γ-分泌酶抑制劑通過Notch信號通路抑制人骨肉瘤細胞的遷移

李珂 李京 賀西京 王爽 郝丹丹

骨肉瘤是一種最常見的惡性骨腫瘤，在兒童和青少年人群發病率最高。轉移是骨肉瘤預后不良的關鍵因素之一，最常見的轉移部位為肺，約有15%～25%的骨肉瘤病人在確診時即發現肺轉移［1_3］。骨肉瘤目前的治療方式為保肢手術聯合輔助化療，然而轉移病人的5年生存率仍然不足20%［4_5］。有文獻報道，Notch信號通路在包括骨肉瘤在內的多種惡性腫瘤中均有異常表達，增加腫瘤的遷移侵襲能力［6_8］。而DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑，能夠在Notch通路的活化過程中起到阻斷作用［9］。本文通過體外培養人骨肉瘤細胞系MG63和143B以及構建體內肺轉移瘤模型，并用DAPT進行處理干預，來探究DAPT能否通過阻斷Notch通路而抑制骨肉瘤細胞的遷移及體內侵襲能力，從而為骨肉瘤的臨床抗轉移治療提供研究思路。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑耗材

人骨肉瘤細胞系MG63和143B（中國科學院上海細胞研究所，中國）；DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素&鏈霉素（Gibco公司，美國）；PBS緩沖液、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；DAPT、二甲基亞砜（DMSO）、4%多聚甲醛（Sigma公司，美國）；Jagged1活性肽（序列：CDYYYGFGCNKFCRPR，10μM，Gen_Script）；Transwell小室（Corning Costar公司，美國）；鼠抗人Notch1（免疫熒光1∶250，Abcam公司，英國）；羊抗鼠二抗（免疫熒光1∶500，Abcam公司，英國）；DAPI（1∶1 000，Abcam公司，英國）。

二、實驗方法

（一）細胞培養

143B和MG63細胞系培養于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱，每兩天換液一次，將細胞培養至對數生長期，用胰蛋白酶消化收集用于后續實驗。

（二）DAPT處理

將DAPT用DMSO溶解配成50 mM的母液，分裝后儲存于-80℃冰箱中。使用時取出溶解，用DMEM培養基稀釋到實驗所需濃度。

（三）免疫熒光染色

將細胞接種于細胞爬片上，待細胞融合度達到90%時，取出爬片，用PBS浸洗3次，每次3 min。用4%多聚甲醛固定爬片15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。用吸水紙吸干爬片上的PBS，滴加山羊血清，室溫封閉30 min。在每張爬片上滴加稀釋好的一抗并放入濕盒中，4℃孵育過夜。第二天取出爬片，用PBS浸洗3次，每次3 min，用吸水紙吸干后滴加稀釋好的二抗，置于濕盒中，室溫避光孵育1 h。用PBS浸洗3次，每次3 min，然后滴加稀釋好的DAPI，室溫避光孵育5 min后，用PBS浸洗3次，每次3 min。用吸水紙吸取殘余的PBS后，用含抗熒光猝滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

（四）標本來源

西安交通大學第二附屬醫院骨二科，病人1，男，16歲，診斷為左側肱骨近端骨肉瘤；病人2，男，12歲，診斷為右側股骨遠端骨肉瘤。病人3，女，57歲，診斷為左側股骨近端骨肉瘤。以上病人均發生肺部轉移。

（五）免疫組織化學染色

取腫瘤組織用4%多聚甲醛固定48 h，然后進行石蠟包埋。將石蠟組織連續切片后進行抗原修復，擦干周圍水分后，加入一抗置于4℃冰箱孵育過夜。復溫加入二抗后于37℃孵育20 min，然后用PBS沖洗。擦凈周圍水分后DAB顯色、蘇木精復染、分化、脫水、透明，封片，最后在光學顯微鏡下進行觀察采集圖像。

（六）劃痕試驗

取處于對數生長期的143B和MG63細胞以5×105個/孔接種于24孔板中，每隔一天換液一次，顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞融合度達到90%時，用200μL的無菌槍頭劃痕，注意用力均勻，棄去培養液，用PBS浸洗后更換含有1%胎牛血清的DMEM培養液。將0.2μL的DMSO（對照組）、10μM的DAPT（DAPT組）以及10μM的Jagged1活性肽（Jagged1組）加入至各組，于顯微鏡下觀察劃痕情況，拍照。將24孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，24 h后取出于顯微鏡下觀察各組劃痕愈合情況，拍照。

