博來(lái)霉素誘導(dǎo)建立硬皮病模型小鼠的腸道受累情況分析研究▲

周雪艷 呂軍影

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧市 530021

硬皮病又稱系統(tǒng)性硬化癥，是一種以皮膚及各系統(tǒng)(特別是肺、心臟、腸道、骨骼肌和肌腱)膠原纖維硬化為特征的結(jié)締組織疾病。硬皮病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，患者常伴有多器官損害，5年生存率為50%，目前被認(rèn)為是不治之癥，是所有風(fēng)濕病中病亡率最高的疾病[1]。腸道是硬皮病患者最常累及的器官，約90%的硬皮病患者出現(xiàn)腸道癥狀[2-4]。硬皮病患者腸道并發(fā)癥主要表現(xiàn)為食管運(yùn)動(dòng)障礙、胃癱、小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)、結(jié)腸運(yùn)動(dòng)障礙和大便失禁等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)壓力和心理負(fù)擔(dān)。為探討硬皮病的發(fā)病機(jī)制、病理生理過(guò)程和治療手段等，學(xué)界就硬皮病進(jìn)行了較多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和探索，但建立的硬皮病動(dòng)物模型大多是模擬硬皮病的皮膚和肺部癥狀，而硬皮病腸道并發(fā)癥動(dòng)物建模的研究鮮有報(bào)道。為更好地研究硬皮病及其腸道并發(fā)癥，構(gòu)建一種與臨床吻合度高且便捷、穩(wěn)定、可復(fù)制的硬皮病腸道并發(fā)癥動(dòng)物模型，本研究采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)雌性BALB/c小鼠建立了硬皮病小鼠模型，并探討了小鼠腸道并發(fā)癥的病理特征，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠20只，SPF級(jí)，6～8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將小鼠飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，讓小鼠生活于安靜、恒溫、恒濕的環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)方案及操作經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)審查批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 注射用博來(lái)霉素磷酸鹽緩沖液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H20055883)； HE染色和Masson染色試劑(來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)免疫組化實(shí)驗(yàn)室)；OLYMPUS正置四色熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BX53)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將20只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組10只，用電動(dòng)剃毛器剃除小鼠背部中央?yún)^(qū)相同部位面積約2 cm×2 cm的被毛。在對(duì)照組小鼠背部脫毛區(qū)皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1 mL，1次/d；在模型組小鼠背部脫毛區(qū)皮下注射博來(lái)霉素磷酸鹽緩沖液(500 μg/mL)0.1 mL，1次/d。兩組小鼠均連續(xù)皮下注射4周[5]。注射結(jié)束后第2天開始,兩組小鼠禁食不禁水24 h，之后給予每只小鼠半固體營(yíng)養(yǎng)糊(黑芝麻糊與碳素墨水加水?dāng)嚢杈鶆颍涑杉s75 g的黑色糊狀物75 mL)0.5 mL灌胃，灌胃后20 min后脫頸處死小鼠。

1.2.2 模型處理和分析 (1)剪開兩組脫頸處死小鼠腹腔，用細(xì)線分別在胃賁門和幽門處結(jié)扎，迅速分離胃賁門處至回腸末端胃腸。輕輕剝離腸系膜后，輕輕將胃腸鋪直于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，避免用力拉扯，用尺子測(cè)量幽門到黑色半固體糊前沿的距離和幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)。(2)取兩組脫頸處死小鼠背部注射部位的皮膚、肺組織、結(jié)腸組織，放入10%多聚甲醛溶液中固定，脫水、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 小鼠一般情況 造模第4周開始，觀察比較兩組小鼠的活動(dòng)度、皮膚、毛發(fā)、體重、糞便等一般情況。

1.3.2 小腸推進(jìn)率 小腸推進(jìn)率=幽門至黑色半固體糊前沿的距離/幽門至回盲部全長(zhǎng)的距離×100%。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組小鼠背部注射部位皮膚、肺組織、結(jié)腸組織切片的結(jié)構(gòu)、炎性浸潤(rùn)情況、纖維化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠的一般情況比較 模型建立過(guò)程中無(wú)小鼠死亡。造模第4周，對(duì)照組小鼠精神良好，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食和飲水量正常，未見消瘦，背部注射區(qū)皮膚無(wú)硬化，毛發(fā)柔軟且有光澤，生長(zhǎng)迅速，大便形狀正常、量適中；模型組小鼠精神差，喜靜懶動(dòng)，厭食消瘦，背部注射區(qū)皮膚增厚變硬、彈性差且與皮下組織粘連，毛發(fā)未見生長(zhǎng)，大便干結(jié)、量偏少。

2.2 兩組小鼠的皮膚組織病理學(xué)比較 HE染色：對(duì)照組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，真皮下可見毛囊，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1-A)；模型組小鼠皮膚表皮棘層肥厚，真皮層明顯增厚，皮膚附屬脂肪層、肌肉層萎縮，周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1-B)。Masson染色：對(duì)照組小鼠皮膚膠原纖維未見明顯增生(見圖1-C)；模型組小鼠皮膚膠原纖維明顯增粗、膨大、數(shù)量增多、排列緊密、均質(zhì)化(見圖1-D)。

對(duì)照組(HE染色) 模型組(HE染色) 對(duì)照組(Masson染色) 模型組(Masson染色)

