C19ORF12對胃癌MKN45細胞增殖和化療藥敏感性的影響及其機制

楊 穎,趙 偉,呂 丹

（1.北京大學人民醫院輸血科，北京100044；2.中日友好醫院檢驗科，北京100029；3.北京大學醫學部系統生物醫學研究所，北京100191）

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一［1］。胃癌的治療主要包括手術療法、化學療法、靶向療法和免疫療法等［2-3］。腫瘤的化學療法和靶向療法的耐藥性是腫瘤治療的難點［4-5］。最近的研究［6-7］表明：無論是在化學療法中，還是在CD8陽性T淋巴細胞介導的免疫療法中，活性氧 （reactive oxygen species，ROS）介導的細胞毒性發揮了重要的作用，其可以激活腫瘤細胞內在的死亡途徑，從而達到抗腫瘤的作用。研究［8］顯示：藥物誘導的細胞死亡會激發宿主的免疫反應，進而增強腫瘤化學療法的有效性。在腫瘤發生發展的過程中，某些基因的上調或者下調可以導致腫瘤對化療藥物的敏感性改變，進而影響該藥物的抗腫瘤效果［9］。染色質獲得或缺失是基因組不穩定的主要表現形式，常見于多種人類腫瘤［10-11］。19號染色體開放讀碼框12（chromosome19 open reading frame12，C19ORF12）基因位于19號染色體長臂1區2帶（19q12）。19q12擴增子區域包括很多基因，19q12區域這些基因與腫瘤的發生發展密切相關［12-13］。研究［14-16］顯示：在婦科腫瘤中，19q12區域基因的擴增與腫瘤的進展密切相關，為婦科腫瘤的治療提供了新的研究方向。研究［17］顯示：在胃癌組織中可以檢測到19q12區域的擴增。然而19q12區域的基因在胃癌發生發展中的作用及其機制尚不清楚。C19ORF 12基因編碼小分子跨膜蛋白，但是其功能尚不清楚。本研究探討C19ORF12在胃癌發生發展中的作用，闡述C19ORF12對胃癌MKN45細胞增殖和化療藥物敏感性的影響及其可能機制，為胃癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人胃癌MKN 45細胞購于上海中科院細胞庫。DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，細胞培養箱購于美國Thermo公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）、阿霉素和過氧化氫（H2O2）購于美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、線 粒 體紅色熒光探針（MitoTracker Red CMXRos）和Lipofectamine 2000試劑盒購于美國Invitrogen公司。流式細胞儀購于美國BD公司，酶標儀購于美國Bio-Rad公司，激光共聚焦顯微鏡購于日本Nikon公司。

1.2 細胞培養人胃癌MKN 45細胞置于含10%FBS的DMEM培養基中，采用CO2孵箱于37℃和5%CO2條件下培養細胞。待培養瓶中的細胞達到80%以上融合時，采用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化處理，并進行傳代培養。

1.3 細胞轉染和分組選取處于對數生長期的胃癌MKN45細胞，采用0.25%胰蛋白酶進行消化處理后接種于24孔板中。實驗分為對照組和C19ORF12組。待細胞融合至80%左右時，采用Lipofectamine 2000轉染試劑將對照組質粒和C19ORF12-Flag質粒分別轉染至MKN45細胞中。轉染步驟參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行。

1.4 CCK-8法檢測2組胃癌MKN45細胞的增殖活性將對照組細胞和C19ORF12組細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板。將各組細胞分別培養24、48、72和96 h。在每個檢測時間點，每孔加入10μL CCK-8和90μL DMEM培養基，孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度（A）值。設置3個平行孔，取平均值。以A值代表細胞增殖活性。采用GraphPad Prism 6.0軟件繪制各組細胞的增殖曲線。

1.5 克隆形成實驗檢測2組胃癌MKN45細胞克隆形成數將對照組細胞和C19ORF12組細胞以1×103個/孔的密度接種于6孔板。每組設置3個平行孔。培養14 d后，棄去培養基，PBS清洗細胞3次，加入4%多聚甲醛固定30 min，加入結晶紫染液靜置20 min，PBS清洗細胞3次，自然干燥后，置于顯微鏡下拍照并計數每組細胞的克隆形成數。

