果苷、沒食子酸、隱綠原酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、對香豆酸、樹莓酮、芥子酸、金絲桃苷、蘆丁、鞣花酸、槲皮素、木犀草素、黃芩素（分析標準品） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾（中國）有限公司；甲酸（色譜純） 天津市大茂化學試劑廠；常規藥品試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；5030-PVL型高壓滅菌鍋 長春百奧生物儀器有限公司；721N型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓果汁的降酸處理

紅樹莓凍果自然解凍后，打漿1 min，果膠酶（40 000 U/g）添加量為0.02%（m/m），50 ℃酶解2 h。酶解后90 ℃滅酶5 min，8 層紗布過濾取果汁，置于滅菌錐形瓶中，巴氏殺菌后冷卻。

處理組：菌株接種于裝有100 mL檸檬酸培養基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、120 r/min培養24 h制成種子液，將活菌數為8×107CFU/mL的降酸菌種子液，以接種量4%（V/V）接種于上述紅樹莓果汁中，果汁裝液量為50 mL/250 mL錐形瓶，于28 ℃靜置培養8 d。

對照組：以在相同培養條件放置的未接種的紅樹莓果汁作為對照。

發酵所使用的紅樹莓果汁總酸質量濃度為25.16 g/L，pH值為3.08。前期實驗得出，以8 d為降酸發酵周期，總酸降酸率可達60.41%，pH值可由3.08上升為3.36[10]，本實驗的處理組和對照組在降酸發酵的第0、1、2、3、4、5、6、7、8天取樣，進行測定。

1.3.2 活性成分測定

總酚測定采用Folin-Ciocalteu比色法[11]，765 nm波長處吸光度為y，沒食子酸質量濃度為x（μg/mL），繪制標準曲線得到：y=0.007 2x+0.033 7，R2=0.993 5；總黃酮測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]，510 nm波長處吸光度為y，蘆丁質量濃度為x（μg/mL），繪制標準曲線得到：y=0.001x+0.071 3，R2=0.996 2；花色苷測定采用pH值示差法[13]。

1.3.3 HPLC分析

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm）；流動相：A為甲醇，B為0.02%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～5 min，0～10% A，100%～90% B；5～10 min，10%～20% A，90%～80% B；10～20 min，20%～35% A，80%～65% B；20～35 min，35%～40% A，65%～60% B；35～40 min，40%～75% A，60%～25% B；40～45 min，75%～10% A，25%～90% B；流速：0.8 mL/min，進樣量：10 μL，柱溫：35 ℃，檢測波長：280 nm。依次測定標樣系列和樣品。用標樣濃度對峰面積繪制標準曲線，測定樣品中的活性成分含量。

標準曲線：分別用甲醇溶解標準品配制成不同質量濃度的標準溶液，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，得到峰面積（x）和活性成分質量濃度（y）的回歸方程及相關系數。

樣品處理：果汁樣品4 000 r/min離心15 min，吸取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后測定。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 數據統計與分析

實驗均進行3 次重復，采用Excel軟件對測定數據進行整理統計，計算活性成分的平均值、標準差。采用Origin 8.5軟件進行作圖。采用SPSS 19.0軟件中Duncan法進行多重差異顯著性分析[14]。

1.3.4.2 適用性檢驗

采用SPSS 19.0分析軟件中的Pearson分析法對活性成分的含量進行相關系數矩陣的直觀檢驗，根據相關系數矩陣中相關系數反映出的原始變量之間的線性相關程度進行適用性檢驗[15]。

1.3.4.3 PCA

采用SPSS 19.0分析軟件對活性成分的含量進行PCA，得到解釋的總方差表，其中包括相關矩陣的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率，抽取其中特征值大于1.00的因子作為PC。根據載荷向量、得分等對發酵過程中紅樹莓果汁活性成分進行分析。PCA載荷向量除以方差的算術平方根得到系數（特征向量），根據系數得到PC的函數表達式[16]，計算各PC得分并制圖。

2 結果與分析

2.1 降酸菌對紅樹莓果汁活性成分的影響

發酵所使用的紅樹莓果汁總酚質量濃度為1.33 mg/mL，總黃酮質量濃度為0.69 mg/mL，花色苷質量濃度為30.22 mg/L。在28 ℃靜置發酵8 d，以未接菌的紅樹莓果汁為對照，測定發酵過程中不同時間所取樣品中總酚、總黃酮和花色苷含量。

