黃芩苷聯(lián)合二甲雙胍對多囊卵巢綜合征大鼠內分泌、炎癥因子和胰島素抵抗的影響及其機制

謝 磊,劉曉麗,葛 靜,李亞威

（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院婦科，河北 石家莊050031）

在育齡期女性群體中，多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種婦科較常見的內分泌紊亂和代謝異常性疾病，近年來PCOS患病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，嚴重影響育齡期女性的身心狀態(tài)和生活質量［1-2］。二甲雙胍是一種臨床應用較為廣泛的降糖類藥物，常用于治療并發(fā)糖耐量減低、代謝綜合征或單純運動方式調整無效的PCOS患者，具有一定療效［3］。黃岑苷（baicalin，BAL）是一種傳統(tǒng)中藥，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、減輕胰島素抵抗和抗血脂異常等作用［4-7］。研究［8-11］表明：磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphoester inositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號通路在炎性反應、腫瘤和內分泌疾病（如PCOS胰島素抵抗）的發(fā)生發(fā)展中起重要的調控作用。研究者［12-13］發(fā)現(xiàn)：小檗堿或六味地黃丸等藥物可上調PI3K/AKT信號通路表達，進而起到改善PCOS大鼠病理和胰島素抵抗的作用。然而關于BAL聯(lián)合二甲雙胍對PCOS大鼠PI3K/AKT信號通路的影響情況尚未見報道。本研究探討B(tài)AL聯(lián)合二甲雙胍上調PI3K/AKT信號通路對多囊卵巢綜合征大鼠內分泌、炎癥因子和胰島素抵抗的影響，并闡明其相關的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取健康雌性Wistar大鼠40只，鼠齡80～90 d，體質量210～250 g，購于上海斯萊克公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：健康清潔級，采用標準大鼠顆粒飼料進行喂養(yǎng)，室溫（23±1）℃，濕度（57±5）%，12 h光照和12 h黑暗周期交替進行，通風狀態(tài)良好，適應性喂養(yǎng)1周。本實驗已獲得本院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA，武漢華美科技集團有限公司），BAL（西安賽德有機科技有限責任公司），鹽酸二甲雙胍緩釋片（浙江華海藥業(yè)股份有限公司），大鼠ELISA試劑盒（基爾頓生物科技有限公司），BCA試劑盒（上海瑞楚生物科技有限公司）；磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷 酸 化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）、PI3K、AKT和GAPDH抗體（美國Santa Cruz公司）。光學顯微鏡（邁特光學儀器有限公司），酶標儀（上海沃元科技有限公司），臺式微量超高速離心機（美國Thermo公司），分析電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 PCOS動物模型的制備PCOS大鼠模型制備［14］：取36只Wistar大鼠，將DHEA根據(jù)大鼠的體質量按照0.6 g·kg－1進行配制（采用注射油劑將其稀釋為0.2 mL），在大鼠頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)注射20 d，光學顯微鏡下觀察大鼠1個動情周期的陰道涂片，當出現(xiàn)陰道上皮持續(xù)角化、失去完整的動情周期，表示造模成功。經鑒定有30只Wistar大鼠造模成功，另選取8只健康的Wistar大鼠作為正常對照組，正常對照組大鼠皮下只注射0.2 mL·d－1油劑，其他步驟與造模成功的大鼠一致。

1.4 實驗分組和處理將大鼠分為對照組、模型組（給予DHEA）、二甲雙胍組（給予DMBG）和聯(lián)合組（給予BAL+DMBG），每組8只。BAL+DMBG組大鼠給予50 mg·kg－1BAL聯(lián)合270 mg·kg－1鹽酸二甲雙胍緩釋片灌胃，每日1次；DMBG組大鼠僅給予270 mg·kg－1鹽酸二甲雙胍緩釋片灌胃，每日1次；DHEA組和對照組大鼠給予等量溶媒灌胃，每日1次；各組大鼠連續(xù)灌胃4周。

