新疆新源縣酸馬奶細菌菌群分析

高世南，徐志華，李 楊，雷勇輝，孫燕飛*

（1.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學農學院，新疆 石河子 832003）

馬奶發酵后的酸馬奶是具有草原特色的傳統發酵飲品。酸馬奶又稱為馬奶酒、策勒（我國內蒙古自治區常用）、艾日格（蒙古國常用）等，是以新鮮馬奶為原料，結合自然發酵和傳統發酵技術制成的一種古老的乳酸菌保健品[1]。在新疆地區的哈薩克族和蒙古族牧民家庭中，至今還保留著制作和飲用酸馬奶的習俗[2]。新鮮馬奶自采集后的短時間內，在含有的多種微生物菌群共同互助作用下會自然發酵產生口味變酸的現象，成為酸味的乳制品[3]。酸馬奶風味的改變和其中的發酵微生物有密切聯系，酸馬奶中的發酵微生物群落結構復雜，包括多種類型的乳酸菌（如嗜溫乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳桿菌、乳球菌、嗜熱乳桿菌等），酵母菌（如乳糖發酵酵母、非乳糖發酵酵母、單孢酵母等）以及其他未鑒定出的菌種[4]。

自1895年對酸馬奶自然發酵過程中起重要作用微生物的研究開始，許多研究人員已經對中國新疆地區[5]、內蒙古錫林郭勒地區[6-7]、蒙古國[8]等的酸馬奶采用了包括傳統鑒定培養、焦磷酸高通量測序技術、Illumination MiSeq高通量測序技術、Pacbio SMRT第三代測序技術等在內的方法研究酸馬奶中微生物群落多樣性，這些研究大多數集中于乳酸菌菌群多樣性，分析發酵酸馬奶中乳酸菌屬在發酵過程中豐富度和多樣性變化。這表明新鮮馬奶在采集后的自然發酵過程中，乳酸菌菌群發揮著至關重要的作用，馬奶中蘊含豐富的乳酸菌資源。

近年來，許多研究人員利用微生物菌劑改良鹽堿地并取得了良好效果：逄煥成等[9]通過玉米盆栽試驗，表明施用微生物制劑能夠降低鹽堿土的pH和含鹽量，并對玉米的株高和地上部分干物質的積累有促進作用；王維華等[10]對不同鹽梯度的土壤施用乳酸菌菌肥，結果表明乳酸菌菌肥可以提高鹽脅迫下其他微生物的活性；侯景清等[11]以西紅柿為材料進行田間試驗，認為施加乳酸菌復合制劑能夠顯著降低鹽堿土的pH，增加土壤養分，并且能夠降低土壤中病原微生物的數量。這顯示了乳酸菌菌劑對于改良鹽堿土具有較大的應用潛力。

本研究選用Illumina MiSeq高通量測序技術，分析了采集于新疆那拉提大草原的新鮮馬奶在自然發酵變酸后細菌的菌群結構；并對其可培養優勢菌群（乳酸菌）進行分離純化鑒定，為將來將其應用在新疆鹽堿地改良方面奠定基礎，亦為新疆酸馬奶中乳酸菌資源開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集

將采集于新疆伊犁新源縣那拉提草原的新鮮馬奶分裝入無菌容器中，低溫保存帶回實驗室，在4 ℃冰箱中保存備用。

1.1.2 培養基

MRS培養基[12]：酵母浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH 6.2～6.4。

牛肉膏蛋白胨液體培養基：氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，pH 7.4～7.6。

糖類發酵培養基：溴甲酚紫（1.6%）1 mL，肉膏5.0 g/L，糖（或醇）1%，蛋白胨10.0 g/L，pH7.6。

1.1.3 主要試劑

Taq酶（5 U/μL）：大連TAkaRa公司；氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、瓊脂、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、15%過氧化氫、結晶紫染液、番紅染液、體積分數95%乙醇、瓊脂糖、TE緩沖液等（均為分析純或生化試劑）：天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；RS-232精密電子天平：上海恒平科學儀器有限公司；FroFleX聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養箱：上海精宏設備實驗有限公司；HY-5A回旋式振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸馬奶可培養和不可培養細菌菌群高通量測序分析

無菌條件下選擇適量酸馬奶樣品與蒸餾水按照體積比為1∶10進行稀釋，將稀釋好并振蕩均勻的酸馬奶樣品選擇部分分批次進行0.22 μm的濾膜抽濾：樣品標號后，使用減壓抽濾裝置進行振蕩液抽濾富集；待錐形瓶內的所有振蕩液抽濾完畢，用干凈的分裝袋封存濾膜送樣至上海美吉生物公司完成高通量測序。樣本的16S rDNA V4區（引物為515F和806R）高通量測序后，對優化序列在97%水平上歸并劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），將高質量豐度的序列作為該OTU的代表性序列，相似度大于97%的序列將聚為同一個OTU，用于細菌菌群結構的分類地位鑒定，在不同分類水平上分析該樣品中細菌群落的含量及種群結構差異[13]。