由圖1A可知，處理組和對照組總酚含量在發酵0～2 d顯著降低（P＜0.05），在第3天時二者相差不大；4～7 d處理組含量略高于對照組。發酵8 d，處理組總酚質量濃度為0.95 mg/mL，對照組為1.04 mg/mL，分別為初始質量濃度的71.87%和78.38%。與對照組對比可知處理組在0～2 d總酚含量顯著降低（P＜0.05）的原因可能包括菌株發酵和放置環境，菌株生長繁殖代謝產生的酶，會分解多酚等大分子物質[17]；趙玉等[18]研究指出多酚在高溫、過酸或過堿、光照條件下含量均顯著降低，且多酚同樣對溫度和光照敏感；趙廣河等[19]研究表示有些發酵過程會導致丹寧的溶出、酸性環境下多酚分子重排、多酚的自聚合及與其他大分子的互作。

由圖1B可知，處理組總黃酮含量先減少后上升，第7天與第0天相比總黃酮含量顯著升高（P＜0.05），對照組發酵過程沒有顯著變化（P＞0.05）。發酵8 d，處理組總黃酮質量濃度為0.77 mg/mL，對照組為0.67 mg/mL，分別為初始質量濃度的111.32%和97.04%，處理組與對照組相比含量升高。降酸處理后總黃酮含量增加可能是因為酵母菌的代謝活動起到促進作用，酶促反應有利于黃酮的釋放[20]，也可能是經酵母菌代謝其他物質轉化而來。有研究表明，微生物可合成黃酮類物質或者改善合成途徑[21]。Cao Hui等[22]指出動物雙歧桿菌可以改變綠茶多酚中黃酮類化合物，說明某些微生物生物轉化能夠產生黃酮類物質。

圖1 降酸發酵過程中紅樹莓果汁中活性成分變化Fig.1 Variation of bioactive components in red raspberry juice during fermentation

由圖1C可知，處理組和對照組花色苷含量均呈逐漸下降趨勢，5 d后含量均無顯著變化（P＞0.05）。發酵8 d，處理組質量濃度為21.92 mg/L，對照組為22.54 mg/L，分別為初始質量濃度的72.51%和74.59%。處理組與對照組對比可知，含量下降程度相似，因此認為降酸發酵對花色苷影響小，主要是環境因素導致花色苷損失。Turker等[23]研究發現，25 ℃貯藏90 d的胡蘿卜中花色苷隨著時間的延長，單體花色苷含量和色度降低，花色苷降解后生成聚合物進而導致褐變。本實驗降酸發酵溫度為28 ℃，此溫度下放置可能導致花色苷受溫度影響含量降低。

2.2 HPLC分析

標準品和0 d紅樹莓果汁的HPLC如圖2所示。在45 min內，各種活性成分能得到較好分離，從紅樹莓果汁中共檢測出18 種活性成分，通過色譜峰與標準品保留時間的對照，確定圖2中的1～18峰分別為熊果苷、沒食子酸、隱綠原酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、對香豆酸、樹莓酮、芥子酸、金絲桃苷、蘆丁、鞣花酸、槲皮素、木犀草素和黃芩素。可以分類為10 種酚酸（峰2、3、4、5、6、7、9、10、12、15）[24]、7 種類黃酮（峰1、8、13、14、16、17、18）和芳香類化合物樹莓酮（峰11）。王錕等[25]從樹莓酒中測出21 種多酚類物質，其中包括蘆丁、對羥基苯甲酸、綠原酸、鞣花酸、槲皮素、沒食子酸、咖啡酸、對香豆酸和芥子酸。孫僑冶[26]利用超高效液相色譜-串聯質譜技術檢測從“秋福”紅樹莓果實中共鑒定出5 種非花色苷酚類物質，分別為咖啡酸、兒茶素、香草酸、鞣花酸和槲皮素。Lugasi等[2]通過反相HPLC對紅樹莓中黃酮類物質進行定量，檢測到鞣花酸和槲皮素，未檢測到木犀草素。本研究測定結果基本涵蓋了上述種類。

表1 紅樹莓果汁降酸發酵過程中活性成分的組成和含量Table 1 Contents of bioactive components in red raspberry juice during fermentation

由表1可知，在紅樹莓果汁降酸發酵過程中，活性成分呈現幾種不同的變化趨勢，且與總酚和總黃酮含量變化相似。其中熊果苷、沒食子酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸和鞣花酸含量顯著降低（P＜0.05）；隱綠原酸、對香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素含量顯著升高（P＜0.05）；芥子酸含量先升高后降低；金絲桃苷、木犀草素、黃芩素無顯著性變化（P＞0.05）。作為對照的果汁在靜置過程中，熊果苷、沒食子酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、丁香酸和鞣花酸的含量顯著降低（P＜0.05）；對香豆酸、蘆丁和槲皮素含量顯著升高（P＜0.05）；芥子酸含量先降低再升高后穩定，樹莓酮含量略微下降后保持在相對穩定水平；隱綠原酸、表兒茶素和金絲桃苷含量變化無顯著性（P＞0.05）；木犀草素和黃芩素含量呈波動變化且無顯著性差異（P＞0.05），未檢出槲皮素。