2.3 兩組小鼠的肺組織病理學(xué)比較 HE染色：對(duì)照組小鼠肺部結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔正常，無(wú)出血癥狀，支氣管壁和小血管壁厚度正常，無(wú)明顯細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象(見圖2-A)；模型組小鼠肺部結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，肺泡內(nèi)出血,小血管壁增厚，出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖2-B)。Masson染色：對(duì)照組小鼠肺間質(zhì)、肺泡和支氣管壁未見有藍(lán)色膠原纖維大量沉積(見圖2-C)；模型組小鼠肺間質(zhì)、肺泡和支氣管壁纖維性增厚，膠原束在肺泡或血管內(nèi)沉積，藍(lán)色膠原纖維明顯增多(見圖2-D)。

對(duì)照組(HE染色) 模型組(HE染色) 對(duì)照組(Masson染色) 模型組(Masson染色)

2.4 兩組小鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)比較 HE染色：對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體連續(xù)，結(jié)構(gòu)清晰，固有層無(wú)炎性浸潤(rùn)(見圖3-A)；模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞，腺體紊亂，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖3-B)。Masson染色：對(duì)照組小鼠結(jié)腸肌層未見細(xì)胞間結(jié)合部位裂縫減少及膠原浸潤(rùn)、纖維化病理改變(見圖3-C)；模型組小鼠結(jié)腸平滑肌萎縮，大量膠原浸潤(rùn)，纖維化改變(見圖3-D)。

對(duì)照組(HE染色) 模型組(HE染色) 對(duì)照組(Masson染色) 模型組(Masson染色)

2.5 兩組小鼠的小腸推進(jìn)率比較 模型組小鼠的小腸推進(jìn)率為(45.78±4.98)%，對(duì)照組小鼠的小腸推進(jìn)率為(62.13±9.00)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.027，P=0.000)。

3 討 論

硬皮病又稱系統(tǒng)性硬化癥，是一種慢性自身免疫性疾病，炎癥、血管病變和纖維化是其主要病理特征，最終可導(dǎo)致患者內(nèi)臟功能喪失。硬皮病患者除表現(xiàn)為皮膚纖維化外，還會(huì)影響肺、心、腎、血管和肌肉骨骼系統(tǒng)，其并發(fā)癥最易發(fā)生在腸道系統(tǒng)，結(jié)腸和肛門直腸區(qū)域受累者約占全部患者的50%～70%，主要表現(xiàn)為腸道動(dòng)力減弱、貧血、腸道出血甚至腸道穿孔，同時(shí)伴大便異常[6]。腸道穿孔具有致命性，是硬皮病患者病亡率較高的主要原因；排便功能的異常如便秘、難以控制的腹瀉等也會(huì)給患者的生活質(zhì)量和精神健康造成巨大影響[7]。硬皮病患者的腸道病變部位多發(fā)生在其固有肌層,表現(xiàn)為進(jìn)行性炎癥浸潤(rùn)，平滑肌萎縮、破壞，肌層組織膠原浸潤(rùn)和纖維化。目前硬皮病患者腸道并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制仍未明了，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒀芯恳殉蔀橛财げ』A(chǔ)研究的熱門課題[8]。

現(xiàn)有硬皮病動(dòng)物模型主要有誘導(dǎo)型(博來(lái)霉素誘導(dǎo)模型、活性氧簇性氧離子誘導(dǎo)模型、V型膠原重塑模型等)和基因型(Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠、TBRICA轉(zhuǎn)基因小鼠、Cre-ER轉(zhuǎn)基因小鼠、TβRII△k轉(zhuǎn)基因小鼠、Caveolin-1轉(zhuǎn)基因小鼠等)，模型動(dòng)物主要有鼠、雞、兔，其中鼠類模型的組織硬化與人類硬皮病的相似度較高。博來(lái)霉素誘導(dǎo)的硬皮病模型成本較低，重現(xiàn)性和維持能力較好，組織纖維化、膠原沉積、炎癥反應(yīng)方面的表現(xiàn)良好，是目前造模研究的主選模型。張瑞等[9]報(bào)道，博來(lái)霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠模型，其胃腸蠕動(dòng)減慢、便秘、腹瀉方面的表現(xiàn)與臨床上硬皮病患者表現(xiàn)的吻合度約為72%。為此，本研究采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)建立硬皮病小鼠模型，并對(duì)小鼠模型腸道并發(fā)癥的病理特征等進(jìn)行了觀察和分析，旨為建立良好的硬皮病胃腸并發(fā)癥動(dòng)物模型提供參考。

建模觀察分析結(jié)果顯示，硬皮病胃腸并發(fā)癥模型小鼠出現(xiàn)胃腸動(dòng)力減退、大便干結(jié)等癥狀；小鼠皮膚表皮棘層肥厚，真皮層明顯增厚，皮膚附屬脂肪層、肌肉層萎縮，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維明顯增粗、膨大、數(shù)量增多、排列緊密、均質(zhì)化；肺部結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，肺泡內(nèi)出血,小血管壁增厚，出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)、肺泡和支氣管壁纖維性增厚，肺泡或血管內(nèi)膠原束沉積，藍(lán)色膠原纖維明顯增多，微血管減少；結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞，腺體紊亂，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌萎縮，大量膠原浸潤(rùn)，發(fā)生纖維化改變；小腸推進(jìn)率明顯降低。結(jié)果提示，博來(lái)霉素誘導(dǎo)建立的硬皮病小鼠模型，可有效模擬臨床硬皮病患者的腸道并發(fā)癥，為硬皮病胃腸并發(fā)癥的深入研究奠定良好基礎(chǔ)。