1.6 CCK-8法檢測2組胃癌MKN45細胞的存活率將對照組細胞和C19ORF12組細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板。待細胞貼壁之后，分別加入不同濃度（1、2、4、8和16 mg·L－1）阿霉素或不同濃度（100、200、400、800和1 600μmol·L－1）H2O2。加藥后37℃培養24 h。隨后每孔加入10μL CCK-8和90μL DMEM培養基，孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm波長處的A值。設置3個平行孔，取平均值，計算細胞存活率。細胞存活率=藥物處理后細胞A值/未加藥細胞A值×100%，未加藥細胞的存活率設定為100%。

1.7 流式細胞術檢測2組胃癌MKN45細胞凋亡率對照組細胞和C19ORF12組細胞貼壁生長于6孔板中，各組細胞培養基中加入16 mg·L－1阿霉素或1 600μmol·L－1H2O2。藥物處理24 h之后，收集細胞于流式管中，采用預冷的PBS洗滌細胞2次，離心棄去上清。每管細胞加入1 mL乙醇固定液，4℃固定過夜。隨后再采用預冷的PBS洗滌細胞2次，離心棄去上清。每管加入500μL PI染液，室溫避光孵育20 min。流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率＝凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.8 激光共聚焦顯微鏡檢測亞細胞定位將泡酸、高壓消毒后的蓋玻片置入6孔板中，胃癌MKN45細胞以2×105/孔的濃度鋪于6孔板中，細胞貼壁24 h后進行細胞轉染，轉染方法同“1.3”步驟。對照組細胞轉染pEGFP-N1質粒，C19ORF12組細胞轉染pEGFP-N1-C19ORF12質粒。轉染24 h后，PBS洗滌細胞，采用4%多聚甲醛固定細胞15 min，洗滌細胞后，每孔加入含0.1%Triton X-100的PBS，孵育3 min。洗滌細胞后，每孔加入MitoTracker Red CMXRos和DAPI，對線粒體和細胞核進行染色。載玻片上滴加1滴封片劑（10%PBS+90%甘油），將6孔板中的蓋玻片取出，細胞面朝下覆蓋于載玻片上。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞并采集圖像。

1.9 生物信息學分析通過檢索癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫，下載胃癌患者的胃組織和正常胃組織的轉錄組數據以及相應的臨床信息文件。通過GEPIA（網址為http：//gepia.cancer-pku.cn/）分 析C19ORF12 mRNA在胃癌和正常胃組織中表達水平的差異。通過KM-plot（網址為http：//www.kmplot.com/）回顧性分析不同表達水平的C19ORF12對胃癌患者預后的影響。

1.10 統計學分析采用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖活性、克隆形成數和細胞凋亡率均以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組胃癌MKN45細胞的增殖活性與對照組比較，C19ORF12組胃癌MKN45細胞的增殖活性明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

2.2 2組胃癌MKN45細胞克隆形成數與對照組比較，C19ORF12組胃癌MKN45細胞克隆形成數明顯增多（P＜0.01）。見圖2。

2.3 阿霉素作用后2組胃癌MKN45細胞存活率4、8和16 mg·L－1阿霉素作用后，與對照組比較，C19ORF12組胃癌MKN45細胞存活率升高（P＜0.01），即C19ORF12能夠降低胃癌MKN45細胞對阿霉素的敏感性，并且隨著阿霉素劑量的增加，這種差異逐漸增大。見圖3。

圖1 2組胃癌MKN45細胞的增殖活性Fig.1 Proliferation activities of gastric cancer MKN 45 cells in two groups

*P＜0.01 compared with control group.圖2 2組胃癌MKN45細胞克隆形成數Fig.2 Colony formation number of gastric cancer MKN45 cells in two groups

圖3 阿霉素作用后2組胃癌MKN45細胞存活率Fig.3 Survival rates of gastric cancer MKN45 cells in two groups after treated with doxorubicin

2.4 H2O 2作用后2組胃癌MKN 45細胞存活率與對照組比較，400、800和1 600μmol·L－1H2O2作用后，C19ORF12組胃癌MKN45細胞存活率升高（P＜0.05）。并且隨著H2O2劑量的增加這種差異逐漸增大。即C19ORF12以劑量依賴的方式抑制了ROS介導的細胞死亡。見圖4。

圖4 H 2O 2作用后2組胃癌MKN45細胞存活率Fig.4 Survival rates of gastric cancer MKN45 cells in two groups after treated with H 2O 2

2.5 2組胃癌MKN 45細胞凋亡率阿霉素或者H2O2作用后，與對照組比較，C19ORF12組胃癌MKN45細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。即C19ORF12可以抑制ROS介導的細胞死亡。見圖5。

