機械化醬香型輪次基酒風味結構及特征酯類化合物解析

何東梅，馬 宇 ，黃永光,*，尤小龍，程平言，胡 峰

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州 習水 564622）

醬香型白酒是中國四大基本香型白酒之一[1]，其具有醬香突出，幽雅細膩，酒體醇厚，回味悠長，空杯留香的獨特酒體風格，贏得了國內外消費者的喜愛[2]。目前，醬香型白酒正處于快速發展階段，其市場占比逐年上升[3]，將為釀酒行業經濟發展作出更大的貢獻。

風味是酒類產品質量的重要評價指標，亦是消費者對產品選擇的主要影響因素，我國白酒風味物質研究始于1964年茅臺酒的第2次試點[4]。近年，風味化學技術在清、濃、醬、芝麻等香型白酒風味物質研究中得到廣泛應用，并形成了系統的酒體風味分析研究技術體系[5]，其中，通過分析香氣物質在白酒中的濃度與該香氣物質的閾值濃度的比值，香氣活性值（odor activity values，OAV）判斷香氣物質對酒體的風味貢獻，即OAV越大，說明該香氣化合物越重要[6]，從而篩選出重要的風味化合物，結合該化合物的氣味描述，即可得出該化合物對酒體所貢獻的具體風味。到目前為止，醬香型白酒的主體香氣成分還未獲得定論，其風味機制一直受到科研工作者的深切關注。如Yan Yan等[7]建立基于頂空固相微萃取結合二維氣相色譜-飛行時間質譜的分析方法，在醬香型白酒及其輪次基酒中定性定量出19 種揮發性硫化合物，報道了甲基糠基二硫醚等7 種對輪次酒有重要香氣貢獻的揮發性硫化物；Zhao Tengfei等[8]在醬香型白酒中發現一種后鼻嗅糊味化合物，為研究醬香型白酒主體香氣成分提供了新導向。

機械化釀造是傳統白酒轉型升級發展的必然，相比傳統釀造具有可控性強，產品質量更穩定、更節約資源、生產效率高等優勢。醬香型白酒將不斷由傳統生產模式向機械化、自動化生產發展，針對醬香型白酒機械化釀造的研究也隨之展開，如郭敏[9]利用高通量測序系統對貴州XJ公司機械化和傳統醬香大曲制曲過程的微生物菌群結構多樣性及其重要微生物變化規律進行了研究，發現傳統和機械化制曲在微生物層面，特別是主要菌群結構方面沒有明顯差異；席德州[10]利用高通量測序結合可培養方法，系統研究醬香型白酒機械化釀造過程的微生物群落結構，發現機械化釀造與傳統釀造的主要細菌屬和真菌屬在豐度上存在較大的相似性；王歡等[11]對醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發酵細菌菌群結構進行了多樣性分析，結果表明各輪次的釀酒微生物穩定性較好，釀造過程存在固有的特征性菌群結構。前述的大量研究工作對于認識醬香型白酒作出了重要貢獻，為明晰醬香白酒中主要風味成分及其風味機制具有積極意義，為推動醬香型白酒科學釀造、健康發展作出了重要貢獻。優質的基酒是高品質產品的必要條件，現有大部分研究工作均是圍繞醬香成品酒展開的，其輪次基酒的系統化研究屈指可數，且目前暫無對醬香型機械化釀造輪次基酒風味結構特征及其風味機制的相關報道。

為了充分認識機械化醬香型白酒輪次基酒的風味結構特征，本研究以貴州XJ公司機械化釀造醬香型白酒輪次基酒為研究對象，應用風味組學技術對其進行系統解析，揭示輪次基酒的風味結構及其特征酯類化合物。旨在為推進機械化釀造醬香型白酒發展提供基礎理論和學科依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴州XJ公司機械化生產車間2017年四車間生產的3 個平行窖池產出的輪次基酒綜合樣，每個輪次酒樣1 000 mL，分別為1輪次（J1，乙醇體積分數60.90%）、2輪次（J2，乙醇體積分數57.10%）、3輪次（J3，乙醇體積分數55.35%）、4輪次（J4，乙醇體積分數55.15%）、5輪次（J5，乙醇體積分數55.00%）、6輪次（J6，乙醇體積分數54.35%）、7輪次（J7，乙醇體積分數54.05%）。

