骨髓血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤療效監(jiān)測(cè)中的價(jià)值

李 斌， 趙 冬， 黃 蓉， 郭娟蓀

（1.安康市中醫(yī)醫(yī)院血液風(fēng)濕科，陜西 安康 725000；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 延安 716000；3.安康市中心醫(yī)院感染性疾病科，陜西 安康 725000）

在我國(guó)，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）占惡性淋巴瘤的比例遠(yuǎn)高于霍奇金?。℉odgkin disease，HD）[1]。由于骨髓受累預(yù)示著NHL患者的治療效果較差，且骨髓受累也會(huì)阻礙造血干細(xì)胞的生成，因此對(duì)NHL患者骨髓受累的評(píng)估至關(guān)重要。目前，NHL骨髓受累的臨床診斷多采用骨髓穿刺活檢，但穿刺所取的小片骨髓不能完整反映整個(gè)骨髓的病理狀態(tài)，因此骨髓穿刺活檢有一定的局限性[2]。更重要的是，骨髓檢查只顯示NHL患者骨髓受累的結(jié)果，并不能反映腫瘤細(xì)胞入侵骨髓的情況。為了更好地預(yù)測(cè)NHL患者腫瘤細(xì)胞入侵骨髓的風(fēng)險(xiǎn)，臨床亟需尋找一種新的生物標(biāo)志物。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種促血管生成的細(xì)胞因子，可通過(guò)增加血管通透性刺激新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，在血管生成中起重要作用[3]。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是NHL的常見(jiàn)類(lèi)型之一，有研究結(jié)果顯示，VEGF有望成為新的DLBCL臨床診斷標(biāo)志物[4]。目前，大部分研究在檢測(cè)DLBCL患者VEGF水平時(shí)所用的樣本為血清，由于在收集患者外周血時(shí)會(huì)發(fā)生凝血現(xiàn)象，此時(shí)血小板（platelet，PLT）會(huì)釋放VEGF，導(dǎo)致血清VEGF水平升高。為此，本研究擬探討骨髓VEGF水平在DLBCL療效監(jiān)測(cè)中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年1月—2016年1月來(lái)安康市中醫(yī)醫(yī)院接受治療的DLBCL患者40例（男22例、女18例，年齡26～80歲），其中臨床分期Ⅰ期4例、Ⅱ期10例、Ⅲ期7例、Ⅳ期19例。40例DLBCL患者中有8例發(fā)生骨髓侵入，32例未發(fā)生骨髓侵入；有18例發(fā)生結(jié)外侵入，22例未發(fā)生結(jié)外侵入。美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（the Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評(píng)分0分15例、1分22例、≥2分3例；國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognosis index，IPI）評(píng)分0～1分10例、2分11例、3分12例、4分7例。所有患者均采用利妥昔單抗聯(lián)合CHOP方案（環(huán)磷酰胺、吡柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松）治療6個(gè)療程。本研究獲得安康市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)骨髓穿刺活檢和全血細(xì)胞計(jì)數(shù)確診為DLBCL，無(wú)其他臟器衰竭，無(wú)相關(guān)惡性腫瘤、自身免疫疾病及器官移植病史，由患者本人或直系親屬簽署知情同意書(shū)，同意提供患者的詳細(xì)資料。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并心、肝、脾、肺、腎等器官損傷者，既往存在乙醇依賴(lài)或毒品依賴(lài)者，未簽署科研研究知情同意書(shū)者。

1.3 療效評(píng)價(jià)

采用Cheson標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效[5]。（1）完全緩解（complete response，CR）：所有的病灶證據(jù)均消失；（2）部分緩解（partial response，PR）：可測(cè)量病灶縮小，無(wú)新病灶；（3）疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：未達(dá)CR、PR或疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）；（4）PD：出現(xiàn)任何新增加的病灶或原病灶直徑增大≥50%。根據(jù)療效將所有患者分為治療有效組（28例）和治療無(wú)效組（12例）。CR和PR為治療有效，SD和PD為治療無(wú)效。

