G C指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計分析篩選基酒評級關(guān)鍵化合物

許 濤，劉青茹，鄭 蕾，劉光錢，張 芮，王松濤，沈才洪，張曉娟

（1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214000）

瀘（濃香）型大曲酒是多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)、酒醅蒸餾、分段摘酒等系列工序嚴格配合所得[1-2]。雖然基礎(chǔ)酒所用釀造原料和生產(chǎn)工藝大致相同，但固態(tài)發(fā)酵影響因素眾多[3-5]，每窖甚至每甑所產(chǎn)的基礎(chǔ)酒在感官、風格特征方面存在一定差異[6]。因此，依據(jù)等級、風格等對其進行定級分類對于后續(xù)酒體設(shè)計和產(chǎn)品生產(chǎn)至關(guān)重要。然而，目前分類定級仍多采用傳統(tǒng)感官評定的方式，按照評判標準以色、香、味、格進行綜合評價。

白酒中1 %～3 %的微量成分主要包括醇類、酸類、酯類、醛酮類化合物等[7]，它們的組合決定了酒體的風格和品質(zhì)[8-11]，例如，醇類主要表現(xiàn)出柔和的刺激感和微甜、濃厚的感覺，有時也會賦予酒體一定苦味；酯類是含量最多的一類，主要表現(xiàn)為微甜、略帶澀味，并有一定刺激感，有些表現(xiàn)出苦味，瀘型酒中酯類主要是乙酯類物質(zhì)，大多表現(xiàn)為水果的芳香；酸類是重要的呈味物質(zhì)，有促進新酒老熟，增長后味、消除苦味、雜味和抑制掩蔽香氣的作用；醛酮類主要賦予酒體刺激感或辛辣感，同時也有促香或提香效應(yīng)。因此，通過氣相色譜（GC）采集基礎(chǔ)酒中呈香呈味物質(zhì)的組成與含量特征，以其指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計分析能夠從數(shù)字化信息層面為基礎(chǔ)酒定級分類提供科學(xué)支撐[12-14]。此外，此方法標準化程度高、信息豐富、便于推廣和應(yīng)用。

本試驗以專業(yè)的傳統(tǒng)感官評定方式為分類定級參照，通過氣相色譜法采集六類新收儲濃香型白酒基酒的色譜數(shù)據(jù)，按保留時間一致的原則進行共有峰匹配后利用中位數(shù)法構(gòu)建了6類不同等級濃香型白酒基酒的標準指紋圖譜。利用偏最小二乘法-判別法（PLS-DA）建模，分析影響基礎(chǔ)酒分類定級的因素。以探討基礎(chǔ)酒中揮發(fā)性組分對目前基礎(chǔ)酒定級體系的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：樣品為瀘州老窖每日收儲的新基礎(chǔ)酒。共計36個酒樣。所取酒樣均由專業(yè)的品評人員進行感官評定。定量分析時，以無水乙醇配制含2 %vol叔戊醇、2 %vol乙酸正戊酯與2 %vol 2-乙基正丁酸的3種內(nèi)標混合液，然后按照定容體積10 mL酒樣，添加0.1 mL內(nèi)標液混勻即可供進樣。

儀器設(shè)備：便攜式酒度計，Agilent 6890 GC儀，F(xiàn)ID檢測器；數(shù)據(jù)處理采用Agilent 6890工作站；檢測器與進樣口的溫度均為250 ℃。Agilent 5975I GC-MS，EI源，離子源溫度180 ℃，接口溫度200 ℃，電離電壓70 eV。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

根據(jù)文獻修改[8]，色譜柱為DB-Wax毛細管柱，柱長60 m，內(nèi)徑0.25μm。升溫程序：初始柱溫為30 ℃，保持6 min，以2.5 ℃/min升溫至40 ℃，再以5 ℃/min升溫至100 ℃，然后以10 ℃/min升溫至200 ℃，再以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持10 min。載氣為高純氮氣，流速為1.6 mL/min。進樣口溫度為230 ℃，采用分流模式進樣，分流比為40∶1。檢測器為FID檢測器，溫度為250 ℃。進樣量為1 μL。

1.2.2 感官評定

3名省級嘗評員進行品評定級，將36個樣品分為6個等級。本實驗對6類酒樣的感官等級優(yōu)劣次序依次為：I類（A）、II類（B）、III類（C）、IV類（D）、V類（E）、VI類（G）。為便于PLS-DA分析，本實驗人工設(shè)置I類（A）=100～96分、II類（B）=95～91分、III類（C）=90～86分、IV類（D）=85～81分、V類（E）=80～76分、VI類（G）＜75分。

1.2.3 揮發(fā)性組分均值

采用共有模式圖譜[16]，中位數(shù)矢量法算法[17]，公式如下：

中位數(shù)矢量=median(X1j，X2j，……Xij，……Xnj)

式中，Xij為當?shù)趇個樣品的保留時間為j時的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 各類基礎(chǔ)酒酒精度