圖2 標準品混合液（a、b）和紅樹莓果汁中活性成分（c）的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances (a, b)and bioactive components in red raspberry juice (c)

第8天處理組和對照組中，顯著下降（P＜0.05）的成分含量保留率分別為：熊果苷為95.12%和90.00%、沒食子酸為87.63%和84.83%、對羥基苯甲酸為67.15%和76.57%、綠原酸為86.60%和89.44%、新綠原酸為88.56%和69.81%、咖啡酸為80.61%和67.34%、丁香酸為83.16%和89.12%、鞣花酸為94.08%和97.20%，說明環境因素是導致這些成分下降的主要原因。對羥基苯甲酸、綠原酸、丁香酸和鞣花酸保留率比對照略低，說明這些成分也受到降酸發酵的影響。原因可能是總酸含量的下降會對酚類化合物的穩定性造成影響，導致部分酚類化合物含量降低，其次可能是因酵母生長代謝被消耗或轉化為其他化合物。有研究表明，沒食子酸和對羥基苯甲酸經過發酵后含量會減少[27]；綠原酸是多酚氧化酶在有氧條件下的主要底物，綠原酸的減少可能是由于在多酚氧化酶存在下的酸降解[28]；Clark等[29]研究發現白葡萄酒中的黃烷醇型酚類化合物例如表兒茶素會發生氧化反應，隨后發生聚合反應；芥子酸是常見的肉桂酸型酚酸[30]，羥基肉桂酸易與其他物質形成酯的形式存在[31]；鞣花酸常以不同形式存在，如鞣花鞣質、鞣花酸糖苷等，很少是游離鞣花酸[32]，有些酵母產生的次級代謝產物與鞣花酸結合產生沉淀[33]，導致其含量降低。還有部分成分含量有所提升，蘆丁和隱綠原酸含量明顯增加；槲皮素含量升高推測是由其他物質如肉桂酸和柚皮苷等經過生化代謝途徑轉化而來[34]，部分蘆丁發生降解，槲皮素含量也會增加[35]；姜燕等[4]探討樹莓酒在主發酵期間樹莓酮含量的變化，采用HPLC測定樹莓酮含量有所提高，說明微生物發酵可以提高樹莓酮的含量。樹莓酮是具有典型樹莓風味特征的關鍵風味成分[36]，其含量的提高對果汁整體風味有積極作用。

表2 相關性分析Table 2 Correlation analysis

2.3 降酸發酵中紅樹莓果汁活性成分的PCA

2.3.1 適用性分析

PCA將原來眾多具有一定相關性的指標進行簡化，重新組合成一組新的互相無關的綜合指標代替原來的指標[37]，以解決多重相關性問題的目的。相關性分析能夠反映各活性成分間密切程度，活性成分相關系數矩陣直觀檢驗結果如表2所示，除金絲桃苷外，其他酚酸物質、類黃酮物質和樹莓酮的含量之間存在普遍顯著正相關或負相關關系，多數成分之間的相關系數絕對值大于0.5[15]，表明活性成分含量之間有較強相關性，可以通過PCA方法研究紅樹莓果汁中活性成分與降酸發酵的關系。

2.3.2 PCA

根據表1顯示的活性成分質量濃度，用于PCA。由表3可知，提取出的3 個PC的累計方差貢獻率為93.098%＞80%，即可解釋原變量93.098%的信息且基本反映了所有原變量的信息。以這3 個PC作為數據分析的有效成分，生成的PC載荷矩陣，其絕對值越大，對該PC影響越主要[38]。PC1的特征值為13.749，貢獻率為76.382%，代表了全部信息的76.382%，主要反映了熊果苷、沒食子酸、隱綠原酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、對香豆酸、樹莓酮、芥子酸、蘆丁、鞣花酸、槲皮素的含量，PC1與熊果苷、沒食子酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、芥子酸和鞣花酸高度正相關，與隱綠原酸、對香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素高度負相關，對PC1貢獻最大的為對羥基苯甲酸和表兒茶素，載荷量分別為0.988和0.980，對PC1貢獻最小的是樹莓酮，載荷量為-0.973（表4）；PC2的特征值為1.715，貢獻率為9.528%，主要代表金絲桃苷和木犀草素的含量；PC3特征值為1.294，貢獻率為7.188%。

表3 PC特征值及解釋的總方差Table 3 Eigenvalues and total variance explained in principal components analysis