1.4 方法

參照文獻(xiàn)[6]采集患者治療后骨髓樣本，1 006×g離心10 min，分離骨髓中的血漿，-80 ℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)骨髓VEGF水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。采用RT7200全自動(dòng)血液分析儀（深圳雷杜公司）及配套試劑檢測(cè)骨髓PLT。采用速率法檢測(cè)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），試劑盒購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，檢測(cè)儀器為AU2700全自動(dòng)生化分析儀（日本奧林巴斯公司）。計(jì)算VEGF/PLT比值。

1.5 隨訪(fǎng)

臨床醫(yī)師通過(guò)門(mén)診復(fù)查病例資料和電話(huà)隨訪(fǎng)獲取相關(guān)信息，隨訪(fǎng)至患者死亡或2019年1月31日?；颊邚拈_(kāi)始接受治療到觀(guān)察到疾病發(fā)生進(jìn)展或任何原因?qū)е碌乃劳鲋g的時(shí)間為無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（progression free survival，PFS），治療開(kāi)始至死亡或末次隨訪(fǎng)日期為總生存時(shí)間（overall survival time，OS）。本研究隨訪(fǎng)時(shí)間為13～58個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為36.2個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)1＜理論數(shù)＜5時(shí)采用χ2校正檢驗(yàn)，當(dāng)理論數(shù)＜1時(shí)采用Fisher確切概率法。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估各參數(shù)間的相關(guān)性，采用非線(xiàn)性相關(guān)性分析評(píng)估非等級(jí)相關(guān)資料的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析，確定影響患者OS和PFS的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床病理參數(shù)DLBCL患者之間VEGF、PLT計(jì)數(shù)及VEGF/PLT比值的比較

年齡≥65歲、ECOG評(píng)分≥2分、IPI評(píng)分>3分、治療無(wú)效的DLBCL患者骨髓VEGF水平分別高于年齡＜65歲、ECOG評(píng)分＜2分、IPI評(píng)分≤3分、治療有效的DLBCL患者（P＜0.05），PLT計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腫瘤細(xì)胞未侵犯骨髓的DLBCL患者PLT計(jì)數(shù)高于腫瘤細(xì)胞侵犯骨髓的DLBCL患者（P＜0.05），骨髓VEGF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。年齡≥65歲、腫瘤細(xì)胞侵入骨髓、IPI評(píng)分>3分、治療無(wú)效的DLBCL患者VEGF/PLT比值分別高于年齡＜65歲、腫瘤細(xì)胞未侵入骨髓、IPI評(píng)分≤3分、治療有效的DLBCL患者（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)DLBCL患者之間骨髓VEGF、PLT計(jì)數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

表1 不同臨床病理參數(shù)DLBCL患者之間骨髓VEGF、PLT計(jì)數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

病理參數(shù) VEGF/（pg/mL） PLT計(jì)數(shù)/（×106/mL） VEGF/PLT比值/×10?6 pg性別男性 542.25±125.23 225.65±22.56 2.74±0.16女性 559.65±124.62 256.52±22.59 2.21±0.12 P值 0.85 0.16 0.55年齡＜65歲 335.65±56.59 254.62±26.36 1.62±0.15≥65歲 652.38±57.52 209.61±65.25 3.55±0.12 P值 0.03 0.33 ＜0.01臨床分期Ⅰ～Ⅱ 586.62±102.36 235.62±63.23 1.95±0.06Ⅲ～Ⅳ 526.34±112.63 240.11±66.59 3.05±0.14 P值 0.59 0.09 0.26 ECOG評(píng)分0～1分 552.64±128.62 236.52±36.58 2.26±0.08≥2分 1025.81±142.95 255.47±55.26 4.06±0.21 P值 0.03 0.52 0.16

