外源褪黑素緩解奶(水)牛熱應激的研究進展

王子晨 林 峰 高騰云 劉深賀

(河南農業大學動物科技學院，鄭州 450046)

夏季牛場面臨嚴峻的熱應激問題，導致產奶量、奶品質、采食量、繁殖力下降，免疫功能受損，生理機能障礙，造成代謝疾病和蹄病多發，使牧場的經濟效益下降[1-3]。據統計，熱應激造成美國每年奶牛業損失達8.97億～15.00億美元[4]，是限制養牛業發展的重要因素。基于此，牧場多采取3種措施緩解熱應激：1)物理降溫，如安裝水簾、噴淋設備以及通風、遮陰設施，從而改善牛場環境[5];2)營養調控，主要是在飼糧中補充中草藥、氨基酸類、維生素和微生態制劑等添加劑[6];3)培育耐熱品種，雖能夠從根源上降低熱應激帶來的經濟損失，但周期較長[7]。由于熱誘導下細胞功能受損的主要因素是引起氧化應激反應，研究者應用多酚、視黃醇、蝦青素、維生素E和褪黑素(melatonin,MT)等抗氧化劑來降低熱應激引起的細胞凋亡[8-9]。有研究發現褪黑素在清除自由基方面比谷胱甘肽更有效，甚至是維生素效果的2倍[10]。

MT又稱為抑黑素、松果腺素，作為色氨酸衍生物，首次在脊椎動物的松果體中被發現，后陸續在胃腸道、胎盤、卵巢、視網膜和皮膚中被發現[11]。MT廣泛參與機體生理活動，是季節性繁殖和晝夜節律的重要調節因子，與免疫調節、腫瘤發生、神經內分泌調節、清除自由基、抗氧化和延緩衰老等密切相關[12]。MT及其代謝產物作為一種強效的內源性自由基清除劑和抗氧化劑，通過一系列抗氧化反應來清除活性氧(reactive oxygen specie,ROS)，從而防止自由基介導的氧化應激損傷[13]。天然來源的MT安全可靠、價格便宜、易提取、半衰期短且毒副作用小[14]，對其功能和作用機理的深入研究，將為畜牧工作者對緩解奶(水)牛熱應激的研究工作提供新思路。

1 外源MT緩解奶(水)牛熱應激

1.1 奶牛熱應激

我國奶牛多為北歐的荷斯坦牛，繁殖力低下和奶品質下降等難題在夏季熱應激期間尤為突出[15]。奶牛熱應激通常用溫濕度指數(temperature humidity index,THI)作為評價指標，隨著奶牛產奶量的提高，THI閾值已從72降為68，高于此值時奶牛出現熱應激反應[16]。輕度熱應激引起奶牛直腸溫度與呼吸頻率升高，奶牛生理狀況、采食量、免疫能力和健康狀況下降，最終導致奶?；疾÷噬遊17]。Lecchi等[18]指出熱應激導致ROS水平升高從而引起奶牛免疫抑制。因此，不同學者采用不同給藥方式，在夏季應用MT進行了奶?？篃釕し椒ǖ难芯?表1)。

表1 外源MT緩解奶牛熱應激的應用效果

MT能夠緩解熱應激對奶牛繁殖性能產生的負面影響。史建民等[20]研究MT在荷斯坦奶牛體內的分泌規律及代謝速度，發現皮下注射和靜脈注射時血液MT含量最高。皮質醇含量與母牛卵母細胞質量有關，在熱應激條件下血清皮質醇含量升高，補充MT后能夠抑制這種變化并提高孕激素含量[21]。此外，皮下注射MT，降低了奶牛死胎率、妊娠損失和繁殖障礙綜合征，提高了情期受胎率、產后首次配種受胎率[18]。Garcia等[22]對熱應激牛進行皮下埋植MT，同樣使奶牛妊娠損失和繁殖障礙綜合征下降，并降低了死胎率、難產率和流產率。

目前，MT緩解夏季熱應激奶牛相關的生理指標數據較少見報道，對不同動物生長性狀的影響結果也并不一致[21]。MT更多地被應用于提高夏季奶牛場熱應激奶牛的泌乳潛能。MT作為抗氧化劑具有殺菌作用，可增強機體免疫活性的能力，MT的應用能夠提高奶牛產奶量和奶品質，治療乳房炎、酮病和酸中毒[23]。白細胞數量和免疫球蛋白含量是判斷熱應激奶牛免疫能力的關鍵指標，研究人員對熱應激奶牛皮下注射MT后將其血液進行常規指標分析，發現皮質醇含量降低至正常范圍，血液中淋巴細胞、白細胞數量增加，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量升高，白蛋白含量、谷丙轉氨酶和乳酸脫氫酶活性也有所升高，最終牛奶體細胞數(SCC)降低[19,24-26]。SCC作為奶牛生產性能測定的重要指標用于衡量牛奶質量和乳房健康，SCC降低伴隨著乳脂率和乳蛋白率的升高，牛奶產量和營養價值提高[27-28]。由于口服MT的生物利用率較低，皮下埋植難以準確控制劑量[25]，所以研究中多應用皮下注射MT提高熱應激奶牛的產奶性能。相比易引起耐藥性和殘留物有害的抗生素，MT能更有效、安全和快速地降低SCC[18]。但連續注射MT引起的應激不容忽視，且夏季長時間的注射或許會增加奶牛注射處傷口感染機率。