1.5 ELISA法檢測各組大鼠血清因子水平各組大鼠最后一次灌胃結束2 h后，采用10%水合氯醛對大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，ELISA法檢測各組大鼠血清內分泌指標水平及炎癥因子水平，采用放射免疫法測定血清中胰島素抵抗相關指標。其中內分泌指標包括黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、睪酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2）；炎癥因子包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、C反 應 蛋 白（C-reactive protein，CRP）、白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）及白細胞介素 18（interleukin-18，IL-18）；所有大鼠禁食12 h，胰島素抵抗相關指標包括空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）和空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistanceindex，HOMA-IR）。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6 HE染色觀察各組大鼠子宮內膜情況切除各組大鼠子宮，并剔除子宮周圍組織，置于10%甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，采用HE染色于光鏡下觀察各組大鼠子宮內膜情況，并采用Leica qwin plus圖像處理軟件計算各組大鼠子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度。

1.7 Western blotting法檢測各組大鼠卵巢組織中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達量各組血清因子檢測完成后，首先采用10%水合氯醛麻醉大鼠，麻醉后大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下行開腹手術，摘取雙側卵巢，并除去卵巢周圍多余的脂肪結締組織，對卵巢組織中總蛋白進行提取及定量（定量試劑盒采用BCA試劑盒），行SDS-PAGE后，PVDF轉膜，封閉1 h，加入一抗：p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）和AKT（1∶1 000），4℃過夜。漂洗，再加入0.2 mg·L－1山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜，顯影曝光成像，以GAPDH作為內參。采用Image J軟件分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0和Graph Pad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠血清FSH、E2、LH和T水平，血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平，F(xiàn)INS和FBG水平，HOMAIR，子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清FSH、E2、LH和T水平與對照組比較，DHEA組大鼠血清FSH和E2水平降低（P＜0.05），LH和T水平明顯升高（P＜0.05）；與DHEA組比較，BAL+DMBG組及DMBG組大鼠血清FSH和E2水平明顯升高（P＜0.05），LH和T水平明顯降低（P＜0.05）；與DMBG組比較，BAL+DMBG組大鼠血清FSH和E2水平明顯升高（P＜0.05），LH和T水平明顯降低（P＜0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠血清中FSH、E2、LH和T水平Tab.1 Levels of serum FSH，E2，LH,and T of rats in various groups （n=8，±s）

表1 各組大鼠血清中FSH、E2、LH和T水平Tab.1 Levels of serum FSH，E2，LH,and T of rats in various groups （n=8，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with DHEA group；#P＜0.05 compared with DMBG group.

Group Control DHEA DMBG BAL+DMBG FSH[λB/(U·L－1)]7.66±1.05 2.85±0.63*5.10±0.78△6.43±0.95△#E2[c B/(pmol·L－1)]46.90±5.63 21.29±3.02*33.71±2.10△39.30±2.14△#LH[λB/(U·L－1)]2.65±0.36 8.14±0.82*5.45±1.56△3.47±0.42△#T[c B/(mmol·L－1)]1.78±0.25 5.74±0.67*3.79±0.31△2.68±0.32△#

2.2 各組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平與對照組比較，DHEA組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6及IL-18水平明顯升高（P＜0.05）；與DHEA組比較，BAL+DMBG組和DMBG組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平明顯降低（P＜0.05）；與DMBG組比較，BAL+DMBG組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平T ab.2 Levels of serum T NF-α,CRP,IL-6,and IL-18 of rats in various groups （n=8，±s）

表2 各組大鼠血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平T ab.2 Levels of serum T NF-α,CRP,IL-6,and IL-18 of rats in various groups （n=8，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with DHEA group；#P＜0.05 compared with DMBG group.

Group Control DHEA DMBG BAL+DMBG TNF-α[ρB/(ng·L－1)]85.36±10.24 177.78±20.60*139.53±15.58△101.71±12.43△#CRP[ρB/(mg·L－1)]7.20±2.05 15.67±3.63*12.34±3.11△9.78±2.36△#IL-6[ρB/(ng·L－1)]51.75±6.33 99.63±14.85*81.72±11.64△66.50±8.69△#IL-18[ρB/(μg·L－1)]112.70±14.38 197.29±23.69*166.07±18.27△135.90±15.46△#

2.3 各組大鼠FBG和FINS水平及HOMA-IR與對照組比較，DHEA組大鼠FPG和FINS水平及HOMA-IR明顯升高（P＜0.05）；與DHEA組比較，BAL+DMBG組和DMBG組大鼠FBG和FINS水平及HOMA-IR明顯降低（P＜0.05）；與DMBG組比較，BAL+DMBG組大鼠FBG和FINS水平及HOMA-IR明顯降低（P＜0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠子宮內膜情況與對照組比較，DHEA組大鼠子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度明顯減小（P＜0.05）；與DHEA組比較，BAL+DMBG組和DMBG組大鼠子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度明顯增加（P＜0.05）；與DMBG組比較，BAL+DMBG組大鼠子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度明顯增加（P＜0.05）。見表4和圖1。