1.3.2 Alpha多樣性分析

對新疆伊犁那拉提大草原酸馬奶高通量測序結果進行Alpha多樣性的相關分析，應用QIIME（1.8.0）軟件平臺計算酸馬奶樣本細菌群落的生物多樣性，繪制稀疏曲線，由此來判定當前樣本的測序深度是否能夠完全呈現該菌群群落樣本所包含的微生物多樣性。超（Chao）1指數用來評估物種總數，ACE指數估計群落中包含的OTU數目，兩者主要是側重表現群落豐富度；香農指數和辛普森指數評估樣本中群落多樣性。目的在于對OTU豐度矩陣中的酸馬奶樣本在90%的最低測序水平深度下，隨機抽取樣本后，使用平臺運算上述4種多樣性指數。

1.3.3 酸馬奶中乳酸菌的分離純化和保藏

利用MRS分離鑒定培養基，滅菌后與乳酸菌培養的同等條件下進行恒溫培養24 h，排除培養基污染因素，將酸馬奶按10倍稀釋法進行稀釋分離，移取稀釋液0.1 mL涂布于MRS培養基上，37 ℃恒溫培養24～72 h[14]。根據乳酸菌菌落和菌體形狀圓形、表面凸起、邊緣光滑、顏色呈乳白色等特征鏡檢確認后[15]，隨機挑取不同的疑似單菌落，平板劃線純化2～3次，將純化后的疑似乳酸菌于MRS斜面培養，4 ℃干燥冷藏。

1.3.4 分離菌株的生理生化鑒定

將分離純化后的單菌落進行形態學鑒定，觀察乳酸菌菌落形態特征和細胞形態，同時進行革蘭氏染色、過氧化氫酶接觸實驗、糖發酵實驗以及生長溫度實驗，對菌株進行初步鑒定。最后依據以上實驗結果，將革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性的菌株暫時認定為乳酸菌[16]，進行下一步的基因型分子鑒定分析，給疑似菌株編號并采用斜面4 ℃低溫保藏。

1.3.5 分離菌株的分子生物學鑒定

采用傳統DNA抽提法（酚-氯仿法）[17]，提取酸馬奶樣品中分離純化得到的乳酸菌的總DNA。將抽提的樣本DNA進行濃度檢測，選擇OD260nm/OD280nm=1.8～2.0且波長260 nm處有明顯吸收峰的樣本，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACCTTGTTACGACTT-3'）擴增16S rDNA全長PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物送上海美吉生物公司進行測序，將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）序列比對，用Mega軟件建立系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 酸馬奶中OTU劃分和細菌多樣性組成分析

通過Illumination MiSeq高通量測序，酸馬奶樣品中的菌群微生物多樣性指數如表1所示。由表1可知，總共產生了高質量有效16Sr RNA基因序列38 901條，依據樣本基因序列相似程度來歸并劃分OTU，一共獲得了235個OTU；Chao1和ACE指數分別為249.76、252.23，表明OTU數目較多，酸馬奶中細菌菌群豐富度較大；香農（Shannon）和辛普森（Simpson）指數分別為1.41和0.47，表明細菌菌群多樣性較低。

表1 酸馬奶菌群微生物多樣性指數Table 1 Diversity index of microbial flora in koumiss

可分類操作單元OTU在Alpha多樣性分析以及對于各分類水平劃分都具有非常重要的意義。對樣本進行16S rDNA高通量測序后，最終酸馬奶樣品的細菌菌群可以注釋到17個門、36個綱、73個目、110個科、156個屬，核心OTU為乳桿菌屬以及醋桿菌屬。

2.2 Alpha多樣性分析

由圖1A可知，酸馬奶樣本的稀釋性曲線隨著抽取序列數的增加還未進入平臺期；但根據圖1B和圖1C可知，Shannon曲線以及Chao1曲線均傾向于平緩：其中Chao1曲線進入到了平臺期，且Shannon曲線也已飽和，說明在本次研究中所得到的樣本測序結果可以充分體現當前樣本所包含的細菌多樣性，滿足了細菌測序量后繼所需的生物信息學分析要求。酸馬奶細菌菌群多樣性已經不會再隨著樣本總量的增加而有較大的改變，即使測序深度繼續增加也已無法檢測出大量還未發掘的新型菌種，現有的測序結果足以反映大多數細菌菌群的物種信息；根據圖1D可知，Rank-Abundance曲線在橫坐標上的范圍下降快速，反映酸馬奶樣本中優勢菌群所占比例很高，細菌多樣性較低。