表4 PC載荷矩陣和特征向量Table 4 PC loading matrix with eigenvectors

PC的特征向量如表4所示。可利用F1、F2和F3這3 個新的綜合指標替代原來的18 個指標對紅樹莓果汁中活性成分進行分析。PC1的特征向量分別乘以18 個原始變量標準化之后的變量即為PC1的函數表達式，同理可以得出PC2、PC3的函數表達式，計算整理得到的3 個PC的函數表達式分別如下（其中Z熊果苷～Z黃芩素為標準化變量）：

圖3 降酸發酵過程中活性成分散點圖Fig.3 Scatter plots of principal components 1 versus 2 for bioactive ingredients in red raspberry juice during fermentation

圖4 PCA得分圖Fig.4 Score plot of principal component analysis

保留前2 個PC簡化結果，紅樹莓果汁在降酸過程中活性成分的PC1和PC2相關散點圖和PCA得分圖如圖3、4所示，其中發酵2 d和3 d的紅樹莓果汁分布在PC1和PC2的正向區間，熊果苷、沒食子酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、芥子酸、鞣花酸和黃芩素在PC1和PC2上呈正向分布，即這些活性成分和發酵2 d和3 d的紅樹莓果汁均與PC1、PC2呈正相關；發酵5 d和8 d的紅樹莓果汁分布在第2象限，說明其與PC1呈負相關，與PC2呈正相關，隱綠原酸、對香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素在PC1為負向分布，即于坐標軸原點遠端發酵8 d的紅樹莓果汁中，這些成分較為豐富；發酵6 d和7 d的紅樹莓果汁和隱綠原酸、對香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素均分布在PC1和PC2的負向區間，均與PC1、PC2呈負相關，即于坐標軸原點遠端發酵7 d的紅樹莓果汁中，這些成分較為豐富；發酵0、1 d和4 d的紅樹莓果汁處于第4象限，與PC1呈正相關，與PC2呈負相關，熊果苷、沒食子酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、芥子酸、鞣花酸和黃芩素在PC1上呈正向分布，即于坐標軸原點遠端發酵0 d和1 d的紅樹莓果汁中，這些成分含量較多，而隱綠原酸、對香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素含量較低。由于PC1能夠代表絕大多數的活性成分的信息，對得分的影響最大，可以選擇處于PC1正向區間的發酵時間，即降酸發酵1～4 d，能夠保證絕大多數成分的保留。

3 結論與討論

陸生伊薩酵母WJL-G4在降酸發酵過程中，紅樹莓果汁總酚和花色苷含量呈現逐漸下降趨勢，與對照果汁趨勢相似，總黃酮含量明顯增加。采用HPLC測定降酸過程和對照的果汁中活性成分，共鑒定出10 種酚酸、7 種類黃酮、1 種芳香類化合物。顯著下降（P＜0.05）的成分中，熊果苷、沒食子酸、新綠原酸和咖啡酸完全受環境因素影響；對羥基苯甲酸、綠原酸、丁香酸和鞣花酸主要受環境因素影響，其次受降酸發酵影響；表兒茶素主要受降酸發酵影響。處理組中，隱綠原酸、對香豆酸、樹莓酮、蘆丁和槲皮素含量增加；芥子酸含量呈現先升高后降低的趨勢；金絲桃苷、木犀草素、黃芩素含量基本保持穩定。黃鷺強[39]將具有降解蘋果酸能力的重組酵母菌投放于枇杷原酒進行降酸發酵，24 ℃條件下發酵5 d，降酸量達1.80 g/L，降酸處理后2 種枇杷酒總黃酮質量濃度略微下降，分別由0.87 mg/L下降為0.81 mg/L，0.91 mg/L下降為0.84 mg/L；孫慧燁[40]利用植物乳桿菌降解蘋果酒中蘋果酸，降酸率達到31.5%，總酚質量濃度由1 217.865 mg/L下降為1 138.090 mg/L，均說明降酸發酵對活性成分略有影響。

對紅樹莓果汁中18 種活性成分進行PCA，提取的3 個PC反映原變量93.098%的信息，通過PC1和PC2的載荷分布圖和得分圖得出，隨著發酵進行，PC1（76.382%）得分逐漸下降，總體得分也呈逐漸下降趨勢，降酸發酵1～4 d分布于PC1的正向區間，得分較高。說明隨著菌株發酵時間越長，紅樹莓果汁活性成分的變化也越大，可以選擇在1～4 d范圍內結束降酸，保證活性成分含量的較高水平。通過PCA能為降酸發酵前后果汁中活性成分含量變化提供一定參考依據，在后續研究中可以加入感官評價和香氣物質等指標更全面地描述降酸發酵對果汁品質的影響，上述問題將在后續研究中繼續探討。