2.5 各組大鼠卵巢組織中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達量與對照組比較，DHEA組大鼠卵巢組織中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達量降低；與DHEA組比較，BAL+DMBG組和DMBG組大鼠卵巢組織中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達量升高；與DMBG組比較，BAL+DMBG組大鼠卵巢組織中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達量升高。見圖2。

圖1 電鏡觀察各組大鼠子宮內膜組織形態(tài)表現(xiàn)（HE,×100）Fig.1 Morphology tissue tissue of endometrium tissue of rats in various groups observed under electron microscope(HE,×100)

表3 各組大鼠FPG和FINS水平及HOMA-IRTab.3 FBG and FINS levels and HOMA-IR of rats in various groups （n=8，±s）

表3 各組大鼠FPG和FINS水平及HOMA-IRTab.3 FBG and FINS levels and HOMA-IR of rats in various groups （n=8，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with DHEA group；#P＜0.05 compared with DMBG group.

Group Control DHEA DMBG BAL+DMBG FBG[c B/(mmol·L－1)]5.16±0.37 6.29±0.45*5.77±0.33△5.39±0.31△#FINS[λB/(mIU·L－1)]8.27±0.82 14.62±1.49*11.68±0.94△9.76±0.68△#HOMA-IR 1.90±0.17 4.09±0.51*3.00±0.42△2.34±0.25△#

表4 各組大鼠子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度Tab.4 Area ratios of endometrial space to stroma and endometrium thickness of rats in various groups（n=8，±s）

表4 各組大鼠子宮內膜隙/間質面積比和子宮內膜厚度Tab.4 Area ratios of endometrial space to stroma and endometrium thickness of rats in various groups（n=8，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with DHEA group；#P＜0.05 compared with DMBG group.

Group Control DHEA DMBG BAL+DMBG Area ratio of endometrial space to stroma 0.50±0.19 0.09±0.06*0.21±0.10△0.39±0.16△#Endometrium thickness(l/μm)67.95±5.73 30.18±4.16*41.23±4.78△55.61±5.22△#

圖2 各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT信號通路蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of PI3K/AKT signal pathway proteins in ovarian tissue of rats in various groups

3 討 論

PCOS是較為常見的內分泌疾病，多發(fā)于育齡婦女，其典型的臨床表現(xiàn)為不孕、月經異常、肥胖、卵巢多囊性腫大、多毛、高雄激素血癥、胰島素抵抗、排卵障礙、痤瘡和性激素水平紊亂等［1-2］。臨床上常用二甲雙胍治療PCOS患者，其藥用機制尚未完全清楚，作用靶點主要有降低肝糖輸出、抑制糖異生，增加胰島素分泌指數(shù)，抑制腸壁細胞葡萄糖攝取率等，具有增加排卵率、調整月經周期及減重等作用［15］。BAL屬于中國傳統(tǒng)的中藥材，其主要成分為黃岑，屬于黃酮類化合物，具有抗菌、抗癌、解熱和抑制氧化應激等藥理作用，由于其活性好、無明顯不良反應，已經廣泛應用于醫(yī)藥、保健及化妝品等領域中［16］。研究［17］表明：黃酮類化合物可有效改善排卵障礙和內分泌紊亂及相關因子水平異常表達。

PCOS是一種與內分泌紊亂、炎癥和胰島素抵抗有關的復雜綜合征。關于內分泌失調，有研究［18］顯示：PCOS患者下丘腦-垂體-性腺軸內分泌失調與卵巢類固醇的異常表達和高胰島素血癥等密切相關，抗促性腺素釋放異常造成垂體FSH及LH分泌異常，而LH及FSH是一種由垂體分泌的糖蛋白激素，二者水平異常改變將影響下游相關性激素的釋放，進而抑制卵泡的發(fā)育；有學者［19］進一步證實：PCOS發(fā)生發(fā)展與內分泌失調密切相關，機體LH和FSH異常升高可導致卵巢雄性激素增多，E2下調引發(fā)高雄激素血癥，卵巢被膜纖維化變厚，致使卵巢排卵障礙。本研究結果顯示：BAL聯(lián)合DMBG較DMBG單獨使用上調FSH和E2水平和下調LH和T水平更佳，可有效改善內分泌功能。研究［20］顯示：黃岑苷成分可對PCOS患者內分泌調節(jié)起改善作用，分析其原因可能與BAL對PCOS大鼠慢性低級別炎癥及胰島素抵抗的改善作用有關。

