Middlebrook7H11斜面培養基分枝桿菌培養效果評價

錢雪琴， 盧洪洲

（1. 上海市公共衛生臨床中心檢驗醫學科，上海 201508；2. 上海市公共衛生臨床中心感染與免疫科，上海 201508）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性感染性疾病，分枝桿菌培養是診斷結核病的金標準。如何提高臨床樣本中分枝桿菌培養陽性率、縮短培養時間，是提高結核病防治效率的關鍵。培養基的選擇是影響培養陽性率和報陽時間的直接因素。目前，分枝桿菌培養常用的培養基分為液體培養基和固體培養基兩大類。液體培養基培養時間短，分枝桿菌培養陽性率高，但需要配備昂貴的檢測系統，我國基層醫院尚不具備廣泛使用的條件。固體培養基根據固化劑種類可分為以羅氏培養基為代表的雞蛋培養基和以Middlebrook7H11為代表的瓊脂固體培養基。目前，我國臨床實驗室主要使用的是羅氏培養基，Middlebrook7H11僅用于科研。國外關于以羅氏培養基為對照，使用Middlebrook7H11平板培養基分離分枝桿菌，再通過顯微鏡觀察結果的報道很多，但對于Middlebrook7H11斜面培養基的使用情況，國內外均鮮有文獻報道。本研究將不同類型臨床樣本分別接種于Middlebrook7H11斜面培養基和羅氏培養基，比較2種培養基分枝桿菌培養陽性率、污染率及報陽時間的差異。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2014年5月4日—7月3日上海市公共衛生臨床中心住院和門診患者各類臨床樣本599例，其中呼吸道樣本415例（痰液樣本374例、灌洗液樣本22例、支氣管刷取物樣本19例）、其他體液樣本159例（穿刺液樣本37例、尿液樣本29例、胃液樣本27例、胸腔積液樣本18例、膿性分泌物樣本18例、腦脊液樣本22例、引流物樣本5例、腹腔積液樣本3例）、糞便樣本21例、肺組織和骨髓樣本各2例。

1.2 病例分類

599例患者中，臨床擬診為陳舊性肺結核72例、肺結核41例、肺外結核65例、肺部感染167例、肺部陰影20例、淋巴結炎37例、艾滋病48例、肺癌和支氣管擴張等其他疾病149例。肺結核的診斷標準為：以病原學（包括細菌學、分子生物學）檢查結果為主，結合流行病史、臨床表現、胸部影像、相關輔助檢查及鑒別診斷等進行綜合分析作出診斷；以病原學、病理學結果作為確診依據；兒童肺結核的診斷除痰液病原學檢查結果外，還要參考胃液病原學檢查結果[1]。

1.3 培養基

Middlebrook7H11干粉培養基購自美國BD公司。（1）Middlebrook7H11斜面培養基配制。添加營養增強劑（油酸、牛血清蛋白、右旋糖苷、觸媒），每管7～9 mL，傾斜放置，凝固后放入冰箱避光冷藏保存，有效期為1個月。（2）Middlebrook7H11斜面培養基性能驗證。抽取2%～5%新批號培養基，（36±1）℃孵育，48 h后觀察是否有細菌生長，無培養物生長為無菌性測試合格；如果發現任何一支培養基有培養物生長，則將同一批次的所有培養基（36±1）℃孵育48 h，逐一檢查，棄去有細菌生長的培養管，將沒有培養物生長的培養管擰緊螺蓋保存備用；另取2管分別接種結核分枝桿菌H37Rv、胞內分枝桿菌進行生長試驗，挑取菌落至磨菌容器，加入無菌0.9% NaCl溶液1～2滴，研磨后加入0.9% NaCl溶液制備成0.5麥氏單位菌懸液；使用校準后的接種環或移液管取10 μL菌液進行接種，于35℃～37℃、5%～10% CO2環境孵育，培養21 d；21 d后有菌落生長，抗酸染色排除污染為試驗合格。標準菌株結核分枝桿菌（ATCC 27294）、包內分枝桿菌（ATCC 13950）購自上海市疾病預防控制中心。羅氏培養基由上海市疾病預防控制中心配送，批準文號為滬械注準20162400085。

1.4 方法

1.4.1 樣本處理 按照BACTEC 960全自動分枝桿菌培養系統（美國BD公司）操作手冊要求處理樣本。稀薄痰、灌洗液、支氣管刷取物、穿刺液等液態樣本用2% NaOH-N-乙酰半胱氨酸按1∶1比例處理；黏稠痰、尿沉渣、膿性分泌物等黏稠樣本采用NaOH與樣本按3∶1比例處理；糞便樣本取綠豆大小，加入蒸餾水10 mL，震蕩混勻后靜置15 min，取上清5 mL，加入3倍體積的NaOH處理。將處理后的樣本渦旋震蕩30 s，消化15～20 min，加含有100 U/mL青霉素的蒸餾水至50 mL，3 000×g離心15 min，棄上清，沉淀物加1 mL含有100 U/mL青霉素的蒸餾水混勻，待接種。

