脊髓損傷的細胞治療策略

許盼盼 李才 吳楠 葉雨辰 胡捷 姚文軍 金世昌 張長春

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）主要由外部創傷、感染、腫瘤或發育畸形等原因引起，常導致感覺、運動和自主功能障礙，致殘率和死亡率很高［1］。在嚴重的SCI病例中，只有不足1%的病人能夠完全恢復神經功能，其中許多病人可能導致部分或完全癱瘓［2］。此外，SCI常導致一些人體系統功能障礙等嚴重的并發癥［3］，同時也可誘發慢性疼痛綜合征、抑郁等心理障礙，給病人的生理、心理和社會行為等帶來嚴重的不良影響，長期高額的醫療花費也給病人家庭造成困擾［4］。以往SCI在很大程度上仍是姑息性治療：預防損傷惡化、處理并發癥、指導殘疾的病人如何自理［3］。近年來神經生物學有了重大突破，最初的姑息治療已經轉變為更有效的干預手段。目前治療SCI主要有兩大策略——神經再生和神經保護［5］。對于神經再生，通過組織工程中的細胞移植能夠幫助促進軸突和神經元的再生，使受損的神經重新連接起來，并通過再生來代替丟失的細胞。對于神經保護，通過藥物治療可預防繼發性損害的發生，繼而限制脊髓進一步損傷。

成熟的神經元在受損后不會再生，不能完全歸因于神經元的內在缺陷，外部的抑制環境同樣起著決定性作用［6］。因此，尋求一種理想、簡單、安全、有效、可行的軸突再生、再髓鞘化和功能恢復的修復策略至關重要。細胞移植已成為目前SCI最有前途的治療措施。細胞治療的機制被廣義地定義為移植細胞和宿主細胞之間的直接或間接的相互作用，這種彼此作用會對脊髓受損部位的微環境有所反應，還能夠影響脊髓受損部位的微環境，并改變移植細胞和宿主細胞在環境中的相互作用，從而影響SCI后的組織或功能結果［2］。到目前為止，不同研究小組制定的大多數實驗性修復策略都側重于改善不適宜的中樞神經系統（central nervous system，CNS）環境，通過多種細胞移植來促進軸突生長［2］。

本文從再生挑戰、細胞類型及相關神經營養因子等方面綜述SCI的細胞治療方法，希望這一工作能有助于改善組合療法的策略和SCI再生的臨床應用。

一、文獻檢索策略

本文通過英文檢索詞“spinal cord injury”、“regeneration of challenge”、“anatomical structure”、“cell therapeutics”、“neu_rotrophic factors”在PubMed平臺進行檢索，篩選SCI細胞治療的相關文獻，共檢索到文獻872篇。文獻納入標準為：①已正式發表的期刊文獻；②文獻內容與SCI、再生挑戰、解剖結構、細胞治療和營養因子密切相關；③同類研究中質量、證據等級較高的文獻；④語言為英文的文獻。文獻排除標準為：①文獻質量、證據等級較低的文獻；②非英文的文獻；③無法獲得全文的文獻。根據納入與排除標準最終納入英文文獻74篇（圖1）。

圖1 文獻篩選流程圖

二、脊髓的結構解剖

脊髓起源于大腦底部的延髓，通過枕骨大孔到達第一腰椎下緣。脊髓內部有一片左右對稱形似蝴蝶的灰色區域，稱為灰質區，由大量的神經元胞體、樹突、少數有髓鞘的和無髓鞘的軸突、膠質細胞和毛細血管聚集在一起形成［7］。白質包裹著中央灰質，主要由少突膠質細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞組成［7］。

三、SCI再生面臨的挑戰

SCI發生后會導致囊腔和膠質瘢痕的形成。損傷初期創傷處細胞腫脹，受損的細胞通過釋放有毒物質，使其他細胞繼發性壞死，在病灶處形成囊腔，最后被膠質瘢痕包圍［8］。損傷后產生的抑制分子和炎癥同樣可抑制脊髓的再生能力［9］。

（一）囊腔形成

在損傷和壞死初期，局部形成充滿液體的囊腔，可限制軸突再生和細胞遷移［10］。囊腔可擴展至其它未受損的脊髓節段，導致未受損的脊髓節段也受牽連，造成細胞死亡和功能障礙。此外，形成的囊腔相當于一個屏障，阻止營養因子的進入和再生信號的傳導。然而，通過細胞移植可以抑制囊腔形成，有助于脊髓內信號傳導的恢復，推進軸突的再生［11］。

