遠紅外對黃曲霉孢子的殺滅效果及其機理研究

季萌萌，蔣婧，范柳萍,2*，李靜

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇 宿遷，223800) 3(百事美特食品宿遷有限公司，江蘇 宿遷，223800)

大米是我國主要糧食作物之一，每年全世界的糧食因霉變而造成的損失遠遠超過總產量的3%；其中黃曲霉及黃曲霉毒素污染危害最大，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的主要代謝產物[1]，毒性極強，具有致癌、致畸和致突變作用，被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)認定為 Ⅰ 類致癌物質，其污染水平受到各國嚴格控制[2]，嚴重威脅糧食安全和人類健康。

遠紅外輻照(far infrared irradiation，FIR)是一項熱技術，由于FIR范圍(3～1 000 μm)內的大多數入射輻射能量都在食品表面吸收，FIR適用于食品的表面加熱，且作為一種安全、非化學且快速的表面殺菌方法，被認為是常規化學消毒品如甲基溴的潛在替代品[3]。已有報道紅外輻照技術對谷物表面蠟狀芽孢桿菌[4]、中溫細菌[5]、嗜溫需氧菌[6]等細菌的殺滅作用，以及對谷物表面霉菌的滅活效果，劉其聳等[7]報道松花粉在遠紅外100 ℃加熱15 min或110 ℃加熱10 min 后，霉菌酵母數分別降低99.71%和99.73%；WILSON等[8]發現遠紅外處理在降低玉米水分含量的同時還能顯著減少表面霉菌總數；王蓓[9]報道新收獲的初始水分含量高于21.1% 的稻谷經遠紅外輻射至60 ℃,保溫120 min后水分去除率最高為5.3%，且黃曲霉孢子對數值可降低達8.3 lg CFU/g。

紅外線位于電磁波譜中的紫外線和微波之間，其殺菌機制類似于紫外線(DNA損傷)和微波加熱(感應加熱)，主要依靠熱效應及特征吸收[10]。目前認為遠紅外的熱效應會破壞微生物細胞中的DNA、RNA、核糖體、細胞包膜和蛋白質，但作用機理尚不清楚，且關于遠紅外對黃曲霉產AFB1能力的影響鮮有報道。本文以接種黃曲霉孢子的大米為原料，在紅外發射波長5～15 μm，以及前期確定遠紅外輻照最適條件115 ℃ 加熱5 min的條件下[11]，研究遠紅外輻照對大米表面黃曲霉孢子的殺滅效果以及對黃曲霉菌產AFB1能力的影響，同時測定其對黃曲霉孢子活力抑制率，觀察細胞結構、膜通透性及胞內蛋白的變化，旨在為遠紅外殺菌機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與培養基

黃曲霉菌AspergillusflavusCGMCC 3.4408，中國微生物菌種保藏管理中心；孟加拉紅培養基，國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基、產毒培養基，實驗室自制。

1.1.2 試驗材料

粳米(二級，含水質量分數14.31%)，上海祥森米業有限公司；AFB1標準品(純度≥99%)，以色列Fementek公司；碘化丙啶(propidium iodide, PI)、噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)，BD公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

遠紅外層式烘箱，上海熱麗科技集團有限公司研制；Waters e2695型高效液相色譜儀(配有熒光檢測器)，美國Waters公司；1510型全波長酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；DMi8型倒置生物熒光顯微鏡，德國Leica公司；XL-30型環境掃描電子顯微鏡，荷蘭Philips公司；MOS-450型圓二色譜儀，法國Biologic公司；1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜，賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；LHS-150HC-1型恒溫恒濕培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；MQD-S2R型振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；UltraScan Pro1166型高精度分光測色儀，美國Hunterlab公司；UV-2600型紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米樣品前處理

將已接種黃曲霉菌孢子的PDA培養基斜面試管置于28 ℃、濕度為70%的恒溫恒濕箱中培養7 d，用無菌生理鹽水沖洗斜面并收集孢子，過濾菌絲得到孢子懸液，用血球計數板調整孢子懸液濃度為106CFU/mL。