續(xù)表1 ±s

續(xù)表1 ±s

病理參數(shù) VEGF/（pg/mL） PLT計(jì)數(shù)/（×106/mL） VEGF/PLT比值/×10?6 pg腫瘤細(xì)胞是否侵入骨髓侵入 542.16±102.65 135.26±70.23 4.68±0.33未侵入 561.03±115.26 244.52±81.26 2.99±0.15 P值 0.52 0.01 0.01是否有結(jié)外侵入結(jié)外侵入 574.26±148.26 225.62±61.02 3.32±0.52無(wú)結(jié)外侵入 456.38±106.38 245.32±52.16 1.65±0.41 P值 0.51 0.33 0.15 LDH＜700 IU/L 574.32±88.56 229.52±93.52 3.32±0.33≥700 IU/L 549.55±90.54 241.36±81.20 1.65±0.24 P值 0.52 0.62 0.33 IPI評(píng)分≤3分 456.29±105.87 254.32±36.59 1.85±0.15>3分 885.62±115.63 186.39±26.55 4.35±0.54 P值 0.02 0.15 ＜0.01治療反應(yīng)有效 406.35±125.33 286.62±35.84 1.62±0.23無(wú)效 956.32±156.34 182.34±40.12 3.95±0.52 P值 ＜0.01 0.19 0.01

2.2 DLBCL患者骨髓VEGF水平與PLT計(jì)數(shù)的相關(guān)性

DLBCL患者骨髓VEGF水平與PLT計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.33，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 DLBCL患者骨髓VEGF水平與PLT計(jì)數(shù)的相關(guān)性

2.3 治療有效與治療無(wú)效DLBCL患者骨髓VEGF水平、PLT計(jì)數(shù)及VEGF/PLT比值的比較

治療有效組VEGF/PLT比值低于治療無(wú)效組（P＜0.05），而骨髓VEGF水平、PLT計(jì)數(shù)2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 治療有效組與治療無(wú)效組骨髓VEGF水平、PLT計(jì)數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

表2 治療有效組與治療無(wú)效組骨髓VEGF水平、PLT計(jì)數(shù)及VEGF/PLT比值的比較 ±s

注：空白表示無(wú)此項(xiàng)。

組別 例數(shù) VEGF/（pg/mL） PLT計(jì)數(shù)/（×106/mL） VEGF/PLT比值/×10?6pg治療有效組 28 654.8±60.6 245.1±13.2 3.0±0.4治療無(wú)效組 12 661.4±48.1 252.0±11.1 3.4±0.7 t值 -0.334 -1.584 -2.293 P值 0.370 0.061 0.014

2.4 DLBCL患者的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)

按VEGF/PLT比值的均值分為＜3×10-6pg組和≥3×10-6pg組。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)結(jié)果顯示，VEGF/PLT比值＜3×10-6pg組的PFS、OS高于VEGF/PLT比值≥3×10-6pg組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同VEGF/PLT比值DLBCL患者的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)

2.5 影響DLBCL患者PFS和OS的多因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，VEGF/PLT比值是影響DLBCL患者PFS的危險(xiǎn)因素[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）=3.277，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為2.276～5.901]；ECOG評(píng)分、IPI評(píng)分、骨髓VEGF水平是影響DLBCL患者OS的危險(xiǎn)因素（HR值分別為4.26、3.33、3.52，95%CI分別為3.102～5.466、2.257～5.009、2.620～4.104）。VEGF/PLT比值越大、ECOG評(píng)分越高、IPI評(píng)分越高、骨髓VEGF水平越高，DLBCL患者預(yù)后越差。見(jiàn)表3。