（二）膠質瘢痕和硫酸軟骨素蛋白聚糖

損傷部位的反應性星形膠質細胞會產生大量的細胞外基質—硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG），為膠質瘢痕的主要組成物質［12］。在損傷的早期，膠質瘢痕可抑制損傷向周圍組織擴散，從而達到保護周圍脆弱組織的作用［13］。但是膠質瘢痕的形成無異于在病灶部位形成了一個物理和分子屏障，阻礙軸突再生［14］。目前降解CSPG最常見的實驗方法之一是通過硫酸軟骨素酶ABC（chondroitinase ABC，ChABC）來實現的。該酶通過裂解CSPG糖胺聚糖鏈來減弱CSPG的抑制活性，從而有利于功能的恢復［15］。

（三）髓磷脂類抑制劑

經研究發現SCI后功能的恢復會受到某些髓磷脂抑制劑的抑制，目前三種主要的髓磷脂類抑制劑已被確定：軸突生長抑制因子（neurite outgrowth inhibitor，Nogo），髓鞘相關糖蛋白（myelin_associated glycoprotein，MAG）和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）［16］。Nogo是一種膜蛋白，主要在少突膠質細胞膜上表達，當其與神經元膜的受體結合時，會抑制軸突生長，造成生長錐塌陷［17］。MAG由少突膠質細胞產生，分布在包裹中樞神經軸突的髓磷脂中，是脊髓再生的抑制劑之一［16］。OMgp存在于CNS的少突膠質樣細胞的軸突周圍，神經元突起的生長被抑制［18］。來自不同實驗室的證據表明，這三種經典的髓磷脂相關抑制因子有一個共同的受體—Nogo受體（Nogo Receptor，NgR），這三種蛋白通過與NgR結合，激活Rho信號，抑制脊髓再生［18］。

（四）炎癥

SCI必然會發生炎癥反應，小膠質細胞和巨噬細胞被認為與這一反應密切相關［19］。小膠質細胞是CNS中獨特的免疫細胞，它們的急性活化具有保護作用，但慢性和不受控制的活化導致周圍環境中促炎細胞因子和神經毒性分子的持續釋放，導致神經毒性的后果［20］。此外，巨噬細胞的不同表型發揮著不同的作用，M1型巨噬細胞具有促炎作用，而M2型巨噬細胞具有抗炎作用［19］。但是M1巨噬細胞介導的促炎作用在SCI大鼠和小鼠模型中占主導地位［21］。

四、細胞治療

細胞治療是當前SCI治療最具潛力的療法之一，具有神經保護和再生的潛力。重要的是，細胞具有多種靶點和刺激反應功能，已被用于調節炎癥反應、形成支架、軸突再髓鞘化、取代細胞和增強可塑性等［22］。利用這一潛在機制，學者們研究了幾種不同組織來源的細胞治療SCI。

（一）施萬細胞

施萬細胞（schwann cells，SCs）通過一串串地形式纏繞在周圍神經纖維的軸突上。在有髓神經纖維中，SCs形成髓鞘［23］。在SCI治療所涉及到的細胞類型中，SCs具有最長的移植歷史，被SCI治療領域廣泛認為是最有希望的再生脊髓軸突的移植細胞［23］，因為移植后SCs能在損傷部位產生多種有益因子，如增加神經營養因子、細胞粘附分子和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）等［24］。

SCs在SCI治療中可減少囊腔和膠質瘢痕形成，保護神經，促進軸突再生和髓鞘形成，能夠有效改善后期功能［25］。然而，在單獨使用SCs移植時，發現功能恢復并不顯著，單純將SCs移植到SCI位點，由于存活率低，治療效果并不理想［26］。移植的SCs壞死和凋亡主要發生在早期，這可能和局部微環境的損害、低氧水平、M1型巨噬細胞介導的炎癥反應和細胞介導的免疫反應有關［27］。為了克服這些缺陷，人們發明了一些組合策略。例如，Moradi等［28］證明了利用BD Pura_Matrix多肽水凝膠結合SCs可以促進SCs的擴散和減少星形膠質細胞的數量，促進功能的恢復。結合神經營養因子和ChABC，SCs移植對SCI的修復作用更顯著［29］。