1.4.2 接種、培養 取0.1 mL處理后的臨床樣本，分別接種于Middlebrook7H11斜面培養基和羅氏培養基，置37 ℃溫箱培養，接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況，以后每周觀察1次，8周未見生長視為陰性。

1.4.3 結果分級報告 參照《結核病實驗室檢驗規程》[2]標準，以菌落生長不足斜面1/4為分枝桿菌培養陽性（X個菌落），菌落生長占斜面1/4為分枝桿菌培養陽性（1+），菌落生長占斜面1/2為分枝桿菌培養陽性（2+），菌落生長占斜面3/4為分枝桿菌培養陽性（3+），菌落生長鋪滿斜面為分枝桿菌培養陽性（4+），培養8周仍無菌落生長為分枝桿菌培養陰性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。采用χ2檢驗比較2種培養基分枝桿菌培養陽性率、污染率、陽性早出現例數的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種培養基培養結果比較

599例臨床樣本中，Middlebrook7H11斜面培養基培養陽性率為12.9%，羅氏培養基培養陽性率為12.4%，兩者聯合培養陽性率為15%。Middlebrook7H11斜面培養基培養陽性率稍高于羅氏培養，但差異無統計學意義（χ2=0.07，P>0.05）；羅氏培養基污染率高于Middlebrook7H11斜面培養基（χ2=4.67，P＜0.05）；同一樣本Middlebrook7H11斜面培養基培養陽性早出現1周的例數多于羅氏培養基（χ2=11.62，P＜0.01），陽性培養時間縮短1周；Middlebrook7H11斜面培養基同一樣本菌落數稍多于羅氏培養基，但差異無統計學意義（χ2=2.66，P>0.05）。見表1、表2、表3。

表3 2種培養基培養結果一致性比較 例

2.2 374例痰液樣本2種方法培養結果比較

347例痰液樣本Middlebrook7H11斜面培養基培養陽性率為12.6%，羅氏培養基培養陽性率為12.0%，兩者聯合培養陽性率為14.7%。Middlebrook7H11斜面培養基與羅氏培養基之間陽性率差異無統計學意義（χ2=0.05，P>0.05）。見表4。

表4 374例痰液樣本2種培養基培養結果一致性比較 例

2.3 不同疾病類型2種培養基陽性結果比較

所有類型疾病中，肺部陰影培養陽性率最高，其次為淋巴結炎及肺部感染，陳舊性肺結核陽性率最低。見表5。

表5 不同疾病類型2種培養基培養陽性結果比較

3 討論

分枝桿菌培養基分為液體培養基、固體培養基和液/固雙相培養基。Middlebrook7H9培養基為常用液體培養基。20世紀70年代發展起來的以Middlebrook7H9培養基為基礎的自動化培養系統，包括有放射性的BACTEC460培養體系和無放射性的MB/BacT Alert 3D、BACTEC Myco/Flytic、BACTEC MGIT 960、VersaTREK培養系統，通過測定細菌生長代謝來檢測分枝桿菌。BACTEC460培養體系由于存在放射性，已不再使用。其他商品化的液體培養檢測系統因儀器及試劑價格昂貴，基層醫院很少使用。與固體培養基相比，液體培養基提高了分枝桿菌檢出率。CRUCIANI等[3]對10項研究中分離自14 745例臨床樣本的1 381株分枝桿菌進行了Meta分析，發現MGIT系統的分析靈敏度為81.5%，而羅氏培養基的靈敏度為67%。SIMNER等[4]報道MGIT系統結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌（non-tuberculosisMycobacterium，NTM）平均報陽時間分別為10 d和14 d，Middlebrook7H11瓊脂平板培養時間分別為20 d和23 d。

固體培養基主要分為以雞蛋為基礎和以瓊脂為基礎的2類培養基。以雞蛋為基礎的培養基使用最廣泛的是羅氏培養基，具有很好的緩沖能力，可以保存較長時間（數月），培養基中所含的孔雀綠可抑制雜菌生長，不需要特殊的儀器，用于MTB培養效果較好，但牛分枝桿菌生長不佳，用丙酮酸鈉代替培養基中的甘油，可以促進牛分枝桿菌的生長。以瓊脂為基礎的培養基主要有Middlebrook7H11和Middlebrook7H10，其主要成分為瓊脂、有機化合物、氯化鈉、甘油和白蛋白，可用于分枝桿菌的分離培養和藥物敏感性試驗。Middlebrook7H11在Middlebrook7H10的基礎上進行了改良，通過添加0.1%的酪蛋白水解物，用于在Middlebrook7H10瓊脂上因苛養生長不良或異煙肼耐藥的MTB的培養[5]。瓊脂培養基最大的優點是培養基凝固后完全透明，當樣本被接種到含有該種培養基的平皿后，10～12 d就可以通過普通光學顯微鏡或解剖鏡觀察到MTB菌落生長，而羅氏培養基需要18～24 d才出現肉眼可見的菌落[6]；缺點是保存時間較短（1個月），過度加熱和光照會釋放甲醛，對分枝桿菌有毒性。

