全反式視黃酸對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用及途徑

吳 娟，曾駿文，崔冬梅

0引言

年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration,ARMD)是視網(wǎng)膜黃斑區(qū)光感受細(xì)胞凋亡導(dǎo)致中央視力缺失的一種眼部疾病。ARMD的光感受器凋亡主要由于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞失去向光感受器提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)，并運(yùn)走廢物質(zhì)的功能導(dǎo)致[1]。由于RPE特殊的解剖位置、高代謝活性以及對(duì)光感受器外段的吞噬作用，使得RPE尤其容易受到傷害[2-3]。全反式視黃酸(ATRA)是視覺循環(huán)中不可缺少的部分，作為視網(wǎng)膜內(nèi)的一種內(nèi)源性化合物，ATRA通常通過RDH(如RDH11)還原而被清除，或形成一系列困在RPE溶酶體中的視網(wǎng)膜衍生物[4-6]。ATRA在RPE細(xì)胞內(nèi)的過度積累導(dǎo)致細(xì)胞毒性并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-8]，并在眼底變性疾病的病因中起到作用。以往的研究表明，由ATRA誘導(dǎo)并通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶介導(dǎo)的活性氧(ROS)產(chǎn)生參與了光感受器和RPE細(xì)胞的變性退化[9]。但關(guān)于RPE細(xì)胞變性的分子機(jī)制仍不清楚。本課題組在之前的研究中已證實(shí)ATRA過度累積導(dǎo)致caspase12被激活，caspase12與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)關(guān)系密切，本文通過對(duì)ERS進(jìn)一步研究了ATRA誘導(dǎo)的ARPE-19凋亡的過程。證明ATRA過度累積激活了ERS中PERK-EIF2α-ATF4及IRE1α-XBP1信號(hào)途徑，抑制了ATF6信號(hào)途徑。我們的發(fā)現(xiàn)為視網(wǎng)膜病變中的ATRA毒性提供了新的見解。

1材料和方法

1.1材料ARPE-19細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清、全反式視黃酸(ATRA)(Sigma)；蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)(merck)；Trizol試劑(Invitrogen)；Brilliant SYBR Green試劑盒(Takara)；引物序列(上海生工科技公司)；抗BIP抗體(CST3177)、抗CHOP抗體(CST2895)、抗GAPDH抗體(CST5174)；cfx96實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)；Bio-Rad Quantity One成像軟件(Bio-Rad)；酶標(biāo)儀(日本OLYMPUS公司)；激光共聚焦光譜顯微鏡(Zeiss)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)本研究不涉及人體或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，ARPE-19細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。ARPE-19細(xì)胞在DMEM/F12中常規(guī)培養(yǎng)，輔以10% BSA，青-鏈霉素(100μg/mL)。細(xì)胞在37℃下含5%二氧化碳的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3d更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞采用含0.25% EDTA的胰蛋白酶于培養(yǎng)箱中消化2min，并以1∶4～1∶6的比例接種于25mm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將ATRA溶解于二甲基亞砜(DMSO)中至10μmol/L的儲(chǔ)備濃度。用DMEM/F12稀釋ATRA至工作濃度，在-20℃下冷凍成小份，避免光照。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)取ARPE-19細(xì)胞以2.5×105/mL密度接種于6孔板,用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)分別處理ARPE-19細(xì)胞24h后收集細(xì)胞,并按ATRA濃度分為五組，包括對(duì)照組(0μmol/L)和四個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組，按PureLink RNA mini kit試劑盒的操作說明提取總的RNA，Trizol試劑純化細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況，配制20μL PCR體系，反應(yīng)條件：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 50s，60℃ 50s，40個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。所有樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。引物序列由中國(guó)上海生工科技公司提供，見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR中引物序列

