柯薩奇病毒B4型VP1蛋白的生物信息學分析①

陳泳蓓，陸俏岑，何韻怡，陳柏希，吳 岳，劉洪波③

(桂林醫學院a.第二附屬醫院檢驗科；b.臨桂臨床醫學院，廣西 桂林 541199)

腸道病毒被認為是引起1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)的主要致病因素之一，其中以柯薩奇病毒B4型(CVB4)最為常見[1]。研究表明，CVB4感染與T1DM發病存在相關性，但CVB4致T1DM的機制仍未明確。1979年，Yoon等[2]從1名T1DM患者的胰腺組織中分離出CVB4，隨后在T1DM患者中發現了CVB4的結構蛋白VP1[3]。因此，認為VP1蛋白可能是CVB4引起T1DM的重要分子和CVB4功能和表位所依托的分子[4]。筆者以從胰島中分離得到的CVB4株的VP1蛋白作為研究對象，對其進行生物信息分析，預測其基本理化性質、相關功能結構以及B細胞線性表位，為腸道病毒引起T1DM的機制研究提供生物信息學基礎。

1 資料和方法

1.1 CVB4 VP1氨基酸序列獲取和生物信息工具

從NCBI數據庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載28條CVB4全長氨基酸序列，并以新發T1DM患者胰島中分離得到的CVB4 Tuscany株[3](登錄號為ABF19105.1)VP1蛋白為研究對象，利用Bioedit、DNAstar、B細胞線性表位預測在線服務器ABCpred(https：∥ webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC _submission.html)、免疫表位數據庫網站IEDB(http：∥tools.iedb.org/bcell/)以及生物信息學門戶ExPASy(https：∥www.expasy.org/proteomics)提供的多種在線工具對其進行分析[5]。

1.2 CVB4 VP1蛋白的基本理化性質分析

利用Bioedit對VP1氨基酸的組成進行分析。利用ProtParam預測VP1的分子組成、相對分子質量、等電點、消光系數、不穩定系數，以及在哺乳動物網織紅細胞、酵母和大腸桿菌中的半衰期等。

1.3 CVB4 VP1蛋白的結構功能和B細胞線性表位預測

以VP1為研究對象，應用SignalP進行信號肽分析；Tmpred和TMHMM進行跨膜螺旋預測；NetPhos分析磷酸化位點；MotifScan分析乙酰化位點；Net-NGlyc分析糖基化位點；TargetP和NetNES分析亞細胞定位；SMOPA和Predictprotein分析二級結構；利用ABCpred和IEDB對線性B細胞表位進行綜合預測，利用MEGA將預測到的表位序列與下載的28條CVB4全長氨基酸序列進行序列比對，分析表位保守性。

2 結果

2.1 CVB4 VP1 的氨基酸組成

應用Bioedit軟件對VP1的氨基酸組成進行分析發現，VP1由284個氨基酸組成，其中Ser 10.18%、Thr 9.12%、Val 7.37%，這3種氨基酸含量最多。見圖1。

圖1 VP1氨基酸組成

2.2 CVB4 VP1的理化性質

利用ProtParam工具預測，VP1蛋白的分子組成為C1410H2173N395O434S15，理論相對分子質量為32 083.05，等電點為8.31。若全部胱氨酸殘基以Cys形式形成二硫鍵，則其在水溶液中(A280 nm)的摩爾消光系數為46 090 L·mol-1·cm-1；若所有二硫鍵打開，其在水溶液中(A280 nm)的摩爾消光系數為45 840 L·mol-1·cm-1。若VP1的N端為Gly，在哺乳動物體外網織紅細胞中的半衰期為30 h，在酵母體內>20 h，在大腸桿菌內>10 h，其不穩定系數為46.20，屬于不穩定蛋白。

2.3 CVB4 VP1蛋白的功能相關結構

應用SignalP分析，提示VP1為非分泌性蛋白。應用Tmpred和TMHMM進行跨膜螺旋分析，發現VP1無跨膜螺旋結構。應用NetPhos分析，發現VP1有36個磷酸化位點。應用MotifScan分析，發現VP1無乙酰化位點。應用Net-NGlyc進行糖基化位點分析，顯示VP1有2個糖基化位點。應用TargetP進行亞細胞定位分析，提示VP1定位于線粒體。應用NetNES核定位分析，發現VP1無核定位信號。