通過感官分析，對樣品進行了等級分類，得到了不同類別的基酒。這些基酒具有各自的不同風格，I類與II類主要風格特點為濃香和窖香好，III類與IV類主要為香味淡、味偏短澀，而V類與VI類以糧香好、味嫩雜為主要風格特點[15]，對不同類別基酒的感官品評標準見表1。

表1 各類基礎(chǔ)酒的感官品評語

6類不同類別基礎(chǔ)酒的酒精度見表2。從I類至VI類基礎(chǔ)酒酒精度有逐漸下降的趨勢。I類基礎(chǔ)酒酒精度最高在66 %vol～68 %vol之間。VI類基礎(chǔ)酒酒精度最低在60%vol～62%vol之間。與先前研究結(jié)果[15]高度一致，生產(chǎn)具有良好的穩(wěn)定性。

表2 各類別基礎(chǔ)酒平均酒精度

2.2 各類別基礎(chǔ)酒物質(zhì)組成類別分析

2.2.1 各類物質(zhì)總含量分析

糟醅在窖池的發(fā)酵過程不僅是產(chǎn)酒更是產(chǎn)酯生香的過程，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醇、酸、酯等化合物之間相互作用此消彼長最終達到動態(tài)平衡[18]。如圖1(a)、(b)所示，隨基礎(chǔ)酒等級降低，其總酸、總酯含量均整體呈現(xiàn)下降趨勢，其中第IV類基礎(chǔ)酒酸類物質(zhì)略有回升，而酯類物質(zhì)驟降。從圖1(c)可以看出，第V類基礎(chǔ)酒醇類物質(zhì)含量最高，第IV類基礎(chǔ)酒醇類物質(zhì)含量最低。醇類物質(zhì)總含量在6類基礎(chǔ)酒中從I類基礎(chǔ)酒至IV類基礎(chǔ)酒逐漸下降，V類和VI類基礎(chǔ)酒醇類物質(zhì)含量相對于I類至IV類基礎(chǔ)酒略高。第IV類基礎(chǔ)酒的酸醇酯總量最低，除第IV類基礎(chǔ)酒外，隨著基礎(chǔ)酒類別的降低其中酸醇酯的總量呈逐步減少趨勢。I類至III類基礎(chǔ)酒等級越高，其物質(zhì)組成越豐富；但等級降至第IV類基礎(chǔ)酒之后，物質(zhì)組成的豐富度并未與等級高低呈線性相關(guān)。

圖1 濃香型白酒不同類別基礎(chǔ)酒各類物質(zhì)總含量

計算各類物質(zhì)在酸醇酯總量中的占比可知（圖2），隨基礎(chǔ)酒等級降低，酸類物質(zhì)占比降低，醇類、酯類物質(zhì)占比增加。結(jié)合圖3醇類物質(zhì)的含量熱圖可知，第V類、第IV類基礎(chǔ)酒中雜醇油含量顯著增加。雜醇油既是白酒中醇甜和助香的主要物質(zhì)，又是形成香味物質(zhì)的前體，但除了正己醇、庚醇和苯乙醇微甜外，其余均呈苦味或澀味，含量過多不僅會使酒的感官呈辣、苦、澀味，影響酒的口感，而且對人體有毒害作用[19]。酸、酯占比降低，雜醇油占比增加影響基礎(chǔ)酒口感，導(dǎo)致其評級較低。

圖2 濃香型白酒不同類別基礎(chǔ)酒各類物質(zhì)占比

圖3 濃香型白酒不同類別基礎(chǔ)酒醇類含量

2.2.2 四大酯含量分析

己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯是濃香型白酒中的四大主要酯類物質(zhì)，四大酯類化合物之間的比例決定著白酒的所屬風格。

因此，研究四大酯類物質(zhì)在6類基礎(chǔ)酒中的含量可知（圖4(a)），I—IV類基礎(chǔ)酒中，己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯的含量均隨著等級降低而降低；第V類和第VI類中三者含量也隨等級降低而降低，但均高于第IV類。乳酸乙酯含量隨基礎(chǔ)酒等級的降低呈現(xiàn)先增后降再增再降的波動式變化。計算各組分占四大酯總量的百分比（圖4(b)）發(fā)現(xiàn)，隨著基礎(chǔ)酒等級的降低，己酸乙酯呈降低趨勢，乳酸乙酯呈增加趨勢，乙酸乙酯和丁酸乙酯變化不顯著。

圖4 濃香型白酒不同類別基礎(chǔ)酒四大酯含量及其占比

綜上所述，己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯總量中的比例（y）可作為基礎(chǔ)酒等級(x：1，2，3，4，5，6)評定的參考指標，其線性擬合方程如表3所示。

表3 己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯總量中的占比與基礎(chǔ)酒等級的線性關(guān)系