（七）Transwell遷移試驗

取處于對數生長期的143B和MG63細胞，用無血清的DMEM培養基重懸計數，取50μL 5×106/mL的MG63和143B細胞接種于Transwell小室的上室，下室分別加入30μL含等體積DMSO（對照組）、10μM的DAPT（DAPT組）以及10μM的Jagged1活性肽（Jagged1組）的10%血清培養液。常規孵育8 h后，用棉簽輕輕擦去小室膜上表面的細胞，用4%的多聚甲醛固定小室膜下表面遷移的細胞30 min，并用結晶紫染液染色15 min，純水洗凈。在顯微鏡下隨機選取8個視野，觀察遷移細胞的數量，每組實驗均獨立重復3次。

（八）肺轉移瘤模型的構建

在西安交通大學醫學部實驗動物中心購買6只4周齡大BABL/C雄性裸鼠，參考文獻［10_11］方法建立小鼠骨肉瘤異種肺轉移瘤模型。將裸鼠隨機分為兩組，對照組和DAPT組，每組3只。從尾靜脈向6只裸鼠注射100μL的MG63細胞懸液，濃度為1×107個/mL。隨后每隔一天對裸鼠腹腔注射一次DAPT（DAPT組，10 mg/kg，用5%DMSO稀釋）或等體積的5%的DMSO（對照組，用PBS稀釋），在MG63細胞注射四周后對裸鼠進行處死，觀察肺轉移瘤大小，并將標本切片進行HE染色。

（九）腫瘤組織染色

將裸鼠肺部轉移瘤組織切片進行染色，首先使用二甲苯脫蠟2次，每次5 min，用無水乙醇浸洗2次，每次5 min。然后用95%的乙醇和80%的乙醇各洗10 min，分別用自來水和純水各清洗2 min，然后用蘇木素染色4 min后用自來水清洗2 min。用1%的鹽酸酒精分化20 s，馬上用自來水清洗2 min，用1%稀氨水返藍30 s后，用自來水清洗2 min。最后用伊紅染色2 min，再用80%的乙醇和95%的乙醇各脫水10 s，無水乙醇脫水5 min，用二甲苯透明20 min后封片，置于顯微鏡下觀察采集圖像。

三、統計學分析

采用SPSS 22.0（IBM公司，美國）進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，各組間細胞遷移數量的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Notch1在骨肉瘤細胞及臨床標本中高表達

從圖1 a～f可以看到Notch1在MG63細胞及143B細胞中均高表達，人骨肉瘤體內肺轉移臨床標本的免疫組織化學染色結果顯示肺轉移腫瘤標本中同樣高表達Notch1（圖1 g、h），說明Notch1無論在人骨肉瘤MG63和143B細胞系還是在肺轉移瘤中都被過度表達。

二、DAPT抑制骨肉瘤細胞的遷移

如圖2所示，與對照組相比，DAPT組細胞的遷移愈合距離明顯短于對照組和Jagged1組，而Jag_ged1組細胞的遷移愈合距離最長，說明DAPT能夠抑制兩種骨肉瘤細胞的遷移，而Jagged1通過促進Notch通路的活化增強兩種骨肉瘤細胞的遷移能力。Transwell遷移試驗結果如圖3所示，DAPT組穿膜細胞明顯少于對照組和Jagged1組，而Jagged1組的穿膜細胞最多，同樣說明了DAPT對于143B細胞和MG63細胞的遷移有抑制作用。

三、DAPT在體內抑制骨肉瘤的肺轉移

肺部是骨肉瘤病人最常見的轉移部位，為了驗證DAPT對體內骨肉瘤肺轉移的影響，我們用MG63細胞進行了裸鼠成瘤試驗，成功構建了裸鼠的肺轉移瘤模型，并經腹腔注射DAPT探究其對骨肉瘤肺轉移的影響。如圖4 a所示，對照組的肺部腫瘤結節明顯大于DAPT組，且數量更多。隨后我們將肺部進行切片染色，HE染色結果顯示對照組有明顯的轉移結節，且面積更大，而DAPT組幾乎沒有結節（圖4 b），說明DAPT能夠在體內明顯抑制人骨肉瘤MG63細胞的肺轉移。