無水乙醇、2-辛醇（均為色譜純），正構烷烴混合標準品（C7～C40） 美國Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、十二烷酸乙酯、十四烷酸乙酯、十五烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、2-丁醇、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、2,3-丁二醇、丙二醇、1-己醇、1-辛醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、苯甲醛、苯乙醇、糠醛、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、乙醛、乙縮醛、乙偶姻、苯酚、4-乙基苯酚、對甲酚（均為色譜純），無水乙醚、氯化鈉、無水硫酸鈉、濃硫酸、碳酸氫鈉（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GC 7890-5975 MSD GC-MS聯用儀、DB-FFAP毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；MPS2型多功能自動進樣系統 德國Gerstel公司；超聲波清洗儀 上海超聲儀器廠；Aquaplore3S超純水系統 美國艾科浦公司；OA-SYS型氮吹儀上海安譜科學儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 液液萃取

參考Fan Wenlai等[12]的方法，用超純水將150 mL酒樣稀釋至乙醇體積分數為13%，加100 μL內標（2-辛醇，終質量濃度1.065 mg/L），搖勻后加入氯化鈉飽和（氯化鈉的質量分數約為30%）。用1∶4鹽酸溶液調pH值至2，用60 mL乙醚分3 次萃取，靜置分層后合并有機相得到酸性組分。水相用10%氫氧化鈉溶液調pH值至12，用60 mL乙醚分3 次萃取，靜置分層后合并有機相得堿性組分。調余下水相pH值至7，用60 mL乙醚分3 次提取，合并萃取液得到中性組分。分別添加過量無水硫酸鈉至3 個組分中，并置于-20 ℃過夜干燥，氮吹濃縮至1.5 mL，最終進樣量為1.0 μL，待下一步檢測分析。平行實驗3 次。

1.3.2 風味化合物定性定量

1.3.2.1 檢測條件

氣相色譜條件：DB-FFAP毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；氦氣作為載氣（流速2.0 mL/min）；程序升溫：色譜柱初溫40 ℃，維持2 min，以2 ℃/min升溫到100 ℃，再以4 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。

質譜條件：電子電離源：離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z35～350。

1.3.2.2 定性分析

利用NIST 11a. L譜庫檢索并結合保留指數（retention index，RI）對未知化合物定性，其中RI的計算方法參照改進后的Kovats方法[13]計算。

1.3.2.3 定量分析

有標樣的化合物用外標法定量，無標樣的化合物采用內標法定量。

標準曲線法定量：以體積分數10%乙醇溶液為溶劑配制具有一定濃度的待測物標準液，并進行梯度稀釋。分析條件與酒樣的分析條件相同。采用選擇離子法計算各化合物的峰面積，以化合物與內標物的峰面積比為橫坐標，質量濃度之比為縱坐標，建立標準曲線。將色譜峰信噪比大于3的質量濃度確定為檢出限，信噪比大于10確定為定量限，進行全定量分析。

內標法定量：通過計算內標物的峰面積和樣品中各組分的峰面積比值，從而定量出各個風味成分的含量，每組樣品測定3 次取平均值。

1.3.2.4 關鍵香氣活性物質分析

參考文獻[14]計算香氣化合物的OAV，即風味化合物在樣品中的濃度與該化合物的嗅覺閾值之比。一般認為，OAV＞1，表明該物質對總體香氣有直接貢獻；OAV＜1，表明該物質對總體香氣無實質性貢獻，通常情況下，OAV越大則說明該物質對總體香氣的貢獻越大。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010對數據進行計算，R語言、TBtools、Origin繪制相關圖形。

2 結果與分析

2.1 輪次基酒揮發性風味化合物結構特征

根據前述方法對樣品酒中風味化合物進行提取、分離，經對圖譜進行解析匯總，在機械化釀造醬香酒1～7 個輪次基酒中共定性定量檢測出乳酸乙酯、糠醛、異戊醇等266 種化合物，其中酯類92 種，醇類51 種，酸類36 種，醛酮類28 種，含氮化合物類（主要是吡嗪類）22 種，芳香族類12 種，烴類12 種，呋喃類3 種，醚類5 種，其他類（主要是糖類）5 種。將檢出各類化合物種類數及含量作堆疊柱形圖，如圖1所示。