BATTAGLIOLI等[7]發現羅氏培養基分枝桿菌敏感性為76%，低于Middlebrook7H11平板培養基（8 6%）。I D I G O R A S等[8]以羅氏培養基為對照，應用顯微鏡觀察Middlebrook7H11平板培養結果，比較兩者陽性率及報陽時間，羅氏培養基培養陽性率為4.9%（265/5 438），Middlebrook7H11平板培養基陽性率為4.2%（227/5 438），兩者比較差異無統計學意義（P>0.05）；Middlebrook7H11平板培養平均檢出時間為12 d，而羅氏培養基平均檢出時間為23 d。本研究使用Middlebrook7H11斜面培養基，每周肉眼觀察，以出現針尖樣菌落后涂片抗酸染色陽性為標準，結果顯示Middlebrook7H11斜面培養基陽性率為12.9%，羅氏培養基陽性率為12.4%，兩者比較差異無統計學意義（P>0.05），與文獻報道[8]結果一致。本研究結果表明，Middlebrook7H11斜面培養基陽性最早檢出時間是11 d，中位時間是28 d，平均為31 d；羅氏培養基陽性最早檢出時間為12 d，中位時間為30 d，平均為31 d，與文獻[8]比較，陽性時間有所延長。本研究有12例樣本Middlebrook7H11斜面培養基陽性時間與羅氏培養基相比縮短1周。THARMALINGAM等[9]將107例涂片陽性樣本同時采用羅氏培養基和Middlebrook7H11平板培養基進行培養，其中106例在2種培養基上均生長；Middlebrook7H11平板培養后通過顯微鏡觀察結果，有51例（48.1%）樣本1周內發現有菌落生長，其余樣本2周之內全部發現有菌落生長；而羅氏培養基菌落最早生長時間為14 d，有12例（11.3%）樣本2周才開始有菌落生長，5周內有79例（74.5%）樣本有菌落生長。本研究使用Middlebrook7H11斜面培養基，2周內僅4例（5.2%）樣本有菌落生長，遠低于文獻報道[9]的結果。

本研究未采用Middlebrook7H11平板培養基進行培養，是基于分枝桿菌固體培養需要8周時間，考慮到平板培養基在培養過程中易干燥，顯微鏡觀察增加了生物安全的危險性和實驗室人員工作量，故將瓊脂培養基做成了斜面，肉眼觀察培養結果。本研究的局限性是樣本接種于培養基后，按照《結核病實驗室檢驗規程》[2]規定，第3、7天各觀察1次菌落生長情況，以后每周觀察1次，沒能做到每天觀察菌落，記錄的菌落生長時間可能要晚于實際菌落生長時間。考慮到臨床檢測工作與科研工作的差別，本研究的菌落生長時間僅代表臨床檢測工作中分枝桿菌生長時間。

本研究發現，Middlebrook7H11斜面培養基污染率（5.3%）低于羅氏培養基（8.5%），與文獻報道[5]一致。可能由Middlebrook7H11培養基成分相對簡單，一些苛氧菌生長不良所致。

目前，臨床實驗室中常用的雙相培養基包括Middlebrook7H11斜面/Middlebrook7H9肉湯和羅氏斜面/Middlebrook7H9肉湯。與固體培養基相比，雙相培養基可縮短分枝桿菌培養時間，提高培養的陽性率。 GHATOLE等[10]對雙相培養基（Middlebrook7H11斜面/Middlebrook7H9肉湯）與羅氏培養基進行比較，涂陽樣本雙相培養基陽性率為97.0%，報陽時間為（21.00±4.44）d；羅氏培養基陽性率為79.41%，報陽時間為（28.00±3.76）d；雙相培養基污染率較低（1.33%），對MTB的分離效果優于羅氏培養基。本研究僅使用了Middlebrook7H11斜面培養基，陽性率與羅氏培養基比較差異無統計學意義（P>0.05），報陽時間長于雙相培養基。

液體培養基可提高分枝桿菌培養陽性率，縮短培養時間。Middlebrook7H11平板培養后通過顯微鏡觀察結果，可顯著縮短分枝桿菌陽性檢出時間，但存在生物安全隱患、培養基易干燥、結果觀察步驟繁瑣等弊端。配制成斜面，可避免上述情況發生，但延長了報陽時間。與羅氏培養基相比，Middlebrook7H11斜面培養基對于一部分陽性樣本可提前1周報告病原菌結果。Middlebrook7H11斜面培養基和羅氏培養基在分枝桿菌培養中具有互補性，兩者聯合可提高分枝桿菌培養的陽性率，縮短部分樣本陽性報告時間。綜合文獻及本研究結果，我們認為理想的分枝桿菌培養組合為Middlebrook7H11平板培養基、羅氏培養基和MGIT 960 3種培養基聯合培養。