新疆傳統奶酪中產脂肪酶乳酸菌的優選及酶學特性研究

李曉楠，李宇輝，盧士玲*，王俊鋼，李寶坤，劉世琳

1(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832000)2(新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子，832000) 3(新疆農墾科學院農產品加工重點實驗室，新疆 石河子，832000)

新疆傳統奶酪也稱奶疙瘩，是哈薩克族牧民為解決剩余鮮奶，將牛奶經自然發酵、排乳清制成的奶制品，它基本排除了牛奶中的水分，具有鮮奶10倍的蛋白質和脂質，有“乳品黃金”之稱[1]。

有研究報道乳酸菌作為奶酪中的發酵劑已有3 600 年歷史[2]，目前市場中銷售的奶酪在發酵時幾乎都使用多種乳酸菌混合發酵，得到的產品不僅風味鮮美獨特且質地細膩。產脂肪酶的乳酸菌可對鮮奶進行發酵，在奶酪的成熟及后熟過程中分解脂肪從而影響脂肪酸的變化[3]。短中鏈游離脂肪酸由于其較低的閾值對奶酪風味貢獻很大，是多種揮發性化合物的前體物質，在奶酪成熟的各階段產生不同的風味[4]。白雪等[5]研究發現奶貝和酸奶經微生物脂肪酶處理后，檢測到氮氧化合物、硫化物、芳香成分和有機硫化物等含量均有增加，醛類、醇類、酸類、酮類化合物相對含量比未添加脂肪酶樣品的相對含量高。何捷等[6]從新疆牧區酸馬奶中篩選出1株產脂肪酶植物乳桿菌，其酶活力為8.54 U/mL。2019年景智波[7]從53株乳酸菌中篩選出1株高產脂肪酶的瑞士乳桿菌，最適反應溫度為35 ℃，屬于中度耐熱溫和型脂肪酶，將其應用于發酵羊肉香腸中，能夠顯著促進游離脂肪酸的釋放，改變了香腸中脂肪酸組分并提升風味，同時產酸性能較好，能快速降低水分活度、pH，抑制雜菌生長。

本文利用三丁酸甘油酯平板透明圈法結合銅皂法測酶活力，從傳統奶酪中篩選高產脂肪酶的乳酸菌，對其產酶特性及酶學性質進一步研究，為后續作為發酵劑在奶酪制品中的使用提供實驗數據支撐，同時為新疆傳統乳制品的現代化生產以及品質提升提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、培養基

1.1.1 原料

奶酪樣品來自伊犁地區、哈密地區、塔城地區。

1.1.2 試劑

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)-124、無水Na2CO3，西隴科學有限公司；橄欖油，嘉里糧油(天津)有限公司；無水乙醇，天津風船化學試劑科技有限公司；三丁酸甘油酯、TritionX-100，上海易恩化學技術有限公司；甲苯、冰乙酸，天津市鑫鉑特化工有限公司；1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，索萊寶(北京)科技有限公司；Tween 80、Tween 20，福晨(天津)化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養基及相關試劑的配制

富集培養基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺2 g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min；種子培養基：蛋白胨5 g，氯化鈉3 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min；分離培養基：種子培養基1 L、瓊脂20 g；發酵產酶培養基：硫酸銨1 g、硫酸鎂1 g、橄欖油乳化液12 mL、蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、磷酸氫二鉀1 g、蒸餾水1 L；初篩培養基：三丁酸甘油酯乳化液20 mL、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液980 mL、瓊脂20 g。

橄欖油乳化液的配制：準確稱取PVA-124 3.0 g，加入150 mL蒸餾水，室溫溶脹30 min后于95 ℃水浴溶解30 min至溶液透明后冷卻至室溫，加入橄欖油50 mL，用高速組織分散器處理20 min至混合液為乳白色的均勻乳化液，現配現用；三丁酸甘油酯乳化液的配制：用2%(質量分數)的PVA溶液配制2%(質量分數)的三丁酸甘油酯乳化液。

1.2 儀器與設備

22331 高速冷凍離心機，德國Eppendorf AG公司；核酸測定儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；HP1020凝膠成像系統、T100 RCE儀，美國Bio-Rad公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡，奧林巴斯(廣州)工業有限公司；EONC酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；UB-7 pH計，美國賽多利斯斯丹福公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高產脂肪酶乳酸菌的分離篩選及鑒定