2.4 CVB4 VP1蛋白的二級結構及抗原表位

應用SMOPA和Predictprotein在線工具對VP1蛋白進行二級結構分析，發現VP1的螺旋、折疊、轉角、無規則卷曲分別占29.82%、24.56%、10.18%、35.44%。運用Predictprotein分析，發現VP1的螺旋、折疊、無規則卷曲分別占8.77%、23.86%、67.37%。結合兩種方法的預測分析，可知螺旋和折疊是VP1蛋白的剛性支撐，無規則卷曲是VP1的主要結構，是VP1抗原表位存在的可能位置。

2.5 VP1蛋白的B細胞線性表位

應用ABCpred預測VP1蛋白的B細胞線性表位，以0.85為閾值，結果有10條肽入選(表1)。在線預測網站IEDB分析，得到VP1蛋白的β-轉角、表面可及性、柔韌性、抗原性、親水性等抗原表位數據(圖2)。綜合ABCpred預測和IEDB分析，推測B細胞線性表位較可能位于33～49、120～136、141～157、200～216、235～251位氨基酸區段。利用MEGA對這5條預測到的優勢表位序列進行型內保守性分析，顯示這些表位均具有較高的保守性，其中141～157、200～216位氨基酸區段在CVB4內完全保守，33～49、120～136、235～251位氨基酸區段均僅存在1個氨基酸突變。見圖3。

表1 ABCpred預測VP1的線性B細胞表位

A：β-轉角；B：表面可及性；C：柔韌性區域；D：抗原性；E：親水性圖2 IEDB分析VP1的抗原表位

圖3 MEGA分析優勢表位序列的保守性

3 討論

T1DM是一種受遺傳和環境因素共同影響的自身免疫病，以T細胞介導胰島β細胞損傷引起自身免疫破壞為特征。腸道病毒感染在T1DM發病中具有重要作用，特別是CVB4[6-7]。VP1是腸道病毒的結構蛋白，新發T1DM患者的胰島組織中能檢測出VP1蛋白，且其表達高于對照組[8]。提示VP1與T1DM發病可能存在相關性。本文以新發T1DM患者胰島中分離的CVB4 Tuscany株為研究對象，通過多種在線工具分析CVB4 VP1蛋白的基本理化性質，結構功能特征、B細胞線性表位以及其三維結構，直觀地顯示了CVB4 VP1蛋白的生物學信息，為CVB4致T1DM的相關研究提供數據參考。

腸道病毒結構蛋白VP1與酪氨酸磷酸酶IA-2存在相同序列“ALTAV”[9]。本研究中，28條CVB4全長氨基酸序列的比對結果也顯示了“ALTAV”序列在CVB4中完全保守。信息學分析發現，“ALTAV”只部分涵蓋了預測到的優勢表位33～49 aa(AVETGHTSQVDPSDTM)，并不在主要抗原表位上。提示CVB4通過分子模擬機制引起T1DM的可能性不高，但有可能是通過表位擴展，在持續感染過程中暴露了該隱匿表位，引起糖尿病性自身免疫反應；這需要構建克隆表達“ALTAV”序列，并利用NOD小鼠加以驗證[10]。二級結構分析顯示CVB4 VP1蛋白以無規則卷曲為主，無規則卷曲往往是蛋白質功能和構象的基本結構，同時B細胞線性表位也多位于無規則卷曲所在的位置。目前，利用生物信息學技術分析篩選腸道病毒B細胞線性表位的報道較多[11-13]，但關于CVB4鮮有報道。本研究利用ABCpred預測CVB4 VP1的線性B細胞表位，并通過免疫表位數據庫網站IEDB提供的多種在線工具分析了VP1蛋白β-轉角、表面可及性、柔韌性、抗原性以及親水性5個參數，最后獲得了5條保守的優勢線性B細胞表位，為后期疫苗開發提供參考。

CVB4的VP1蛋白可能在病毒感染胰島細胞過程中扮演重要的信號角色。亞細胞定位分析發現，CVB4 VP1存在線粒體定位信號，提示CVB4感染胰島細胞后，可能通過影響線粒體功能而導致胰島細胞死亡，引起T1DM的發生[14]。通過分析發現，CVB4 VP1蛋白存在多個磷酸化位點，而病毒的感染最重要的信號是一系列蛋白質的磷酸化[15]。提示CVB4在感染過程中，可通過對VP1特定位點進行磷酸化，從而開啟或關閉下游的一系列信號，引起胰島細胞死亡。

CVB4引起T1DM的機制尚未明確，本研究利用多種在線分析工具對CVB4 Tuscany分離株VP1蛋白進行了一系列分析，這些分析結果將有助于研究腸道病毒致T1DM的作用及機制。