（二）嗅鞘細胞

嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植被認為是促進SCI后軸突再生和功能改善的最有希望的措施之一。OECs可通過鼻黏膜和嗅球組織活檢取得［30］。此外，OECs在為軸突再生創造積極的微環境、抑制膠質瘢痕形成和促進軸突再髓鞘化、重建神經組織以及消除神經元軸突釋放的抑制因子擴散等方面具有巨大潛力［31］。

實驗研究表明，SCI模型移植了OECs后，與對照組相比，接受OECs的大鼠術后功能恢復更為顯著［32］。Radtke等［30］將OECs移植到大鼠脊髓橫斷模型中，證明OECs移植提供了營養支持和橋接損傷部位，使軸突再生和髓鞘化，改善功能預后。與SCs相比，OECs能夠穿透膠質瘢痕這個屏障，功能預后更好［33］。雖然許多研究報告稱OECs有助于改善神經功能，但治療方法仍不一致，這種差異可能源于移植到受損部位之前不同的OECs群。

（三）激活巨噬細胞

免疫系統在保護身體組織以及修復受損組織中發揮重要作用。此外，研究表明炎癥反應可以同時具有促炎和抗炎成分［34］。促炎表型參與對抗感染、清除死亡和垂死的細胞以及修復傷口。抗炎表型與早期炎癥反應密切相關［20］。

Kigerl等［21］的研究表明充分活化的巨噬細胞對SCI治療有積極作用。例如M2型巨噬細胞移植在不同的動物模型中可以支持神經保護和再生［19］。已有研究表明，激活巨噬細胞的移植可減少髓鞘相關糖蛋白，促進軸突再生和髓鞘形成［35］。另一項研究表明，神經干/前體細胞移植可降低經典M1型巨噬細胞的比例，改善受損脊髓功能［36］。為了研究巨噬細胞對球形細胞腦白質營養不良（globoid cell leukodystro_phy，GLD）的影響，Kondo等［35］通過雜交獲得巨噬細胞缺陷的小鼠模型，實驗結果表明巨噬細胞在GLD中的整體作用是促進髓鞘化、延長小鼠壽命以及減輕神經癥狀。

（四）成纖維細胞

成纖維細胞是組成結締組織和分泌ECM的細胞。這些細胞并不難獲得，而且在培養過程中很容易生長，這使得它們在細胞治療中具有很大的吸引力［37］。然而，除了膠質瘢痕外，SCI后形成的瘢痕也可以是纖維化瘢痕。SCI后成纖維細胞ECM分子的表達增加，分泌過度并沉積形成纖維化瘢痕，限制了軸突再生，CSPG就是這類ECM分子中的一種。但與膠質瘢痕相比，纖維化瘢痕對軸突的抑制作用不強［38］。目前在實驗室中使用到的成纖維細胞基因已被修飾改良或與其他治療策略聯合使用。

研究發現，改良后的自體成纖維細胞分泌的腦源性神經營養因子（brain_derived neurotrophic factor，BDNF）和神經營養素-3（neurotrophin_3，NT_3）可以促進貓SCI損傷部位少突膠質細胞增殖，軸突髓鞘形成以及行走功能的恢復［39］。此外，負載有成纖維細胞的Wnt海藻酸鹽支架的移植被認為能促進SCI后軸突再生和功能恢復［40］。另一方面，通過體外基因治療，將BDNF、神經營養因子（nerve growth factor，NGF）、NT_3經修飾的成纖維細胞導入早期脊髓受損部位，證實對成年大鼠模型軸突再生、病變腔減小、脊髓功能恢復有顯著作用［41］。

（五）神經干細胞

神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一種具有自我更新能力的多能干細胞，可從腦海馬室下區或脊髓中央管分離得到［42］。NSCs在脊髓損傷的細胞療法中具有重要地位，NSCs能夠分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，可替代損傷部位受損細胞［43］，同時還可分泌多種神經營養分子，減少細胞死亡，促進脊髓的恢復。此外，NSCs還能減少病變體積，抑制瘢痕組織形成，具有抗炎作用以及可促進電生理和運動功能恢復［43］。

SCI后，損傷部位的微環境可促使NSCs向星形膠質細胞分化，提示植入前NSCs可能需要進行預分化［44］。與NSCs不同的是，神經前體細胞可以直接分化為實驗所需要的神經元。實驗結果表明，混合前體細胞填滿空腔，修復受損部位［45］。此外，將經修飾改造表達綠色熒光蛋白的NSCs（green fluorescent protein_neural stem cells，GFP_NSCs）結合生長因子移植到大鼠脊髓橫斷模型中，實驗結果顯示，GFP_NSCs可分化成多種細胞，其中包括神經元，其軸突形成豐富的突觸，利于受損脊髓恢復［46］。