1.3.1.1 樣品乳酸菌的分離

參照ZHENG等[8]的實驗方法。將奶酪樣品在無菌條件下用研缽研碎并充分混勻，取10 g于100 mL富集培養基中37 ℃，150 r/min搖床富集24 h。吸取1 mL富集后菌液于9 mL無菌生理鹽水中進行梯度稀釋，移液槍吸取10-4、10-5、10-6梯度200 μL菌液于MRS瓊脂培養基上均勻涂布，每個梯度做3個平行，37 ℃恒溫培養48 h，挑取疑似乳酸菌且形態不同的單菌落多次平板劃線，至顯微鏡觀察為純種菌落，進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，將革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶呈陰性菌株暫定為乳酸菌，并進行菌落及細胞形態的記錄，用50%(體積分數)的甘油溶液于-80 ℃冰箱保藏備用。

1.3.1.2 高產脂肪酶乳酸菌的初篩

參照ESTEBAN-TORRES等[9]的實驗方法并做適當修改。將樣品中篩選出暫定為乳酸菌的菌株于種子培養基中培養至對數期，移液槍吸取100 μL菌液注入三丁酸甘油酯瓊脂培養基上的牛津杯中，37 ℃培養3～5 d，觀察是否具有透明圈并記錄直徑，選擇透明圈直徑較大的菌株進行生物學鑒定及復篩。

1.3.1.3 高產脂肪酶乳酸菌生物學鑒定

使用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取菌株DNA，并檢測其純度，以便后續使用。

PCR擴增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)；擴增體系(50 μL)為2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補足50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環34次，最后72 ℃ 延伸10 min。

由上海生工生物科技有限公司進行16S rDNA測序，測序結果經NCBI數據庫中進行Blast序列同源性比對，用MAGE 7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.1.4 高產脂肪酶乳酸菌的復篩

參考江慧芳等[10]的方法并做適當修改。將初篩得到的產生透明圈較大且16S rDNA鑒定為乳酸菌的菌株進行脂肪酶活力測定。脂肪酶活性單位定義：37 ℃中1 mL酶液1 min水解橄欖油生成1 μmol脂肪酸為1個酶活單位。

1.3.1.5 粗酶液的制備

將篩出的產酶優良的乳酸菌接種于10 mL種子培養基，37 ℃培養24 h，按2%的接種量接種至10 mL 發酵培養基中，37 ℃培養48 h得到發酵液，參照董娟[11]的方法對粗酶液進行提取。

1.3.1.6 脂肪酶活力的測定

使用脂肪酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)測定脂肪酶活力。計算如公式(1)所示：

(1)

式中：T，催化反應時間；m，發酵液稀釋倍數。

1.3.2 高產脂肪酶乳酸菌產酶特性研究

1.3.2.1 培養時間及溫度對菌株產脂肪酶的影響

將目標菌接種于10 mL 種子培養基中，37 ℃培養24 h后，按2%的接種量轉接至發酵培養基中，于不同溫度(25、30、35、37、40、45 ℃)下180 r/min搖床培養，每12 h于710 nm處測定吸光值，每組測3個平行取平均值。

1.3.2.2 培養基初始pH值對菌株產脂肪酶的影響

參考劉延波等[12]的方法做少量修改。將目標菌接種于10 mL 種子培養基中，37 ℃培養24 h，按2%的接種量轉接至發酵培養基中，將發酵培養基pH值分別調節為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在37 ℃培養48 h后測定酶活力，每組測3個平行。

1.3.2.3 接種量對菌株產脂肪酶的影響

參考胡珺等[13]的實驗方法并做適當修改。將目標菌接種在種子培養基中于37 ℃培養24 h，分別按0.5%、1%、2%、4%、6%的接種量在50 mL發酵培養基中37 ℃培養48 h后測酶活力。

1.3.2.4 不同表面活性劑對菌株產脂肪酶的影響

參考ZHANG等[14]的方法并做少量修改。將乳酸菌接種于種子培養基，37 ℃培養24 h，按2%的接種量轉接至分別添加10%(體積分數)Tween 80、Tween 20、Trition X-100、PVA的發酵培養基中，以不添加表面活性劑的培養基為空白對照，將最高酶活記為100%，在37 ℃培養48 h后計算每組相對酶活，每組測3個平行。