如圖1所示，2、4、5輪次所含風味化合物的種類最多，1、3輪次較多，6、7輪次相比之下所含種類較少。除7輪次外，各輪次均是酯類化合物的種類最多，占據主導性地位。機械化釀造醬香輪次基酒風味化合物的結構總體上以酯類、醇類、酸類為主，與傳統生產方式一致[15]。1、2輪次中酯類含量占比最大（J1：50.08%，J2：48.42%），醇類（J1：19.31%，J2：24.42%）和酸類（J1：17.69%，J2：18.51%）為其次，相差不大；3、4、5輪次中酯類含量占比（J3：42.09%，J4：37.32%，J5：35.94%）仍為最大，醇類（J3：31.33%，J4：36.12%，J5：36.50%）為其次，酸類（J3：16.18%，J4：18.37%，J5：21.17%）第三；6、7輪次中酯類（J6：15.73%，J7：25.70%）、醇類（J6：31.21%，J7：56.05%）、酸類（J6：42.53%，J7：0.63%）含量占比均相差很大。從圖1還可看出，1～7輪次基酒檢出的主要揮發性風味化合物結構存在明顯差異，風味化合物的種類及含量呈先上升后下降再上升再下降的趨勢。王曉欣[15]在分析醬香白酒傳統釀造輪次酒中風味物質時，風味化合物總量最高的輪次是1輪次，而在機械化釀造輪次基酒中，主要風味化合物的種類及含量最多的是2輪次，輪次酒中風味物質主要來源于原料及釀造過程中微生物的代謝，這表明傳統釀造和機械化釀造之間，原料的糖化及微生物的代謝活動上存在一定的差異。劉民萬等[16]用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜對醬香型白酒傳統釀造不同輪次堆積酒醅進行分析，發現3、4、5輪次堆積酒醅中醇、酸、酯達到相對平衡，與最終蒸餾所得醬香型白酒品質有一定關聯，3、4、5輪次酒稱為“大回酒”，酒質最好，占總產量的55%以上[17]；在本研究中，3、4、5輪次基酒中酯、醇、酸結構相對平衡，酒中風味物質主要來源于發酵酒醅的蒸餾，說明傳統與機械釀造酒中各類微量化合物的相對配比具有相似性。

圖1 1～7輪次基酒主要風味結構圖Fig.1 Flavor composition of base liquors from the first to seventh fermentation round

為了繼續探究輪次基酒間主要風味化合物結構的相似及差異，利用Upset Plot將1～7輪次中風味物質的重疊情況進行可視化，如圖2所示。由圖2可知，在檢出的266 種主要風味化合物中，1～7輪次間共同存在丙醇、異丁醇等30 種化合物，其中醇類有11 種，酯類7 種，酸1 種，醛酮類2 種，含氮類5 種，呋喃類2 種，醚類及酚類各1 種。將這類在1～7輪次中共同存在的物質稱為輪次酒的“骨架成分”，將僅在某1輪次存在的物質稱為該輪次的“特征性成分”。1～7輪次間明顯不同的風味特征由其“骨架成分”及各輪次所特有的“特征性成分”構成，不同輪次中“骨架成分”的質量濃度配比不同，“特征性成分”也不同。在本研究中，J2中的“特征性成分”最多，有43 種，其余輪次有8～10 種。呂佳慧等[18]采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜技術發現相比粳高粱，糯高粱水解后香氣化合物總量更高，含量差異較大的是醛酮類，糯高粱比粳高粱高6.21%，而醬香型白酒的生產原料正是糯高粱，在2輪次酒的發酵過程中，糧谷中的糖類、蛋白類等微生物可利用的基質十分豐富，由此，產出的風味物質種類及含量最高，其中醛酮類也為各輪次中含量最高。僅1、2輪次共同檢出的主要物質有乳酸丁酯、苯酚等9 種，僅3、4、5輪次中共同檢出的主要物質有正辛醇、戊酸乙酯等4 種，僅在1～5輪次中檢出的主要物質有乳酸異丁酯、DL-白氨酸乙酯等6 種，這些物質是造成1、2輪次基酒中糧香、花果香突出而稍偏清香，3、4、5輪次基酒香氣協調，6、7輪次基酒偏糊偏苦的因素之一。

圖2 機械化醬香型1～7輪次基酒中主要風味物質Venn圖Fig.2 Venn diagram showing unique and shared major flavor substances between mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

綜上可知，醬香白酒的傳統釀造與機械化釀造輪次基酒間風味結構具有較好的相似性；同時，各輪次間的風味結構差異也較明顯，在酯、醇、酸、醛酮4 類風味物質中尤為突出，酯類物質是醬香型輪次基酒風味結構中最重要的風味化合物。基于此，本研究繼續著重對機械化釀造輪次基酒中酯類物質及其風味貢獻進行分析。