表3 DLBCL患者PFS和OS影響因素的多因素分析

3 討論

目前，臨床上治療DLBCL的主要方法是抑制腫瘤血管再生[6]。近幾年來(lái)，關(guān)于血管再生與造血系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究取得了一定的進(jìn)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血管再生對(duì)多種血液系統(tǒng)疾病都有重要的預(yù)后判斷價(jià)值[7-8]。VEGF是重要的促血管生成因子，能夠維持正常血管再生及成熟，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化及遷移[9]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生癌基因活化、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞增殖時(shí)，VEGF均可通過(guò)自/旁分泌方式特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞受體，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[10]。有研究結(jié)果顯示，VEGF水平高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[11-13]。VEGF在淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中具有重要的臨床價(jià)值[14]。柳曉雷[15]檢測(cè)了急性白血病患者和無(wú)骨髓浸潤(rùn)淋巴瘤患者的血漿及骨髓中的VEGF水平，發(fā)現(xiàn)急性白血病患者骨髓VEGF水平顯著高于血漿VEGF水平（P＜0.05），而無(wú)骨髓浸潤(rùn)的淋巴瘤患者血漿VEGF水平高于骨髓VEGF水平（P＜0.05），提示在不同腫瘤及血液系統(tǒng)疾病中，VEGF的作用機(jī)制不同。因此，有必要對(duì)VEGF在不同疾病中的價(jià)值進(jìn)行研究。

本研究除檢測(cè)骨髓VEGF水平外，還選擇PLT計(jì)數(shù)和VEGF/PLT比值作為骨髓VEGF表達(dá)的參照。主要原因在于骨髓富含造血細(xì)胞，骨髓中VEGF的來(lái)源不僅是腫瘤細(xì)胞，還可能包括血細(xì)胞，尤其是PLT。采用PLT計(jì)數(shù)校準(zhǔn)的VEGF水平比VEGF水平本身與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性更強(qiáng)[16]。在研究DLBCL患者的VEGF水平時(shí)引入PLT計(jì)數(shù)，可以從另一方面反映骨髓VEGF水平檢測(cè)的臨床價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，VEGF水平與PLT計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.33，P＜0.05），但r值較低。這是因?yàn)樵谡Ｇ闆r下，人體內(nèi)的VEGF主要由PLT分泌，但當(dāng)存在腫瘤時(shí)，腫瘤細(xì)胞也會(huì)分泌大量的VEGF，促進(jìn)血管生長(zhǎng)，以支持腫瘤的快速增殖。本研究結(jié)果顯示，年齡≥65歲、ECOG評(píng)分≥2分、IPI評(píng)分>3分以及治療無(wú)效的DLBCL患者骨髓VEGF水平較高，腫瘤細(xì)胞未侵入骨髓的DLBCL患者PLT計(jì)數(shù)較高，年齡≥65歲、腫瘤細(xì)胞侵入骨髓、IPI評(píng)分>3分以及治療無(wú)效的DLBCL患者VEGF/PLT比值較高，與KIM等[17]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，VEGF/PLT比值＜3×10-6pg組的PFS、OS高于VEGF/PLT比值≥3×10-6pg組（P＜0.05）。表明可將骨髓VEGF、VEGF/PLT比值判斷DLBCL預(yù)后的臨界值設(shè)為655 pg/mL、3×10-6pg，當(dāng)骨髓VEGF＜655 pg/mL、VEGF/PLT比值＜3×10-6pg時(shí)，DLBCL患者的預(yù)后相對(duì)較好。VEGF水平過(guò)高，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生，增加腫瘤高血源性和高淋巴源性擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)；VEGF/PLT比值偏大，提示VEGF水平過(guò)高或PLT數(shù)量偏少，不利于抗炎、止血、修復(fù)破損血管，有利于腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。

總之，骨髓VEGF水平與DLBCL患者預(yù)后有關(guān)。隨著研究的深入，關(guān)于VEGF在腫瘤中的作用機(jī)制以及VEGF基因和蛋白深層次的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將被一一揭示，骨髓VEGF水平或可為血管形成相關(guān)疾病的診斷和治療提供依據(jù)。