大腸埃希氏菌(Escherichia coli)用于食品檢驗培養基質量控制的研究

劉佳奇，都海渤，陳怡文，張彩文，辛迪，石靚，李金霞，崔生輝，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(中國食品藥品檢定研究院，北京，100050)

食品微生物檢驗是保證食品安全的重要措施，在檢驗過程中，需根據不同微生物種屬的特點選擇對應的培養基進行檢測,因此培養基及試劑的質量控制尤為重要。早在20世紀80年代，國際食品微生物學和衛生學委員會培養基工作組(The International Committee for Food Microbiology and Hygiene，ICFMH)、國際標準化組織(International Standards Organization，ISO)、食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)相繼建立了完整的培養基質控體系[1-3]。近年來，國家頒布的各類標準都對培養基的質量控制制定了嚴格規定[4-8]。GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》提出用測試菌株來評價培養基的微生物性能指標，測試菌株是具有其代表種的穩定特性并能有效證明特定培養基最佳性能的一套菌株，主要購于標準菌種保藏中心，也可以是實驗室自己分離的具有良好特性的菌株。此外，測試菌株最好使用從食品或水中分離的菌株[9]。

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)屬于革蘭氏陰性短桿菌，是食源性疾病的主要病原菌之一。該菌作為常用質控菌株，已被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等多個領域[10-12]。GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D中，僅推薦了1株大腸埃希氏菌ATCC 25922，涉及評價6類共58種培養基的質量。質控實驗室在驗收培養基時，可采用多株特性良好的菌株進行質控。CICC 24652和CICC 24176為我國公開保藏菌株，分類學地位明確，分別來源于果仁菠菜和地表水。以這2株測試菌株為代表，考察其對培養基的靈敏度和指示能力，以期為國標中大腸埃希氏菌的補充或替換提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

E.coliCICC 24176、CICC 24652保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心，E.coliATCC 25922來源于美國典型菌種保藏中心。

1.2 培養基及試劑

營養瓊脂(nutrient agar，NA)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)、平板計數瓊脂(plate count agar，PCA)、麥康凱瓊脂(macconkey agar，MAC)、伊紅美藍瓊脂(eosin-methylene blue agar，EMB)、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar，VRBA)、HE瓊脂(hektoen enteric agar，HE)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate agar，XLD)、亞硫酸鉍瓊脂(bismuth sulfite agar，BS)、李氏增菌肉湯(Listeriaenrichment broth base，LB1，LB2)、EC肉湯(E.Colibroth，EC)、三糖鐵瓊脂、尿素瓊脂(pH 7.2)、月桂基磺酸鹽胰蛋白胨肉湯(lauryl sulfate tryptose broth，LST)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(brilliant green lactose bile broth，BGLB)、腦心浸液、MUG-LST、氧化酶試劑等，北京陸橋技術股份有限公司；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine broth，SC)、黏液酸發酵管，廣東環凱微生物科技有限公司；緩沖動力硝酸鹽發酵管，青島海博有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 非選擇性分離和計數固體培養基生長率定量測試方法

測試菌株與對照菌株分別制備濃度為200～2 000 CFU/mL的菌懸液，接種量為0.1 mL，均勻涂布于待測平板和TSA參比平板，每一稀釋度接種2個平板。待測培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，NA、TSA在(36±1)℃培養24 h，PCA在(36±1)℃培養48 h。以生長率≥0.7為指標考察2株測試菌株的生長能力。生長率按公式(1)計算：

(1)

式中：PR,生長率；NS,待測培養基平板上得到的菌落總數；N0,參比培養基平板上獲得的菌落總數。

1.3.2 選擇性分離和計數固體培養基的測試方法

1.3.2.1 生長率定量測試方法

工作菌懸液制備及接種方法同1.3.1，培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，MAC、EMB、VRBA、VRB-MUG瓊脂均在(36±1)℃培養24 h。對照ATCC 25922，以生長率及菌落特征為指標考察測試菌株的生長能力，要求菌株在選擇性分離培養基上的生長率≥0.5，最低為0.1；在選擇性計數培養基上的生長率≥0.7，特征反應與對照菌株表現一致。

1.3.2.2 (選擇性)半定量測試方法

測試菌株與對照菌株分別接種于BHI肉湯，36 ℃培養18 h。用1 μL接種環取1環，在測試培養基上劃6條平行直線，同時接種2個平板。培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養基、BS均在(36±1)℃培養48 h；改良CCD(modified CCD,mCCD)瓊脂、Skirrow瓊脂、Baird-Parker瓊脂均在(42±1)℃培養48 h；甘露醇卵黃多粘菌素(mannitol egg yolk polymyxin，MYP) 瓊脂在(30±2)℃培養48 h，其余培養基均在(36±1)℃培養24 h。對照ATCC 25922，以生長指數G<5為指標考察測試菌株生長能力。

生長指數G的計算方法是觀察平板上6條線的生長情況，有比較稠密菌落生長的劃線G為1，每個培養皿最多為6分。如果僅一半的線有稠密的菌落生長，則G為0.5。如果劃線上沒有菌落生長、生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱，則G為0。