2.2 機械化輪次基酒中酯類化合物

中國白酒最大的香氣特征是以“酯香”為主[19]，目前在白酒中已報道的酯類物質有506 種[20]，酯類物質是目前白酒質量鑒定的重要指標。本研究從機械化釀造的醬香型輪次基酒中共檢測出92 種酯類化合物，占所檢出主要揮發性化合物種類的34.59%，各輪次中檢出的主要酯類化合物結構存在較大差異。相比于Fan Wenlai等[21]從14 個傳統醬香型白酒成品酒中定性定量了25 種酯，王曉欣[15]在傳統醬香基酒中定量出28 種酯類來講，本研究定量出的主要酯類化合物較多。目前，認為酯類的形成途徑主要有3 種[22]：一是由相關微生物在酰基輔酶A合成酶和醇乙酰轉移酶的作用下進行生物合成[23]，二是在酒曲酯化酶及脂肪酶的作用下催化醇和酸反應而成[24]，三是通過有機化學反應生成[25]。根據各輪次基酒中檢出的酯類物質含量作氣泡圖（圖3），更能直觀地呈現樣品中酯類化合物含量及不同酯類化合物在1～7輪次基酒中含量的變化規律。

圖3 機械化醬香型1～7輪次基酒中酯類化合物含量氣泡圖Fig.3 Bubble chart of ester contents in mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

在92 種酯類化合物中，1輪次中檢出32 種，共1 447.07 mg/L；2輪次中檢出52 種，共3 062.85 mg/L；3輪次中檢出33 種，共751.42 mg/L；4輪次中檢出39 種，共894.91 mg/L；5輪次中檢出45 種，共1 479.53 mg/L；6輪次中檢出24 種，共308.38 mg/L；7輪次中檢出15 種，共119.19 mg/L。整體變化為1、2輪次先升高后3輪次下降，4、5輪次升高后6、7輪次又下降至最低。由圖3可知，L(-)-乳酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯在1～7輪次中均有檢出，文獻[26]表明，乳酸乙酯、乙酸乙酯是我國白酒的主體酯類，醬香型酒中還有一定量的己酸乙酯；在本研究中，因液液萃取方法對其有較大損失，該3 種酯的檢出量均較低，對該類高濃度化合物，應選擇氣相色譜-火焰離子檢測器對其進行定性定量較為準確。基于前人大量的研究工作以及本研究中前處理方法的局限性，本研究認為該3 種酯類物質是機械化醬香型輪次基酒的主要成分。綜上表明，乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯10 種酯類是輪次酒中的“骨架酯”。楊萍等[27]從傳統酒曲及窖內酒醅中檢出乳酸乙酯、十六酸乙酯（棕櫚酸乙酯）、油酸乙酯等，韓興林等[28]利用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜從傳統釀造醬香白酒堆積發酵過程中檢出乳酸乙酯，黃永光等[29]對傳統堆積發酵過程中酒醅進行分離，并對其中優勢菌株的發酵代謝物檢測分析，結果表明棕櫚酸乙酯等的含量較高，說明棕櫚酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯等化合物在傳統醬香基酒的釀造過程中具有廣泛來源，而在機械化釀造輪次基酒中同樣檢出該類酯類化合物，由此說明醬香白酒傳統及機械化釀造的基酒間具有相似的“骨架酯”，從酯類風味化合物層面表征了機械化釀造與傳統釀造具有較好相似性。

在J1、J2中均存在僅在該輪次含量較高的物質，分別為J1乳酸異戊酯，J2亞麻酸乙酯、甲氧基乙酸3-甲基丁酯。這些酯類化合物可定性為是對應輪次的“酯類標志成分”，有助于快速識別輪次基酒以及為規范生產提供科學依據。

綜上可知，乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯10 種酯類是輪次酒中的“骨架酯”。2 個輪次中存在特征突出的“酯類標志成分”，分別為J1乳酸異戊酯、J2亞麻酸乙酯和甲氧基乙酸3-甲基丁酯。