2.3 各類別基礎(chǔ)酒酒樣等級與揮發(fā)性組分相關(guān)性判斷

基礎(chǔ)酒酒樣色譜分析共測得66個組分，結(jié)果見表4。對基礎(chǔ)酒人工嘗評分類和基礎(chǔ)酒揮發(fā)性組分數(shù)據(jù)（表4）進行PLS-DA相關(guān)性判別分析，篩選出38個變量（VIP＞0.5）分別是：2-丁醇，甲醇，糠醇，正丙醇，正丁醇，丙酸，丁酸，己酸，壬酸，戊酸，辛酸，乙酸，異丁酸，異戊酸，丙酸乙酯，丁二酸二乙酯，丁酸乙酯，庚酸乙酯，己酸乙酯，己酸異戊酯，甲酸乙酯，癸酸乙酯，肉豆蔻酸乙酯，乳酸乙酯，戊酸乙酯，辛酸乙酯，乙酸乙酯，異丁酸乙酯，糠醛，2-丁酮，2-戊酮，3-羥基-2-丁酮，甲基異丁基酮，總酸，總酯，總酮和總醇（不含乙醇）。將6類基礎(chǔ)酒與38個變量進行PLS建模，通過PLS回歸分析建立的基礎(chǔ)酒分級與揮發(fā)性組分的相關(guān)性模型，分類變量的模型預(yù)測值與實測值的相關(guān)系數(shù)均達到了94.8 %（Comp1+Comp2+Comp3），說明模型的擬合性較好。同樣模型對組內(nèi)數(shù)據(jù)預(yù)測準確率達到98.5 %（Comp1+Comp2+Comp3）（表5），說明模型的建立是合理的并且具有很高的精度。

表4 基礎(chǔ)酒酒樣主要揮發(fā)性物質(zhì)(醇類)色譜分析結(jié)果 (mg/L)

續(xù)表4(一) 基礎(chǔ)酒酒樣主要揮發(fā)性物質(zhì)(酸類)色譜分析結(jié)果 (mg/L)

續(xù)表4(二) 基礎(chǔ)酒酒樣主要揮發(fā)性物質(zhì)(酯類)色譜分析結(jié)果 (mg/L)

由PLS-DA判別結(jié)果可以看到，向量（comp1/comp2）可以解釋基礎(chǔ)酒定級與揮發(fā)性組分的相關(guān)性為89.5%。其中總酸、總酯和除乳酸乙酯以外的其余乙酯類化合物對基礎(chǔ)酒定級呈正相關(guān)性。而乳酸乙酯，總酮，醇類中雜醇油總含量和糠醛等對酒的質(zhì)量呈負相關(guān)性。丁酸、戊酸、辛酸等酸類物質(zhì)對基礎(chǔ)酒中的II、III、IV 3類有較大影響。通過該方法可以有效的把不同類別基礎(chǔ)酒區(qū)分為I類，IIIIIIV類，VVI類3個聚類。

續(xù)表4(三) 基礎(chǔ)酒酒樣主要揮發(fā)性物質(zhì)(醛酮類)色譜分析結(jié)果 (mg/L)

續(xù)表4(四) 基礎(chǔ)酒酒樣主要揮發(fā)性物質(zhì)(烷烴、呋喃類)色譜分析結(jié)果 (mg/L)

表5 PLS模型擬合效果參數(shù)

圖5 1向量、2向量（comp1/comp2）上不同級別基礎(chǔ)酒與變量的PLS分析

3 結(jié)論

通過對濃香型白酒6種不同類別的基礎(chǔ)酒中的揮發(fā)性化合物進行檢測，其酒精度在60 %vol～68 %vol范圍內(nèi)，酸類、酯類、醇類物質(zhì)總含量分別為0.8～1.5 g/L、4～12 g/L和0.15～0.5 g/L。隨著基礎(chǔ)酒等級降低，酒精度、總酸、總酯含量均呈現(xiàn)下降趨勢，其中第IV類基礎(chǔ)酒酸類物質(zhì)略有回升、而酯類物質(zhì)驟降。I類至III類基礎(chǔ)酒等級越高，其物質(zhì)組成越豐富。酸、酯占比降低，雜醇油占比增加影響基礎(chǔ)酒口感，導(dǎo)致其評級較低。其中，四大酯含量與基礎(chǔ)酒等級存在較大相關(guān)性，己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯總量中的比例可作為基礎(chǔ)酒等級評定的參考指標，兩者的線性方程擬合度好，R2分別為0.9374和0.9905。

圖6 1向量、3向量（comp1/comp3）上不同級別基礎(chǔ)酒與變量的PLS分析

PLS-DA判別和PLS回歸分析方法應(yīng)用于基礎(chǔ)酒等級評定具有良好的模型擬合度（R2=94.8%）和預(yù)測精確度（準確率=98.5%），篩選出38個與基礎(chǔ)酒等級相關(guān)性較高的成分。此方法便于采集基礎(chǔ)酒指紋圖譜，且能夠聚焦關(guān)鍵化合物，所采用的多元統(tǒng)計分析方法便于推廣，對于其他白酒產(chǎn)品等級分類具有較好的借鑒意義。