1.3.3 脂肪酶酶學性質的研究

1.3.3.1 不同溫度對脂肪酶的影響

將制備好的酶液分別在10～60 ℃下保溫20 min后測定酶活力，每個溫度測3個平行。

1.3.3.2 pH值對脂肪酶的影響

參照TURATI等[15]的方法并做適當修改。將酶液pH值調節為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在最適條件下保溫30 min后測定酶活力，每組測3個平行。

1.3.3.3 不同金屬離子和抑制劑對脂肪酶的影響

在制備好的酶液中分別加入5和10 mmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、EDTA，在最適條件下保溫20 min后測定酶活力，將未添加金屬離子的酶液活力記為100%，計算相對酶活力以確定不同金屬離子及抑制劑對脂肪酶活力的影響。

1.4 數據與處理

上述實驗數據使用SPSS 22.0分析，用Origin 8.5作圖，每組實驗均設置3個平行且測定3次，數據結果采用均值±標準差形式，數據分析當P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶乳酸菌的篩選

目前，已有報道從土壤、污水、食堂廢棄物等環境中分離產脂肪酶的霉菌[16-17]，而對來自食品中乳酸菌產脂肪酶的研究并不多。本實驗從奶酪樣品中分離到282株純培養物，經革蘭氏染色、酶觸實驗將267株暫定為乳酸菌。初篩有35株菌產生明顯透明圈，其中T1-3、T1-5、B2-5產透明圈較大，直徑最大為15.6 mm。具體結果如表1。

表1 產脂肪乳酸菌篩選結果Table 1 Screening results of fat producing lactic acid bacteria

根據脂肪酶標準曲線制作方法，得出油酸標準工作曲線線性回歸方程為y=0.007 8x+0.012 1，線性相關系數R2=0.999 7，線性關系較好。利用銅皂法對初篩的35株菌進行酶活力測定，結果顯示B2-5、T5-16、H1-6具有較高的酶活力。綜合初篩和復篩結果，后續實驗選擇T1-3、T1-5、H1-6、B2-5進行產酶特性及酶學性質的研究。

2.2 乳酸菌的鑒定

將篩選出的35株產透明圈較大菌株進行16S rDNA鑒定，確定35株均為乳酸菌。結合透明圈直徑和酶活確定T1-3、T1-5、H1-6、B2-5產脂肪酶較好，菌落形態及革蘭氏染色后細胞形態如圖1所示。通過16S rDNA基因檢測分析，B2-5與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高(100%)；T1-5和T1-3與融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)同源性最高(100%)；H1-6與瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)具有100%同源性。

目前用于奶酪發酵的乳酸菌多為植物乳桿菌、發酵乳桿菌、瑞士乳桿菌等，魏斯氏菌是發酵豆制品、發酵肉制品中常見的乳酸菌，而其作為乳品中產脂肪酶乳酸菌的研究鮮有報道[18]。有研究表明[19]魏斯氏菌具有一定的耐人工腸液和降膽固醇的益生特性，且具有較好的耐酸耐膽堿鹽性質，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有明顯抑制效果。

a-菌落形態；b-革蘭氏染色后細胞形態圖1 高產脂肪酶菌株的菌落形態和細胞形態Fig.1 Colony morphology and cell morphology of the high-producing lipase strain

2.3 產脂肪酶乳酸菌的產酶特性分析

2.3.1 培養溫度對菌株產脂肪酶的影響

溫度是微生物生長代謝的重要影響因素之一，圖2顯示隨著溫度的上升，菌株產酶能力逐漸增強，B2-5 和H1-6在37 ℃產生脂肪酶活力最高，T1-3和T1-5在35 ℃產酶效果最好。之后隨著溫度的上升產酶活力均有所下降，B2-5產酶能力受溫度影響較大，但較其他3株菌產酶活力高，最適溫度可達3.85 U/mL。

圖2 培養溫度對菌株產脂肪酶的影響Fig.2 Influence of culture temperature on lipase production by strains