1.2 水牛熱應激

水牛多棲居于炎熱潮濕的地帶，深色的皮膚和稀疏的毛發吸收大量太陽輻射，汗腺卻不發達，極易發生熱應激[29]。區別于奶牛，THI>75時水牛出現熱應激[30]。熱應激是水牛乏情的主要原因，在印度，水牛產后不發情率為20%～80%，并在夏季達到最高[31]。熱應激造成繁殖力低下是水牛產業發展的瓶頸，主要包括母牛受孕率降低、胚胎死亡率升高、公牛精子質量與活力降低[32-35]。因此，研究人員在夏季應用MT來進行水?？篃釕し椒ㄑ芯俊?/p>

高溫引起精子細胞的氧化應激，可以導致精子活力和活率降低，Ramadan等[34]對摩拉水牛皮下埋植18 mg/50 kg的MT后可以顯著改善這一狀況。對熱應激下的公牛而言，MT能夠清除ROS來提高精子活力，同時MT的使用改善了精液質量和精漿代謝產物，保護雄性生殖器官免受環境的氧化應激損傷，提高水牛非繁殖季節的繁殖力[35]。郭振偉等[36]在試驗中發現MT能夠有效緩解水牛卵母細胞氧化應激，促進孕激素的生成，促進促黃體激素和雌二醇的生成，提高卵母細胞的體外成熟率與體外受精的胚胎發育。外源注射MT引起血液中MT含量的升高，由此引起血漿促性腺激素釋放激素(GnRH)含量升高，促進卵泡生長和排卵[37]。有研究指出外源MT使血液中MT含量升高可能與抗氧化能力的提高呈正相關[38]。佟桂芝等[39]研究發現，MT的抗氧化能力輔助卵泡生長因子調節，降低了繁殖綜合征和妊娠損失的發生率，促進體外培養的牛胚胎質量和發育。外源MT緩解水牛熱應激的應用效果見表2。

表2 外源MT緩解水牛熱應激的應用效果

水牛作為單胎動物，季節性發情且性成熟晚，炎熱條件下發情特征不明顯，熱應激水牛發情持續時間縮短，生產上應用同期發情技術結合人工授精、超數排卵和胚胎移植從而提高生產效率[41]。D’occhi等[42]的研究中發現，在應用GnRH和孕酮進行同期發情前使用MT治療的水牛，其黃體功能增強，且維持妊娠能力提高。Ramadan等[33]在內控藥物釋放裝置(controlled internal drug release，CIDR)+馬絨毛膜促性腺激素(eCG)方案應用前添加MT，通過減少大卵泡的閉鎖增加了排卵卵泡的數量，使夏季熱應激水牛的受胎率升高至100%。不僅是水牛，高翔[38]對夏季乏情的西門塔爾牛應用誘導促排卵技術(Ovsynch方案)實施前采用MT治療，卵泡直徑增大，受孕率提高。MT通過恢復熱應激狀態下乏情水牛的發情周期，從而提高發情率和受孕率。在牛體外研究中MT的劑量多在10-6～10-9mol/L[36,40]，皮下埋植MT的劑量多為18 mg/50 kg[33,40]，然而MT的添加對牛抗熱應激的有益作用呈一定范圍的劑量依賴，不同的給藥方式效果比較以及與同期發情方案的最佳組合均有待進一步研究。

2 外源MT對熱誘導動物細胞損傷的保護機理

2.1 MT與氧化應激

近年來,隨著分子遺傳學發展，國內外對熱應激的研究深入到細胞水平。相比精液質量不佳，卵母質量下降是造成高溫季節牛繁殖力低的主要原因[43]。與此觀點一致，Sakatani等[44]無論使用哪種季節采集的奶牛精液，在高溫季節受孕率都較低。Li等[45]指出熱應激引起的氧化應激反應是危害細胞生理功能的主要因素。

MT主要通過3個途徑保護動物細胞免受熱應激誘導的氧化應激影響(圖1)：1)作為自由基清除劑，保持細胞中氧化還原水平和保護細胞免受自由基的損傷[46];2)通過結合MT受體間接作用于抗氧化酶[47]，以更好地保護機體免受自由基的氧化損傷;3)依靠其化學結構提供電子以及抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性[48]，Galano等[49]認為電子轉移是決定MT自由基清除活性的主要機制。