稱取適量大米，通過加入不同體積的孢子懸液配制不同含水率(moisture content，MC)的樣品，充分混勻，4 ℃放置24 h，使水分平衡，選取含水率為(30.05±0.33)% 和(20.11±0.16)% 的樣品作為試驗對象。

1.2.2 遠紅外輻照與黃曲霉孢子殺菌效率測定

設置2個對照組：含水質量分數分別為20%、30%但未經遠紅外輻照處理的大米樣品，表示為20%-對照、30%-對照；2個處理組：含水質量分數分別為20%、30%且經遠紅外輻照的大米樣品，表示為20%+FIR、30%+FIR；取水分平衡后樣品單層鋪設于托盤，置于遠紅外烘箱中，以115 ℃輻照處理5 min后蓋上蓋子并立即取出，放置冷卻室溫，分別收集對照組與處理組的大米樣品于不同無菌均質袋中，加入一定體積無菌生理鹽水，利用拍打式均質器均質2 min，洗脫大米表面黃曲霉孢子于均質液中，分別作為對照組和處理組均質液，每組實驗重復3次平行；

殺菌效率測定參考文獻[11]，用微生物對數降低值(lgS)表示。

1.2.3 遠紅外輻照黃曲霉孢子培養及AFB1提取

取1.2.2中對照組與處理組均質液等量分別于產毒培養基中，28 ℃，160 r/min條件下振蕩培養7 d，濾紙過濾收集發酵液和菌絲體，菌絲體以蒸餾水洗滌3次，55 ℃烘干至恒重，稱重得菌絲體干重；發酵液中AFB1提取參照文獻方法[11]，采用高效液相色譜-柱前衍生法測定；

單位菌體產毒量計算如公式(1)所示：

(1)

產AFB1抑制率與單位菌體產毒抑制率計算如公式(2)、公式(3)所示：

(2)

單位菌體產毒抑制率/%

(3)

1.2.4 遠紅外輻照黃曲霉孢子PI染色

處理組與對照組均質液于6 000 r/min離心10 min，除去上清液，沉淀物用PBS洗滌2次后重懸，調整濃度為106CFU/mL，與PI溶液以1∶10的體積比混勻，室溫靜置10 min，倒置生物熒光顯微鏡下觀察，激發波長為488 nm。

1.2.5 遠紅外輻照黃曲霉孢子掃描電鏡結果觀察

均質液6 000 r/min離心10 min，棄上清液，細胞沉淀物用PBS溶液洗滌2次后懸浮于10 mL PBS溶液中，加入預冷無菌的2.5%(體積分數)戊二醛溶液10 mL，4 ℃預固定0.5 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清液。參照蔡雪薛[12]的方法制備樣品，在15 kV發射場環境掃描電子顯微鏡下觀察孢子并拍照。

1.2.6 遠紅外輻照黃曲霉孢子活力測定

測定前配制MTT溶液：37 ℃溫浴溶解于0.01 mol/L、pH 7.4的PBS溶液中，質量濃度5 mg/mL，過濾除菌，置棕色小瓶中，4 ℃冰箱保存將均質液離心(6 000 r/min,10 min)棄上清液， PBS溶液洗滌2次后重新懸浮于PBS溶液中，調整孢子濃度為2×107CFU/mL。將100 μL孢子懸液加入96孔板中，加入25 μL MTT，28 ℃避光靜置孵育4 h 后加入150 μL 二甲基亞砜，以蒸餾水設置為空白組對照，酶標儀測定吸收波長在565 nm下的吸光度值。黃曲霉孢子線粒體膜上結合的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為藍紫色結晶甲瓚，甲瓚在565 nm下的吸光值與細胞活性成正比[13]，利用吸光值變化計算抑制率，計算如公式(4)所示：

(4)