2.3.2 培養時間對菌株產脂肪酶的影響

圖3為培養時間對菌株產酶的影響，當培養時間為36 h時，H1-6、B2-5產酶活力最高，分別為2.65、4.26 U/mL，培養時間過長，發酵液酶活力明顯下降(P<0.05)，發酵72 h菌株B2-5的酶活力僅為最高點的42.78%；T1-5、T1-3在發酵48 h達到最大酶活力分別為1.98、2.02 U/mL，隨后緩慢下降至 1.27 U/mL 左右。

圖3 培養時間對菌株產脂肪酶的影響Fig.3 Influence of culture time on lipase production by strains

2.3.3 培養基初始pH值對菌株產脂肪酶的影響

4株乳酸菌的產酶能力隨發酵液初始pH的增大呈現先升高后降低的趨勢(圖4)，當初始pH=7時，T1-3和B2-5產酶活力最高，B2-5酶活力可達4.02 U/mL；當pH>7時，酶活力大幅下降(P<0.05)，因此中性環境更適合T1-3、B2-5發酵產酶。發酵液初始pH值為6時，菌株T1-5和H1-6達到最大酶活力，此時酶活力分別為2.81、2.48 U/mL，之后隨著pH值的增大，產酶效果迅速下降。景智波等[20]研究在發酵培養基初始pH值為6時，目標乳酸菌具有最大酶活，這與本研究結果較為相似。

圖4 培養基初始pH值對菌株產脂肪酶的影響Fig.4 Effect of the initial pH on lipase production by the strain

2.3.4 不同接種量對菌株產脂肪酶的影響

微生物接種量適宜有利于在較短發酵時間內獲得足夠的菌體量，利于產酶，如果接種量過少，菌體生物量增長緩慢，則會延長發酵周期；反之又會導致菌體增長過快，代謝產物增多，培養基黏度增大，致使溶氧不足等問題，不利于產酶[11]。本實驗中4株乳酸菌產酶受接種量的影響見圖5，當接種量為4%，B2-5產酶活力最高；接種量為2%，T1-3、T1-5和H1-6產生的酶活力可達最大值，證明該接種量最利于菌株產酶，這與張晶晶等[21]研究結果比較相似。

圖5 不同接種量對菌株產脂肪酶的影響Fig.5 Effect of different inoculum on lipase production by strains

2.3.5 不同表面活性劑對菌株產脂肪酶的影響

不同表面活性劑對4株產酶乳酸菌的影響如圖6所示，在添加PVA后菌株產酶活力均提高了30%～40%不等，確定PVA為最佳表面活性劑。與對照組相比，Tween 80、Tween 20、Triton X-100的添加對4株乳酸菌產酶能力均有不同程度的抑制作用，Tween 80的抑制作用最明顯，其次是Triton X-100，這與CORZO等[22]的研究結果較不同，可能是由產酶菌株不同而導致的。

圖6 不同表面活性劑對菌株產脂肪酶的影響Fig.6 Effects of different surfactants on lipase production by strains

2.4 菌株脂肪酶的酶學性質

2.4.1 溫度對脂肪酶活力的影響

4株乳酸菌所產脂肪酶活力分別在35、40 ℃達到了峰值(圖7)，B2-5的脂肪酶活力在40 ℃約為5.02 U/mL；菌株T1-5、H1-6、T1-3的酶活力與各自最低點相比分別提高了約145%、126%和146%，當環境溫度高于最適溫度時，酶活力大幅度下降(P<0.05)。張傳麗等[23]相關研究中得到脂肪酶最適催化溫度為50 ℃，當溫度升高至90 ℃時，酶活力僅為最高點的20%，這一變化趨勢與本研究結果相似。綜上所述，4株乳酸菌所產的脂肪酶均屬于中溫脂肪酶。

圖7 溫度對脂肪酶活性的影響Fig.7 Effect of temperature on lipase activity

2.4.2 不同pH值對脂肪酶活力的影響

乳酸菌的大量繁殖會使環境pH降低，因此確定脂肪酶的耐酸性十分重要[24]。由圖8可知，菌株H1-6和B2-5的脂肪酶在pH值為6時活力最高，分別為3.12、4.89 U/mL；當pH>6時酶活力迅速下降(P<0.05)。融合魏斯氏菌T1-3和T1-5的脂肪酶最適作用pH值為5；環境pH>5時酶活力明顯受到抑制。而郭冉冉[25]在酶學性質研究中發現產酶菌株酶活力隨pH增大逐漸上升，在pH=9.0達到極值，這可能是樣品來源、產酶菌株不同導致脂肪酶之間存在差異。總體來看4株乳酸菌產生的胞外脂肪酶在酸性環境下均有良好的酶活力，具備較好的耐酸能力，屬于酸性脂肪酶。