（六）胚胎干細胞

胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）具有無限增殖和分化成多種細胞的能力，體內外實驗都證明了ESCs能夠分化成特定的神經譜系，包括神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞［47］。移植后，這些干細胞不僅能夠補充丟失的細胞，還可為軸突再生提供營養支持，使存活的軸突再髓鞘化，并傳遞免疫調節、抗抑制因子，形成有助于功能恢復的中繼回路［48］。

Xie等［47］在體外培養4 d的胚體中加入維甲酸，對神經前體細胞的鼠ESCs（mouse ESCs，mESCs）進行預分化。他們的研究結果表明，電紡纖維支架與預分化前神經祖細胞mESCs的結合不僅促進了神經元的分化，而且限制了膠質瘢痕的形成。Iwai等［49］將ESCs源性的神經干/前體細胞（ESC_derived neural stem/progenitor cells，ESC_NS/PCs）移植到損傷14 d后的C5脊髓挫傷模型中，與對照組相比，植入ESC_NS/PCs可保留損傷部位的組織，促進軸突再生和血管生成，這些細胞治療使運動功能恢復且無致瘤性。

（七）骨髓間充質干細胞

實驗中使用的大部分骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來自于人類或嚙齒類動物。由于它們易于提取、培養，可用于自體移植，因此被廣泛應用［50］。最重要的是，BMSCs已被證明可以減少瘢痕組織和囊腔形成，保護軸突，增加對髓鞘的保留，最終使SCI動物模型的功能進一步恢復［50］。此外，BMSCs還可以誘導巨噬細胞向M2表型轉化，發揮抗炎作用，減輕SCI急性炎癥反應，改善功能預后［50］。

分泌神經營養因子的BMSCs結合支架可解決急性和繼發性損傷的問題，包括神經元缺失、軸突斷裂、膠質瘢痕屏障和炎癥反應［51］。NT_3基因修飾的BMSCs可抑制瘢痕形成，促進神經再生和運動功能恢復［52］。Zhao等［53］研究報道了能夠表達大腦多巴胺神經營養因子（cerebral dopamine neuro_trophic factor，CDNF）的轉基因BMSCs和正常的BMSCs治療SCI的對比研究，表達CDNF的BMSCs在病變部位具有很強的抗炎作用，通過抑制SCI后的炎癥反應，減少促炎細胞因子PGE2和IL_1β的產生，從而促進了運動功能和受損脊髓的恢復。

（八）誘導多能干細胞

誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通過將Oct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc等基因轉導到小鼠或人的成纖維細胞重新編程獲得，由于不涉及倫理問題，可能成為人類SCI治療的首選細胞來源［54］。此外，iPSCs具有分化為神經前體細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元和間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的能力［55］。這些細胞可以促進軸突再生、橋接病腔，并通過替換缺失的細胞或調節損傷部位的微環境而產生功能恢復［56］。

在大鼠脊髓中度挫傷模型中植入iPSCs源性少突膠質細胞祖細胞（iPS_derived oligodendrocyte progenitors，iPS_OPs）可減少空腔和瘢痕形成，減少小膠質細胞的數量［10］。此外，來自iPSCs的NSCs在小鼠脊髓椎板切除術模型中顯示出再髓鞘化的能力，并顯著改善運動功能［57］。后續研究發現人iPSCs分化的NSCs在損傷部位分泌神經營養因子，血管生成、髓鞘形成和重建神經通路，長期未見腫瘤形成。但是，iP_SCs也有其缺陷，如由人工誘導基因引起的遺傳/表觀遺傳異常和腫瘤形成，這些都需要在臨床使用前加以解決［58］。

五、用于細胞治療的神經營養因子

神經營養因子被認為是許多移植細胞的補充，可進一步優化細胞療法，在移植的細胞死亡后仍可發揮神經保護的作用［59］。通過移植相應細胞或基因過表達神經營養因子的細胞，這些機制都有助于增強細胞移植的功能。