2.3 機械化輪次基酒特征酯類香氣化合物

為了進一步揭示機械化釀造輪次基酒中酯類化合物對各輪次基酒的風味貢獻，通過將計算所得酯類化合物的OAV作熱力圖，酯類風味物質對輪次基酒的風味貢獻在圖4中得到有效可視化。機械化醬香型輪次基酒中主要酯類物質香氣描述語及其閾值見表1。

圖4 機械化釀造醬香型輪次基酒（J1～J7）中酯類風味化合物OAV熱力圖Fig.4 Heat map of OAV of ester aroma compounds in mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

表1 機械化醬香型輪次基酒中主要酯類物質香氣描述及其閾值Table 1 Aroma descriptors and thresholds of major esters in mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

由圖4可知，己酸乙酯（甜香，水果香，窖香，青瓜香）、苯乙酸乙酯（玫瑰，蜂蜜）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、甜蜜果味）、十六酸乙酯（又稱棕櫚酸乙酯，奶油、果爵香）、油酸乙酯（花香）對輪次基酒的整體風味貢獻最大，其中十六酸乙酯、油酸乙酯、己酸乙酯不僅在含量上是1～7輪次的“骨架酯”，在香氣貢獻層面上也是。苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯雖然含量不高，但是對整體風味具有明顯貢獻，因此從風味貢獻層面斷定此3 種酯類物質是輪次基酒中的“骨架酯”。酒體中含量最高的醇類是乙醇，由乙醇和其他酸類酯化后產生大量的乙酯類風味化合物。如高級脂肪酸乙酯，可以豐富酒體，延長酒的后味[33]；如L(-)-乳酸乙酯、硬脂酸乙酯，雖對酒體無明顯風味貢獻，但缺一不可。9,12-十八碳二烯酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯均未查到相關閾值報道，其具體風味貢獻還需進一步研究，月桂酸乙酯（花香、果香）、十四酸乙酯（甜香、鳶尾油香）在1、2輪次OAV高于3～7輪次，證實了生產實踐經驗中醬香型白酒的1、2輪次基酒醬香不突出，糧香、甜香、蜜香、果香及花香較突出。3-苯丙酸乙酯苯丙酸乙酯（蜜菠蘿香，蜂蜜香，花香）在1輪次中具有突出的香氣貢獻，結合基酒的生產實踐，1輪次中蜜香十分典型，在此便給予了證實。王曉欣[15]在傳統醬香型輪次酒中檢出辛酸乙酯且對香氣有重要貢獻，在本研究中，戊酸乙酯（水蜜桃香，水果香，花香，甜香）、乙酸戊酯（甜香、果味香、熟梨香）、辛酸乙酯（白蘭地酒香、甜香，花香）對3、4、5輪次的香氣貢獻突出，且在其余輪次中無香氣貢獻，由此判定該3 種化合物為3、4、5輪次中香氣協調的關鍵酯類成分。僅有少數酯類物質在6、7輪次中具有香氣貢獻，且貢獻程度均較弱，酯香微弱，從而導致風味結構不夠協調，焦糊香突出。

3 結 論

醬香型白酒機械化釀造將是大勢所趨，應用液液萃取結合氣相色譜-質譜技術對風味化合物進行分離、檢測。結果表明，機械化釀造與傳統釀造輪次基酒間具有相似的風味結構，機械化醬香型輪次基酒間的風味結構具有顯著差異，在酯、醇、酸、醛酮4 類主要風味化合物上的結構差異尤為突出，酯類物質在醬香型輪次基酒的風味結構中占有重要地位。從含量層面表明乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯10 種化合物是輪次基酒中的“骨架酯”；從風味貢獻層面表明己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯5 種酯為醬香型白酒機械化釀造輪次基酒的“骨架酯”。1、2輪次的特征性酯類為3-苯丙酸乙酯、乳酸異戊酯、亞麻酸乙酯、甲氧基乙酸3-甲基丁酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯；3、4、5輪次的特征性酯類為戊酸乙酯、乙酸戊酯、辛酸乙酯；除油酸乙酯和十六酸乙酯外，6、7輪次中無特征性酯類，可將這些特征酯類化合物定性為“輪次基酒酯類標志成分”，為生產規范管理提供科學依據。本研究詳細分析了機械化醬香型輪次基酒的主要揮發性風味結構及其特征酯類化合物，后期將進一步對除酯類外的風味化合物進行研究和分析。另外，在研究過程中發現，目前關于對白酒中風味物質閾值的系統性報道少之甚少，后期將對此進行系統性研究，為白酒風味化學的發展作出積極貢獻。