NOS：一氧化氮合酶nitric oxide synthase；Nrf-Ⅱ：核因子E2相關因子-Ⅱ nuclear factor erythroid 2-related factor-Ⅱ；GSH：谷胱甘肽glutathione；CytC：細胞色素C cytochrome C；Apaf-Ⅰ：凋亡酶激活因子-Ⅰapoptotic protease activating factor-Ⅰ；Bcl-2:B細胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2;Caspase-9:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 cysteine aspartic acid protease-9。

清除細胞內的ROS對牛卵母細胞成熟發育至關重要，MT通過清除ROS和NOS阻止氧化損傷可能是通過核因子E2相關因子-Ⅱ(Nrf-Ⅱ)抗氧化反應元件信號通路[50]。通過激活抗氧化基因，降低ROS水平、升高谷胱甘肽(GSH)的表達水平和活性。Reiter等[51]指出生理劑量的MT能夠促進GSH的大量生成，從而調節卵母細胞受精能力，提高奶(水)牛卵母細胞和胚胎發育質量。此外，MT促進抗凋亡基因B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因的表達，抑制促凋亡基因p53的表達，減少了熱誘導的細胞凋亡。在牛體細胞核移植胚胎[52]、豬卵母細胞[45]、綿羊卵母細胞[53]和小鼠顆粒細胞[54]等試驗中均有報道MT對細胞氧化應激的保護作用。Fu等[55]報道了外源性MT的補充保護了配子和羊早期胚胎的發育，減少了DNA、蛋白質和脂質免受ROS和自由基損傷。Papis等[56]的試驗在培養液中添加MT，減少了氧化應激，從而提高牛體外受精胚胎發育。

2.2 MT與內質網應激

熱應激下未折疊或錯誤折疊蛋白的積累會產生內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，并引起未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)[57](圖2)。內質網應激損害顆粒細胞功能，造成卵母細胞成熟延遲，損害受精和植入前胚胎發育，最終損害動物的繁殖效率[58-59]。Alemu等[57]研究結果顯示熱應激顯著增加了24 h培養的牛顆粒細胞內質網應激標記基因葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)和葡萄糖調節蛋白94(glucose regulated protein 94，GRP94)的表達。

Melatonin:褪黑素；ER stress: 內質網應激 endoplasmic reticulum stress;UPR: 未折疊蛋白反應 unfolded protein response; GRP78: 葡萄糖調節蛋白78 glucose regulated protein 78;Caspase-12: 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12 cysteine aspartic acid protease-12;Bcl-2:B細胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2;PERK-eIF2A：蛋白激酶樣內質網激酶-真核啟示因子2α protein kinase-like ER kinase-eukaryotic translation initiation factor 2 alpha；ATF6：活化轉錄因子6 activating transcription factor 6；IREⅠ-XBPⅠ：肌醇需求酶Ⅰ-盒結合蛋白Ⅰ inositol requiring enzyme Ⅰ-X-box binding protein-Ⅰ；CHOP：C/EBP同源蛋白C/EBP homologous protein；calpain：鈣蛋白酶；Caspases：細胞凋亡蛋白酶；Apoptosis：細胞凋亡。

MT可以影響內質網中抑制蛋白合成的蛋白折疊和降解途徑，通過ER伴侶GRP78和蛋白激酶樣內質網激酶-真核啟示因子2α(PERK-eIF2A)、活化轉錄因子6(ATF6)、肌醇需求酶Ⅰ-盒結合蛋白Ⅰ(IREⅠ-XBPⅠ)3種跨膜蛋白結合影響下游基因的表達，而MT對UPR通路的影響體現于它調節細胞凋亡的能力[59]。MT抑制熱休克蛋白的表達，再通過細胞凋亡途徑下調促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid opalase-3，Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine aspartic acid opalase-12，Caspase-12)的表達水平，阻止熱誘導的細胞凋亡同時維持細胞穩態[60]。Hassan等[60]指出熱休克蛋白與家畜的耐熱性以及奶牛斷奶體重、繁殖力和疾病易感性均相關。在小鼠的卵母細胞成熟和胚胎發育過程中，MT可有效抵抗熱應激引起的內質網應激[61]。Park等[62]的試驗中證實了MT在豬卵母細胞體外培養過程中可調節UPR信號通路從而降低內質網應激。賈甜甜等[50]研究發現MT的使用作為內質網應激抑制劑可恢復受熱應激影響的牛卵母細胞成熟。盡管許多研究已經報道了MT在緩解熱應激中的重要作用，有關內質網應激在牛產業上的詳細機制有待深入研究。

3 小結與展望

近幾年MT提取方法升級，利用化學合成方法制備MT的工藝較成熟,純度高,生產成本大大降低，基于MT生物功能的多樣性，MT應用于奶(水)牛抵抗熱應激的研究不斷發展，但局限于試驗階段，諸多問題有待解決，如MT的給藥方式和有效濃度有待進一步探究，長期使用的安全性、對奶(水)牛的生殖生理功能和機體健康的不利影響有待進一步確定。隨著科研人員致力于MT作用機制的研究，MT正確安全的應用于養牛業抗熱應激方面指日可待。