1.2.3蛋白質(zhì)印跡分析用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、15、20μmol/L)處理ARPE-19細(xì)胞24h收集細(xì)胞。然后用PBS洗滌，并用RIPA裂解緩沖液溶解，然后在4℃以14000r/min離心15min。上清液蛋白采用SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，并在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h。CHOP(1∶1000)、BIP(1∶1000)一抗孵育,辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合山羊抗鼠或山羊抗兔二抗孵育，采用ECL蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)觀察條帶，并使用Bio-Rad Quantity One成像軟件分析條帶。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)用ATRA(10μmol/L)處理ARPE-19細(xì)胞24h收集細(xì)胞。在PBS中洗滌3次后，用4%多聚甲醛固定15min，然后在含有1%胎牛血清(BSA)和0.1% Triton X-100的PBS室溫中放置2h，加入CHOP(1∶200)和BIP(1∶400)4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，次日用PBS洗滌3次，每次5min，用抗兔或抗鼠二抗(1∶400)孵育1h。用DAPI(5mg/mL)染色細(xì)胞核10min，用PBS洗滌后，抗熒光衰減劑封片，激光共聚焦光譜顯微鏡觀察并拍照，圖片放大倍數(shù)1000，拍攝圖片比例尺寸為20μm。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用GraphPad Prism 7作圖。本研究中測(cè)量指標(biāo)的計(jì)量資料經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性。對(duì)照組與不同濃度實(shí)驗(yàn)組間差異總體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 ATRA處理ARPE-19細(xì)胞后引起ERSCHOP、BIP為ERS的標(biāo)志性蛋白。用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、15、20μmol/L)處理ARPE-19細(xì)胞24h后,免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果提示，ATRA誘導(dǎo)了CHOP(圖1A)和BIP(圖1B)的產(chǎn)生。Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果見圖1C,分析顯示CHOP(圖1D)、BIP(圖1F)蛋白表達(dá)隨著ATRA濃度累積而上調(diào)；同時(shí)CHOP(圖1E)、BIP(圖1G)的mRNA表達(dá)也升高。通過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)的不同組間CHOP蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.61,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5、5、10、15、20μmol/L時(shí)，CHOP蛋白的產(chǎn)生較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009、0.003、0.005、<0.001、<0.001);檢測(cè)的不同組間BIP蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.07,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5、5、10、15、20μmol/L時(shí)，CHOP蛋白的產(chǎn)生較對(duì)照組呈濃度依賴性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004、0.039、0.019、0.0019、<0.001)；檢測(cè)的不同組間CHOP的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=770.6,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在5、10、20μmol/L時(shí)，CHOP的mRNA水平較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);檢測(cè)的不同組間BIP的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.49,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5μmol/L時(shí)，BIP的mRNA水平較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);當(dāng)ATRA濃度在5、10μmol/L時(shí)，BIP的mRNA水平較對(duì)照組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048、<0.001)，見表2。

圖1 ERS蛋白及mRNA表達(dá) A,B：免疫熒光法CHOP和BIP蛋白表達(dá)；C:用不同濃度的ATRA處理ARPE-19 24h,CHOP,BIP的蛋白質(zhì)印跡表達(dá); D,F：與對(duì)照組相比，ATRA增加CHOP和BIP蛋白水平；E，G：qRT-PCR檢測(cè)隨著ATRA累積，CHOP和BIP的mRNA表達(dá)增加。DAPI：2-(4-氨基苯基)-6-吲哚甲酰胺二鹽酸鹽;CON：對(duì)照組；aP<0.05，bP<0.001 vs 對(duì)照組。

表2 不同濃度ATRA對(duì)ERS標(biāo)志性蛋白CHOP、BIP的蛋白及mRNA表達(dá)水平的影響

2.2 ERS三條主要通路反應(yīng)

2.2.1 PERK-EIF2α-ATF4通路PERK,EIF2α,ATF4為ERS下游PERK-EIF2α-ATF4通路的標(biāo)志性蛋白，用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)處理ARPE-19細(xì)胞24h后，PERK(圖2A)，EIF2α(圖2B)、ATF4(圖2C)的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),證明ATRA過度累積激活A(yù)RPE-19細(xì)胞ERS中的PERK-EIF2α-ATF4通路。通過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)的不同組間PERK的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.95,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時(shí)，PERK的mRNA水平較對(duì)照組水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；檢測(cè)的不同組間EIF2α的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.06,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時(shí)，EIF2α的mRNA水平較對(duì)照組水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；檢測(cè)的不同組間ATF4的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=140.5,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時(shí)，ATF4的mRNA水平較對(duì)照組水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

圖2 不同濃度的ATRA處理ARPE-19細(xì)胞24h,PERK-EIF2α-ATF4通路中PERK,EIF2α,ATF4 mRNA的表達(dá)水平

2.2.2 IRE1α-XBP1通路IRE1α,XBP1為ERS下游IRE1α-XBP1通路的標(biāo)志性蛋白,用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)處理ARPE-19細(xì)胞24h后，XBP1(圖3A),IRE1α(圖3B)的mRNA水平表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，證明ATRA過度累積激活A(yù)RPE-19細(xì)胞ERS中的IRE1α-XBP1通路。通過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)的不同組間IRE1α的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.08,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在10、20μmol/L時(shí)，IRE1α的mRNA水平較對(duì)照組水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；檢測(cè)的不同組間XBP1的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.90,P<0.001)，當(dāng)ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時(shí)，XBP1的mRNA水平較對(duì)照組水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表3。

圖3 不同濃度的ATRA處理ARPE-19細(xì)胞24h,IRE1α-XBP1通路中IRE1α,XBP1 mRNA表達(dá)水平 A：XBP1 mRNA表達(dá)水平；B：IRE1α mRNA表達(dá)水平。bP<0.001 vs 對(duì)照組。

表3 不同濃度ATRA對(duì)ERS三條通路標(biāo)志性蛋白的mRNA表達(dá)水平的影響

2.2.3 ATF6通路ATF6為ERS下游ATF6通路的標(biāo)志性蛋白,用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)處理ARPE-19細(xì)胞24h后，ATF6的mRNA水平較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.36、0.24、0.58、0.61，圖4，表3)，證明ATRA過度累積未激活A(yù)RPE-19細(xì)胞ERS中的ATF6通路。通過三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)的不同組間ATF6的mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.74,P>0.05)。