PCOS造成的慢性低級別炎癥有別于感染性疾病或自身免疫疾病造成的炎癥反應，其不表現(xiàn)為局部紅腫或發(fā)熱等明顯體外癥狀，但可分泌炎癥因子，主要表現(xiàn)為血清TNF-α、CRP、IL-6和IL-18等炎性因子水平升高［21-22］。ZHAO等［23］研究顯示：血清中IL-6和CRP等炎性因子水平隨著HOMA-IR升高而升高，炎癥因子表達與胰島素抵抗機制密切相關，但相關性結論尚存爭議。CRP是一種由肝細胞分泌的急性時相反應蛋白，受TNF-α和IL-6的調節(jié)，其作用機制主要與干擾胰島素相關信號通路及影響脂肪代謝等因素有關［22］。IL-18是一種由單核細胞分泌的炎性因子，對TNF-α、CRP和IL-6合成及分泌均具有一定的誘導作用，其參與慢性低度炎癥反應，與胰島素抵抗密切相關［22］。本研究結果顯示：BAL聯(lián)合DMBG較DMBG單獨使用改善PCOS大鼠血清中TNF-α、CRP、IL-6和IL-18水平更佳，進而減輕PCOS大鼠機體的慢性低度炎癥反應，同時對胰島素抵抗減輕具有積極作用，這與ZHAO等［24］研究結果一致，其原因可能與BAL對PI3K/AKT信號通路的激活有關。有研究［25］顯示：PCOS患者PI3K/AKT信號通路的激活可對機體的慢性低度炎癥反應產生調控作用。黃芩苷可通過抑制NF-κB/p38 MAPK信號通路的激活來減輕PCOS大鼠的慢性低度炎癥反應［24］。

有研究［26］顯示：低度炎癥可損傷毛細血管內皮細胞、胰島細胞和卵巢功能，導致多囊改變及激素分泌失衡，且還能進一步誘導胰島素抵抗。本研究結果顯示：BAL聯(lián)合DMBG較DMBG單獨使用可有效減輕PCOS大鼠的胰島素抵抗。分析原因與激活PI3K/AKT信號通路有關。研究［26-27］顯示：PI3K/AKT信號通路在PCOS胰島素抵抗中發(fā)揮了關鍵作用，當出現(xiàn)PCOS胰島素抵抗時，由胰島素/胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）所調節(jié)的絲裂原激活蛋白激酶途徑與PI3K/AKT通路功能會隨之失調。

子宮內膜作為雌激素發(fā)揮作用的靶器官，性激素水平的變化將直接影響子宮內膜增殖情況和胚泡著床，內膜增厚、間質細胞蛻膜化及腺體分泌旺盛，可形成有利的胚泡著床環(huán)境，對患者的受孕情況具有重要影響［28］。研究［29］顯示：PCOS患者子宮內膜常表現(xiàn)為異常狀態(tài)，主要表現(xiàn)為隙/間質面積比和子宮內膜厚度縮小。本研究結果顯示：BAL聯(lián)合DMBG灌胃可有效改善隙/間質面積比和子宮內膜厚度，對PCOS大鼠的受孕概率提升具有促進作用，其原因可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。邵洋等［30］研究顯示：二甲雙胍通過介導PCOS患者子宮內膜中PI3K-AKT-MDm2通路，影響子宮內膜的增殖。本文作者推測：BAL聯(lián)合DMBG可調控PI3K/AKT信號通路蛋白表達，以此影響PCOS大鼠上述機制的變化。本研究檢測各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達情況的結果證實：二者聯(lián)合對PCOS大鼠卵巢組織中PI3K/AKT信號通路蛋白表達具有上調作用，提示BAL可激活PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，BAL聯(lián)合DMBG可通過上調PCOS大鼠卵巢組織中PI3K/AKT信號通路蛋白表達水平，糾正內分泌紊亂，抑制慢性低度炎癥反應，改善胰島素抵抗及子宮內膜情況，對臨床上PCOS患者的靶向治療具有指導意義。