圖8 不同pH值對脂肪酶活性的影響Fig.8 Effect of different pH on lipase activity

2.4.3 不同金屬離子及抑制劑對脂肪酶活力的影響

食品中通常會由于生產加工或自身因素而含有一些金屬離子，如肉制品加工過程中會使用含Na+、K+、Mg2+的鹽，牛乳中富含K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Na+，且會因氣候、飼料、動物健康情況發生變化[26]。因此本實驗將5、10 mmol/L的不同金屬離子及EDTA抑制劑添加到發酵培養基中，由表2和表3可知，K+、Na+、Fe2+、Mn2+對4株乳酸菌脂肪酶均有明顯促進作用(P<0.05)，與對照組相比，Fe2+和K+顯著提高2株融合魏斯氏菌的酶活力(P<0.05)，在5 mmol/L Na+、Mn2+存在的情況下， B2-5脂肪酶活力分別提高了約15%和17%，將離子濃度升高為10 mmol/L時，酶活力繼續提高；同樣地，5 mmol/L的Mn2+使H1-6的酶活力提高了約22%；Mn2+也可刺激T1-3和T1-5的脂肪酶活力有所提升，TURATI等[15]研究表明Mn2+不僅可以顯著提高脂肪酶活力，還能夠獲得較高的穩定性。

表2 5 mmol/L不同金屬離子及抑制劑對脂肪酶活力的影響Table 2 Effects of 5 mmol/L different metal ions and inhibitors on lipase activity

表3 10 mmol/L不同金屬離子及抑制劑對脂肪酶活性的影響Table 3 Effects of 10 mmol/L different metal ions and inhibitors on lipase activity

相反，與對照組相比，Cu2+、Al3+、Fe3+和EDTA的存在對脂肪酶活力有著不同程度的顯著抑制作用(P<0.05)，10 mmol/L Al3+可抑制B2-5脂肪酶約65%的活性；Cu2+無論濃度高低均能抑制H1-6約50%的酶活，這與周晶[27]的研究結果相似；Ca2+和Mg2+的存在對脂肪酶活力影響較小；KRETZA等[28]研究發現Zn2+對脂肪酶活力有輕微抑制作用，與本文結果相似。

3 結論

本研究利用傳統培養法結合三丁酸甘油酯平板法和銅皂法從267株乳酸菌中篩選出4株高產脂肪酶乳酸菌，分別為B2-5(L.plantarum)、T1-5(W.confusa)、T1-3(W.confusa)、H1-6(L.helveticus)。

結果表明PVA是促進4株乳酸菌產脂肪酶的最佳表面活性劑，在35～40 ℃的中酸性初始培養基中產酶效果最好。接種量對乳酸菌產酶影響實驗中發現，當接種量為4%時，B2-5產生的酶活力最高；接種量為2%時，T1-3和T1-5、H1-6的酶活力可達峰值。

在酶學特性分析實驗中，35～40 ℃為脂肪酶最適催化環境，4株乳酸菌所產脂肪酶均為酸性脂肪酶，K+、Na+、Fe2+、Mn2+的存在對脂肪酶活力有明顯提升(P<0.05)，而Cu2+、Al3+能明顯抑制其活力。

總體來看，W.confuseT1-3和T1-5對產酶環境的耐受性較好，L.plantarumB2-5在37 ℃，以2%的接種量于初始pH值為7且添加了PVA為表面活性劑的發酵培養基中發酵48 h后，產生的脂肪酶活力可達5.29 U/mL，產脂肪酶能力最強。滿麗莉等[29]從內蒙古酸馬奶中分離出的L.plantarumMXG-68對Caco-2細胞的黏附率高達64%，且對多種抗菌藥物均表現敏感性，能夠耐受極端環境壓力、抑制腸道致病菌。因此植物乳桿菌和融合魏斯氏菌可作為發酵乳品中潛在益生菌，應用前景廣闊。