討 論

圖1 細胞免疫熒光染色與臨床標本免疫組化結果a～c：MG63細胞免疫熒光染色；d～f：143B細胞免疫熒光染色；紅色熒光標記Notch1陽性細胞，藍色熒光DAPI標記細胞核（×200）；g、h：人體骨肉瘤標本免疫組化結果及陰性對照（×400）

圖2 143B細胞和MG63細胞的劃痕實驗 a：143B細胞劃痕愈合結果（×100）；b：MG63細胞劃痕愈合結果（×100）

骨肉瘤是一種致殘率很高的原發性惡性骨腫瘤，尤其是肺轉移后的病人生存率很低，嚴重威脅到人類的生命［12_13］。隨著治療手段的不斷提升，骨肉瘤的治療方法不斷增多，但是由于骨肉瘤容易發生肺轉移，所以總體的預后仍然很差，肺轉移病人的5年生存率不足20%，因此針對骨肉瘤病人肺轉移的治療目前仍是一大研究熱點［14_15］。

Notch信號通路在胚胎發育過程中起著關鍵作用，參與胚胎期間的血管發育和血管生成，在組織修復、傷口愈合的新生血管再生中同樣發揮著重要作用［16_17］。同樣，Notch通路也在癌癥中扮演著重要的角色，任何干預Notch通路的微環境的改變都有可能成為機體癌變的引線。Notch通路通過整合癌細胞與腫瘤微環境之間的相互作用，進一步支持了癌細胞的“干性”，幫助其在微環境中的長期生存［18］。Notch信號傳導參與癌癥擴散的早期階段，即入侵和遷移，有研究表明，Notch通路直接或間接地與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分相互作用，幫助上皮癌細胞穿透ECM，這對于癌細胞的體內轉移具有重要作用［19_20］。因此，本文擬通過體內、體外實驗來探究Notch通路阻斷劑DAPT對骨肉瘤遷移侵襲的影響，為骨肉瘤轉移的臨床治療提供研究思路和科研支持。

圖3 143B細胞和MG63細胞的Transwell遷移試驗 a：兩種細胞Transwell遷移情況（結晶紫染色，×200）；b：兩種細胞遷移情況柱狀統計圖（與對照組比較，**P＜0.01）

圖4 裸鼠骨肉瘤的肺轉移情況 a：肺部轉移瘤圖片；b：肺轉移瘤的HE染色（×100）

本實驗通過體外培養人骨肉瘤143B細胞和MG63細胞，添加DAPT與Notch通路激活劑Jag_ged1，觀測其對癌細胞體外遷移能力的影響。首先我們采用免疫熒光染色和免疫組化分別檢驗MG63細胞、143B細胞和人骨肉瘤肺轉移瘤的臨床標本中Notch1的表達情況，結果顯示體外培養的人骨肉瘤MG63、143B細胞系和人骨肉瘤肺轉移瘤均高表達Notch1，這對后續的干預研究具有指導意義。然后我們通過劃痕試驗定性觀察DAPT和Jagged1對人骨肉瘤143B細胞和MG63細胞遷移的影響，結果表明DAPT能夠明顯抑制兩種細胞的劃痕愈合能力，而Jagged1則能夠起到明顯的促進愈合作用，這與我們的預期相符。接著我們通過Transwell遷移實驗進行定量驗證，結果同樣證明DAPT對143B細胞和MG63細胞的遷移起抑制作用。為了給臨床治療提供更加可靠的實驗信息，模擬更加復雜的體內環境，我們通過構建裸鼠的骨肉瘤肺轉移瘤模型來驗證DAPT對于骨肉瘤的體內侵襲轉移能力的影響。結果顯示，DAPT能夠明顯減少人骨肉瘤MG63細胞肺轉移瘤的數量及體積，且通過對轉移瘤標本的HE染色發現，DAPT組的結節數量明顯少于對照組，且結節大小也明顯減小，說明DAPT能夠在體內環境中抑制骨肉瘤的肺部侵襲轉移能力，這對于骨肉瘤的轉移治療具有重要指導意義。

本研究結果顯示，γ-分泌酶抑制劑DAPT對體外培養的人骨肉瘤143B細胞和MG63細胞有明顯的遷移抑制作用，同時能夠減弱體內骨肉瘤肺部侵襲轉移能力。本研究為DAPT治療骨肉瘤肺轉移的臨床應用提供了重要的理論基礎。