1.2.7 遠紅外輻照黃曲霉孢子胞內蛋白質二級結構測定

均質液6 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入無菌水洗滌離心2次重懸于0.6 mL無菌水中，參照陶曉赟[14]的方法提取胞內蛋白。為研究紅外結合保溫過程對胞內蛋白質結構的影響，遠紅外115 ℃輻照含水質量分數為20%的樣品5 min后，在70 ℃下保溫15 min，并表示為20%+FIR+保溫。圓二色譜儀測定以蒸餾水為空白，掃描波長范圍為250～190 nm，掃描速度30 nm/min，掃描溫度25 ℃，重復3次，記錄圓二色譜(circular dichroism，CD)。采用SELCON3分析法分析數據。

1.2.8 數據分析

采用SPSS 19.0和 Origin 9.0對數據進行統計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 遠紅外輻照對黃曲霉孢子生長與產毒能力的影響

由前期研究可知[11]，遠紅外115 ℃處理5 min后，含水質量分數為30%和20%的大米表面黃曲霉孢子對數降低值分別為(2.96±0.28)lgS、(2.04±0.17)lgS。由表1可知，30%和20%含水質量分數大米遠紅外處理后，發酵液中AFB1總量分別下降63.34%和56.61%，單位菌體產毒量分別下降38.94%和27.64%。遠紅外輻照后，大米中黃曲霉孢子再培養時生長受到明顯限制，產毒能力受到顯著抑制(P<0.05)，且水分含量較高的大米在紅外處理后孢子損傷效果更為明顯。這是因為水分含量與水分活度呈正相關，有報道紅外加熱滅活細菌芽孢效果與IR加熱器的輻射光譜和初始Aw值有關[4, 15]；且報道谷物初始含水質量分數在4.98%～27%，熱效應滅活黃曲霉孢子的對數值隨水分含量的增加而升高[16-19]。

表1 遠紅外輻照對黃曲霉菌生長與產毒能力的作用Table 1 Effect of FIR on growth and toxin production ability of Aspergillus flavus

2.2 遠紅外輻照對黃曲霉孢子細胞膜的影響

PI是一種核酸結合的熒光探針，僅能穿透壞死細胞的細胞膜，致使胞核染色[20]。由圖1-a、圖1-b可知，遠紅外輻照前，黃曲霉孢子為活細胞，細胞膜完整，PI染料無法著色，而圖1-c、圖1-d中，處理后出現明顯紅色熒光，說明細胞膜被破壞，細胞核被染色。圖1-d中的熒光強度較圖1-c的熒光強度高，說明遠紅外處理水分含量較高的大米后，著色細胞數目增加。PI染色結果證明大米中水分含量越高，遠紅外處理后黃曲霉孢子的損傷越嚴重。這可能是由于高水分活度下微生物細胞膜對熱敏感性增強[21]，且報道指出磷酸緩沖液中大腸桿菌RNA、蛋白質和細胞壁對紅外加熱的耐受性較傳導加熱的熱效應更差[22]。

a、b-對照組，含水質量分數分別為20%、30%；c、d-FIR處理組，含水質量分數分別為20%、30%圖1 黃曲霉孢子PI染色結果Fig.1 The results of PI staining of A.flavus spores

2.3 遠紅外輻照對黃曲霉孢子顯微結構的影響

圖2顯示的是遠紅外輻照前后黃曲霉孢子的掃描電鏡圖。未處理前孢子呈球形，表面粗糙，形狀飽滿，輪廓分明；遠紅外處理后，孢子皺縮凹陷、部分嚴重破碎，胞內物泄露，這可能是因為遠紅外輻射引起的熱效應導致細胞膜出現孔洞或破損。紫外輻照和近紅外加熱相結合處理后鼠傷寒沙門氏菌與大腸桿菌的透射電鏡觀察結果顯示，2種病原體的細胞包膜被顯著破壞[23]。MEENU等[24]發現利用紅外處理綠豆表面的黑曲霉與黃曲霉孢子后，其形態變得更光滑，完全破裂，細胞內含物泄漏到表面。

a-未經FIR處理；b-20%+FIR；c-30%+FIR圖2 黃曲霉孢子掃描電鏡顯微圖Fig.2 Scanning electron microscope pictures of A.flavus spores