圖1 酸馬奶樣品的Alpha多樣性分析結果Fig.1 Alpha diversity analysis results of koumiss

2.3 群落結構分析

酸馬奶的細菌群落結構如圖2所示。該酸馬奶樣本從門的分類水平上來看，細菌菌群中優勢門為厚壁菌門（Firmicutes）占所有菌群的85.78%，其次為變形菌門（Proteobacteria）占12.72%，其他門占1.50%；從綱的分類水平上看，細菌菌群的優勢綱為芽孢桿菌綱（Bacilli）占所有菌群的85.52%，γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）和β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）也均有分布，分別占6.54%、4.39%和1.82%；從目的分類水平上，細菌菌群的優勢目是乳桿菌目（Lactobacillales），占所有菌群的85.51%，分布較多的還有紅螺菌目（Rhodospirillales）和假單胞菌目（Pseudomonadales），分別占3.54%和3.44%；在科的分類水平上，細菌菌群中的優勢科是乳桿菌科（Lactobacillaceae）占所有菌群的83.95%，醋桿菌科（Acetobacteraceae）和莫拉氏菌科（Moraxellaceae）也有分布，分別占3.42%和3.25%；在屬的分類水平上來看，細菌菌群中優勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）占83.95%，醋桿菌屬（Acetobacter）占3.36%，不動桿菌屬（Acinetobacter）占3.24%，腸桿菌屬（Enterobacter）占2.04%，其他菌屬占7.40%。

圖2 酸馬奶樣品中細菌相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria in koumiss samples

2.4 乳酸菌的形態特征

從酸馬奶中分離純化出1株菌株MN-Is，參照文獻[18]觀察其菌落形態以及細胞形態，如圖3所示，菌落形態觀察為圓形，乳白色，邊緣光滑，表面突起，菌株革蘭氏染色結果為紫色，由此推斷菌株MN-Is屬于革蘭氏陽性菌。

圖3 菌株MN-Is菌落形態圖（a）和革蘭氏染色圖（b）Fig.3 Colony morphology (a) and Gram chromatogram (b) of strain MN-Is

2.5 菌株MN-Is生理生化檢測

菌株MN-Is的生理生化試驗結果如表2所示：細胞無運動行為，接觸酶試驗為陰性，能夠在15 ℃以及45 ℃條件下生長，能夠利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖等碳源，不能利用棉籽糖[19]。結合形態觀察及生理生化初步經鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillussp.）。

表2 菌株MN-Is的生理生化試驗結果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strain MN-Is

2.6 乳酸菌的系統進化分析

菌株MN-Is的系統發育樹見圖4，菌株MN-Is與通過結合菌株MN-Is形態特征、生理生化特性檢測結果，鑒定出菌株MN-Is屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。

圖4 基于16S rDNA基因序列菌株MN-Is的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain MN-Is based on 16S rDNA gene sequences

3 討論

傳統純培養方法分離出酸馬奶中的乳酸菌種類有限，僅分離得到優勢屬中的乳桿菌屬，可能的原因是研究中采用MRS培養基進行分離純化，其成分含量并不能適用于所有乳酸菌，在后續的研究中應利用不同種類的培養基。其次，研究中采用的培養溫度是37 ℃，根據張蘭威等[20]的研究表明，溫度會影響混合生長的乳酸菌培養，且當溫度達到44 ℃時，有利于不同乳酸菌的生長比例到達平衡，這提示在后續試驗中應設置不同的溫度梯度，以適應不同種類乳酸菌的生長。

不同地區酸馬奶的細菌菌群結構差異并不十分明顯，烏日汗等[21]采用Illumina MiSeq第二代測序技術對內蒙古科爾沁地區的酸馬奶進行了細菌多樣性分析，結果表明酸馬奶引子中細菌主要分布于四個屬：乳桿菌屬、醋桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬，其中乳桿菌屬是絕對優勢菌群；布仁其其格等[22]采用454焦磷酸測序分析內蒙古錫林郭勒地區酸馬奶不同發酵時期的細菌群落結構，結果表明酸馬奶中乳桿菌屬是優勢細菌屬，乳球菌屬是次優勢細菌屬。此外，還分布有醋酸菌屬和不動桿菌屬等多種細菌；趙飛燕等[23]利用PacBio SMRT測序技術分析內蒙古錫林郭勒地區鮮馬奶的細菌多樣性，結果表明在細菌屬水平，優勢菌群主要有芽孢桿菌屬（23.44%）、乳球菌屬（18.18%）和類芽孢桿菌屬（13.8%），這提示鮮馬奶的細菌多樣性比發酵后的酸馬奶更豐富。

4 結論

采用Illumina MiSeq高通量測序首次對新疆新源縣那拉提草原的酸馬奶細菌菌群結構的多樣性進行了分析與鑒定。結果表明，酸馬奶的細菌菌群結構豐富，但菌群多樣性較低，其中厚壁菌門（Firmicutes）為酸馬奶中的優勢菌門，占所有菌群的85.78%；乳桿菌屬（Lactobacillus）為酸馬奶中的優勢菌屬，占所有菌群的84%。通過傳統培養分離方法分離出1株菌，編號為MN-Is，經形態觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。