圖5 阿霉素或H 2O 2作用后2組胃癌MKN 45細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of gastric cancer MKN 45 cells in two groups after treated with doxorubicin or H 2O2

圖6 C19ORF12在2組胃癌MKN45細胞中的定位Fig.6 Localization of C19ORF12 in gastric cancer MKN 45 cells in two groups

2.6 C19ORF12在胃癌MKN45細胞中的亞細胞定位激光共聚焦顯微鏡結果顯示：C19ORF12主要表達于胃癌MKN45細胞的線粒體中。見圖6。

2.7 胃癌組織和正常胃組織中C19ORF12 m RNA表達水平GEPIA分析結果顯示：與正常胃組織（228例）比較，胃癌組織（410例）中C19ORF1 2 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）。見圖7。

2.8 C19ORF12表達與胃癌預后的關系KM-plot生存分析結果顯示：C19ORF12的差異表達明顯影響胃癌患者的預后。與低表達C19ORF12的胃癌患者比較，高表達C19ORF12的胃癌患者總體生存期明顯縮短（P＜0.01），提示C19ORF12的高表達與胃癌的不良預后相關。見圖8。

圖7 GEPIA分析C19ORF12 mRNA在正常胃組織和胃癌組織中的表達水平Fig.7 Expression level of C19ORF12 mRNA in normal gastric and gastric cancer tissues detected by GEPIA analysis

圖8 KM-plot分析C19ORF12表達與胃癌患者預后的關系Fig.8 Relationship between C19ORF12 expression and prognosis of patients with gastric cancer detected by KM-plot analysis

3 討 論

C19ORF12基因位于19號染色體長臂1區2帶，該基因編碼小分子的跨膜蛋白。C19ORF12基因及其編碼產物在腫瘤中的作用和作用機制并不清楚。本研究明確了C19ORF12是一個癌基因，其在胃癌組織中表達上調。C19ORF12不僅能夠促進胃癌MKN45細胞的增殖，而且能夠降低胃癌MKN 45細胞對化療藥物阿霉素的敏感性，C19ORF12與胃癌患者的不良預后高度相關。C19ORF12可以作為增強腫瘤化療藥物敏感性的潛在靶標。

化療藥物的抗藥性嚴重影響腫瘤的治療效果［18］。因此，闡明化療藥物的耐藥機制對于腫瘤的臨床治療至關重要［4］。作為最廣泛使用的抗腫瘤藥物之一，阿霉素可誘導過量的ROS生成，從而導致腫瘤細胞的凋亡或非凋亡細胞死亡［19-20］。研究［21］顯示：大劑量阿霉素可以誘導線粒體中鐵蓄積，這表明細胞鐵死亡可能與阿霉素誘導的細胞死亡有關。與細胞凋亡不同，細胞鐵死亡可以引起炎癥損傷并增強對腫瘤細胞的免疫攻擊［22］。H2O2可以模擬體內過量ROS產生這一過程，因此，本研究中采用H2O2來模擬誘導ROS介導的細胞死亡。本研究結果顯示：C19ORF12能夠抑制ROS介導的細胞死亡并增強胃癌細胞對阿霉素的抗藥性。

線粒體在能量代謝、細胞凋亡調節和細胞信號傳導等方面發揮重要的作用［23］。腫瘤細胞的線粒體與正常細胞的線粒體在結構和功能上均存在差異。腫瘤細胞中的線粒體能夠產生過量的ROS，ROS通過誘導基因組不穩定性、修飾基因的表達以及參與信號傳導等途徑促進腫瘤的發展［24-26］。當線粒體接收到刺激信號后，線粒體膜的通透性增加，線粒體中的活性分子會進入胞質，通過一系列級聯反應誘導細胞凋亡［27-28］。亞細胞定位結果顯示：C19ORF12主要表達于胃癌MKN45細胞的線粒體中。同時C19ORF12能夠抑制ROS介導的細胞死亡，C19ORF12很有可能在線粒體的功能調控中發揮一定的作用。C19ORF12能夠為腫瘤治療提供新的思路。

綜上所述，本研究明確了C19ORF12在胃癌發生發展中的作用。C19ORF12能夠促進胃癌細胞的增殖，并減弱化療引起的氧化損傷，降低胃癌細胞對化療藥物的敏感性，最終促進胃癌的發展并導致不良預后。