圖4 不同濃度的ATRA處理ARPE-19細(xì)胞24h,ATF6通路中ATF6 mRNA表達(dá)水平。

3討論

ERS與氧化應(yīng)激、血管生成和細(xì)胞凋亡相關(guān)，被認(rèn)為是ARMD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵致病機(jī)制[10]。ERS和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)可由ARMD危險(xiǎn)因素(如氧化、蛋白質(zhì)毒性和代謝應(yīng)激)和細(xì)胞因子引起，對(duì)視網(wǎng)膜變性疾病的研究證明，在其中RPE細(xì)胞中存在錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)分子[11]。UPR的主要功能是維持正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境損傷[12]，其中大部分和ERS相關(guān)的途徑是由BIP調(diào)節(jié)的[13-14]。BIP是一種重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶，調(diào)節(jié)ERS相關(guān)通路，并防止錯(cuò)誤折疊和展開的蛋白質(zhì)的積累，其表達(dá)是由ERS和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)觸發(fā)的[15-16]。這個(gè)重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶防止錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白的積累，其表達(dá)是由ERS和錯(cuò)誤折疊蛋白觸發(fā)的[17-18]。在我們的研究中，經(jīng)ATRA處理后的ARPE-19細(xì)胞中的BIP表達(dá)水平升高，說明ERS參與了這一實(shí)驗(yàn)過程。關(guān)于未折疊蛋白反應(yīng)的信號(hào)途徑，ERS傳感器引發(fā)的三種途徑(PERK、IRE1α和ATF6)在細(xì)胞ERS方面最受關(guān)注[19]。大多數(shù)數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)，即CHOP是由PERK/EIF2α/ATF4以及IRE1α/XBP1和ATF6亞通路誘導(dǎo)的，從而激活促凋亡基因表達(dá)、恢復(fù)翻譯起始并增加內(nèi)腔的氧化電位[20]。CHOP是ERS時(shí)ATF4轉(zhuǎn)錄因子的主要靶點(diǎn)和細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[11]。CHOP的許多轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)也與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。其中包括Ero1α、GADD34和BIM。BIM是一個(gè)僅BH3結(jié)構(gòu)域的基因，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致線粒體膜電勢(shì)(Δψm)下降。任何通過線粒體呼吸鏈的電子傳遞損傷都會(huì)導(dǎo)致氧的不完全還原，最終導(dǎo)致ROS的形成[21]。CHOP在ERS期間介導(dǎo)了Ero1α表達(dá)的激活，從而加重了應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ROS的積累[22]。除了PERK介導(dǎo)的UPR外，研究還發(fā)現(xiàn)IRE1α有助于ERS應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[23]。IRE1α有一個(gè)RNase結(jié)構(gòu)域，在ERS應(yīng)激下激活，Oakes等發(fā)現(xiàn)IRE1α切割了通常抑制caspase 2合成的microRNA[24]，從而引起caspase 2水平升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。也有研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中當(dāng)IRE1α途徑被激活，CHOP表達(dá)也會(huì)自發(fā)激活，ROS生成增加，IRE1α抑制劑STF-083010可有效降低CHOP的表達(dá)水平及ROS水平[26]。說明PERK及IRE1α介導(dǎo)的UPR均可能誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，并進(jìn)一步導(dǎo)致ROS的積累。在本研究中，ATRA通過PERK-EIF2α-ATF4信號(hào)通路和IRE1α-XBP1信號(hào)通路激活細(xì)胞ERS。隨著ATRA濃度的升高，相關(guān)通路的mRNA表達(dá)也隨之升高。當(dāng)以最高劑量孵育時(shí)，PERK相關(guān)mRNA的表達(dá)趨勢(shì)會(huì)變小，這可能歸因于負(fù)反饋回路。PERK激活在數(shù)小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)ATF4，并且在不久后誘導(dǎo)ATF4的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，PERK/ATF4信號(hào)也具有負(fù)反饋環(huán)，在1～2d內(nèi)抑制其活性[27]。先前的研究表明，EIF2α抑制劑Salubrinal，能顯著降低ATRA誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡水平[28]，與本文研究結(jié)果相符。ATRA介導(dǎo)的活性氧過度產(chǎn)生是ERS誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的早期事件，并且通過抗氧化作用清除活性氧。抗氧化劑可能是一種有效地保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞免受過量ATRA侵害的策略。

盡管ATRA對(duì)視力是必不可少的，但這種分子在RPE細(xì)胞內(nèi)的過度積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。本研究從ERS的角度進(jìn)行闡述，擴(kuò)大了我們關(guān)于ATRA對(duì)人RPE細(xì)胞毒性的認(rèn)識(shí)，在減輕ATRA對(duì)細(xì)胞器有害作用的基礎(chǔ)上，為靶向治療開辟了新的途徑。