目前神經生長因子（nerve growth factor，NGF）在SCI治療中被廣泛應用。然而，NGF也有其缺點，如理化性質不穩定等［60］。有研究表明NGF在周圍神經系統（peripheral nervous system，PNS）神經元的存活和成熟中發揮重要作用，有報道稱NGF可改變神經膠質表型，提高神經元的存活率，促進軸突再次生長［60］。此外，NGF也有局限性，NGF在脊髓中的表達誘導痛覺軸突，引起痛覺過敏，可導致嚴重的疼痛［60］。有研究［61］報道慢病毒介導的水通道蛋白-4抑制可以增加NGF的表達，最終改善了SCI大鼠的運動功能。

BDNF在SCI后的不同神經元群中具有軸突再生、神經發生保護、再髓鞘化、突觸再次形成以及突觸傳遞等功能［62］。研究表明，將BDNF和NT_3基因導入SCI部位可促進局部軸突生長，并可顯著減少遠端軸突斷裂引起的大錐體神經元萎縮［63］。在嚙齒類動物模型的進一步研究表明，分泌BDNF的MSCs將進一步促進SCI后的功能恢復［64］。然而，還有研究表明［65］BDNF增加皮質區域脊髓運動神經元的存活，但不促進皮質脊髓束（corticospinal tract，CST）軸突的生長。

NT_3在發育中的脊髓運動神經元中的表達顯著增加。然而，由于NT_3的蛋白質含量較低，它的鑒定很具有挑戰性［66］。此外，NT_3可以促進神經元的存活［67］。將表達NT_3的細胞移植到受損部位表明CST在短距離內生長［68］。使用NT_3的另一個優點是它繞過了與疼痛相關的靶區，因此不會引起疼痛或痙攣等副作用。

研究證明，在小鼠模型中植入睫狀神經營養因子（cili_ary neurotrophic factor，CNTF），可對CNS和PNS起到神經保護和修復的作用［69］。此外，CNTF可以促進神經元的發育和斷裂軸突的存活率［70］。多項研究表明，CNTF聯合多種細胞治療比單獨使用CNTF更有效，因此，CNTF對受損神經元的治療可能需要其他類型細胞的參與［71］。如移植少突膠質前體細胞聯合CNTF可促進SCI后的髓鞘形成和功能恢復［72］。

成纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）在星形膠質細胞和神經元中均有表達，參與刺激軸突生長，促進血管形成，發揮炎癥細胞的抗炎作用和神經保護作用［34］。Le等［73］將bFGF植入膠原/明膠海綿支架中，然后將其植入失活的皮膚，實驗結果表明加速了血管的生成。

經研究證明膠質細胞源性神經營養因子（glial cell_de_rived neurotrophic factor，GDNF）可促進SCI后CNS和PNS的軸突再生［74］。此外，研究小組通過將人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）移植到絲素/藻酸鹽/GDNF（silk fibroin/alginates/GDNF，SF/AGs/GDNF）支架來模擬神經組織，結果顯示，hUCMSCs_SF/AGs/GDNF能顯著提高神經元的存活率，促進神經元的分化［74］。

六、結論與未來方向

（一）細胞療法是一種很有前途的治療神經再生的方法，已成為廣泛研究的熱點。細胞從分子到組織在不同的水平發揮重要的作用，如替換丟失的神經元和神經膠質細胞、分泌神經營養因子和抗炎細胞因子，刺激組織保留和血管再形成，重建神經通路，限制和填補損傷后的囊腔，促進軸突再生和再髓鞘化等。

（二）根據細胞的類型、時間和培養條件，即使是相似的細胞，最終結果也會有顯著差異。另一方面，關于移植干預時間方面，幾乎所有的研究都是在急性和亞急性情況下進行的，而對于慢性治療研究甚少。

（三）每種細胞的移植都有特定的風險，移植后的腫瘤形成是一個主要的風險。可以通過將細胞移植到壽命較長的大型動物上，通過長時間的觀察去評估其安全性。移植的另一個風險是增加了感染的概率。頸椎處的SCI發生后，全身免疫功能明顯降低，病人可出現嚴重的免疫抑制。因此，需要全面了解細胞治療的各種風險，以確保減少腫瘤和感染的可能性。

（四）SCI療法在未來臨床實踐中的應用可能包括多種策略的結合。例如，兩個或更多的細胞可以同時移植到SCI中去治療。常見的有分泌營養因子的細胞與可以彌補結構功能損傷的細胞相結合。除了細胞外，藥物遞送、基因治療和生物材料也可以幫助促進SCI后的軸突再生。結合不同的細胞治療策略，未來的實驗將在脊髓修復方面取得更大的成功。