2.4 遠紅外輻照對黃曲霉孢子活力影響

MTT測定結果如表2所示，遠紅外115 ℃處理5 min后OD565下降，大米含水質量分數分別為20%和30%時，遠紅外對黃曲霉孢子的抑制率分別達到38.27% 和57.36%，結果表明孢子活力受抑制程度隨水分含量增加而增大。蛋白質的紅外吸收范圍在3～4 μm和6～9 μm[25]，在本研究波長范圍內對遠紅外有特定吸收，可引起其線粒體上琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)的變性，細胞呼吸受阻，活力降低甚至死亡[26]。國外相關研究報道近紅外輻射(850 nm)對大鼠中琥珀酸脫氫酶活性具有顯著調節作用[27]；遠紅外對小鼠黑素癌細胞的細胞活力有明顯毒性作用并致使其下降[28]。

表2 遠紅外輻照后OD565值與黃曲霉孢子活力抑制率Table 2 OD565 and inhibition rate of A.flavus spores′ viability after FIR treatment

2.5 遠紅外輻照對黃曲霉孢子胞內蛋白二級結構影響

黃曲霉孢子胞內蛋白各二級結構的相對含量變化曲線如圖3所示，圓色譜紫外區段(190～240 nm)的CD譜包含了生物大分子主鏈構象的信息，含水質量分數為30%時胞內蛋白在208、222 nm處呈強負吸收峰，反映了典型α-螺旋構象；β-折疊在217～218 nm處呈負峰，無規則卷曲在198 nm附近有1個負峰，在220 nm附近有正峰。

圖3 黃曲霉孢子胞內蛋白的CD圖Fig.3 Circular dichroism spectra of intracellular protein in A.flavus spores

各二級結構相對含量見表3，結果顯示含水質量分數為30%大米表面的黃曲霉孢子在FIR處理后，其胞內蛋白α-螺旋相對含量下降，β-折疊含量上升，β-轉角和無規則卷曲相對穩定，蛋白二級結構主要為α-螺旋向β-折疊轉變，且此過程不可逆，這與袁麗等[29]研究90 ℃ 加熱處理30 min后鰱肌球蛋白CD譜表示的二級結構變化規律相似。對含水質量分數為20%的大米，進一步研究FIR結合保溫處理對孢子胞內蛋白的作用，結果表明處理后α-螺旋構象相對含量低，變化幅度不大，β-折疊和β-轉角相對含量下降，柔性大的無規則卷曲含量上升；史曉霞等[30]同樣報道卵類黏蛋白隨熱處理溫度與時間增加，其有序結構向無規卷曲結構轉變增加。根據前面研究[11]，FIR處理后樣品表面溫度為(59.0±3.0)℃，FIR聯合保溫70 ℃ 處理15 min后表面溫度上升為(65.5±1.5)℃，這可能解釋了保溫階段由溫度導致的胞內蛋白肽鏈中的氫鍵斷裂及重組加劇而使胞內蛋白質變性加速的現象。

表3 黃曲霉孢子胞內蛋白各二級結構相對含量 單位：%

3 結論

本研究結果表明采用遠紅外輻照115 ℃ 處理5 min，黃曲霉孢子生長能力受限制，產毒能力下降明顯；且大米初始含水率越高，黃曲霉孢子熱損傷越嚴重。遠紅外輻照后孢子細胞膜、細胞形態和胞內蛋白等發生變化，表現為通透性下降，出現破損、坍塌凹陷和胞內物質泄露等現象；當結合保溫處理時，胞內酶等蛋白變性加速。本文初步探討了遠紅外作用下黃曲霉孢子熱損傷的機理，但未深入探討非熱效應對胞內細胞器與酶的作用。本文有望為遠紅外輻照殺滅大米中黃曲霉孢子與抑制其產毒能力的研究提供參考。