1.3.2.3 (特異性)定性測試方法

工作菌懸液制備方法同1.3.2.2。用1 μL接種環取1環，分別在測試培養基表面四區劃線。培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，沙門氏菌顯色培養基、CT-SMAC、O157顯色培養基、志賀氏菌顯色培養基、阪崎克羅諾桿菌顯色培養基均在(36±1)℃培養24 h；CIN-1、改良Y培養基均在(26±1)℃培養48 h。對照ATCC 25922，以典型菌落特征為指標考察測試菌株在不同培養基的特征反應能力。

1.3.3 選擇性增菌培養基的半定量測試方法

測試菌株與對照菌株分別制備濃度為1 000～5 000 CFU/mL的菌懸液。接種1 mL菌液至10 mL增菌培養基中，2個平行管，同時傾注TSA平板確定接種量。培養后吸取10 μL培養液，均勻涂布TSA平板，每管接種1個平板。培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，LB1，LB2在(30±1)℃培養24 h，改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素在(44±0.5)℃培養24 h；其余培養基均在(36±1)℃培養24 h。對照ATCC 25922，以培養后菌落數<100 CFU為指標考察測試菌株對選擇性增菌培養基的識別能力。

1.3.4 選擇性液體計數培養基的半定量測試方法

測試菌株與對照菌株分別制備濃度為10～100 CFU/mL的工作菌懸液。接種1 mL菌液至10 mL的培養基中，同時傾注TSA平板確定接種量，培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，LST、BGLB在(36±1)℃培養48 h；EC肉湯在(44.5±0.2)℃培養48 h。對照ATCC 25922，以培養后液體培養基生長濁度達到2為指標考察測試菌的生長能力。

1.3.5 懸浮培養基的定量測試方法

測試菌株與對照菌株分別制備濃度為100～1 000 CFU/mL的工作菌懸液。接種1 mL菌液至10 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)測試培養基中，2個平行管，混勻后每管取1 mL懸液傾注TSA平板，進行菌落計數。剩余已接種菌液的PBS培養基置(20～25)℃放置45 min后，再每管吸取1 mL傾注TSA平板。對照ATCC 25922，以放置后菌落數的變化程度在±50%為指標考察測試菌在PBS培養基中的穩定能力。

1.3.6 鑒定培養基測試

測試菌株與對照菌株分別接種BHI肉湯和TSA培養基，36 ℃培養18 h。培養基及培養條件見GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D，醋酸鹽利用試驗、黏液酸利用試驗均在(36±1)℃培養48 h；含鐵牛乳培養基在(46±0.5)℃培養2 h與5 h均觀察；明膠培養基在(36±1)℃培養72 h；酪蛋白瓊脂在(30±1)℃培養24 h；氧化酶試劑直接觀察結果；其余培養基均在(36±1)℃培養24 h。對照ATCC 25922，以典型菌落特征為指標考察測試菌株在不同鑒定培養基上的生長情況。

2 結果與分析

2.1 非選擇性分離和計數固體培養基生長率定量測試結果

生長率能客觀地、量化地評估培養基對目標菌生長繁殖的影響[13]，菌株生長率越高說明培養基對目標菌的促生長能力越強。GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D中，大腸埃希氏菌質控的非選擇性固體培養基有營養瓊脂NA、TSA和PCA，要求菌株生長率≥0.7，即培養基質量合格，因此，需要確認測試菌株在該類培養基上的生長能力。

NA、TSA和PCA作為通用培養基，適合大部分微生物的生長。測試菌株在該類培養基上的生長情況見表1，CICC 24176在3種培養基上生長率≥1.0，CICC 24652的生長率≥0.9，對照菌株ATCC 25922的生長率≥0.9。結果表明，2株測試菌生長能力良好，可用于該類培養基的定量質控。

2.2 選擇性分離和計數固體培養基的測試結果

2.2.1 生長率定量測試結果

GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D中，大腸埃希氏菌質控的選擇性分離和計數培養基有MAC、EMB、VRBA和VRB-MUG瓊脂，這些培養基均用于大腸菌群的檢測。標準要求大腸埃希氏菌作為目標菌，在選擇性分離培養基上的生長率≥0.5，最低為0.1；在選擇性計數培養基上的生長率≥0.7，即培養基質量合格。因此，需要確認測試菌株在該類培養基上的生長能力及特征反應。

由表2和圖1可知，測試菌株在4種培養基上的生長率均≥0.8，菌落特征也與ATCC 25922表現一致。說明測試菌株生長能力良好，菌落特征明顯，可用于該類培養基的定量質控。

A1～D1、A2～D2、A3～D3分別為ATCC 25922、CICC 24176和CICC 24652在4種培養基的菌落特征；培養基A～D依次為MAC、EMB、VRBA和VRB-MUG圖1 菌株在4種培養基上的菌落特征Fig.1 Characteristic reactions of strains on four medium

表2 生長率定量測試結果Table 2 Result of growth rate quantitative test

2.2.2 半定量(選擇性)測試結果

選擇性培養基是一類支持目標菌生長而抑制非目標菌生長的培養基，通過生長指數G來反映結果，G值越低，說明培養基對非目標菌的選擇性越強。GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D將大腸埃希氏菌作為非目標菌評價培養基的選擇性，要求生長指數G≤1，至少應達到<5。因此，需要確認測試菌株在該類培養基上的生長能力。

大腸埃希氏菌涉及評價13種選擇性培養基，由表3可知，測試菌株呈現弱生長或被完全抑制。菌株CICC 24176在HE、XLD培養基的生長指數G=2，其余培養基生長指數G≤1。菌株CICC 24652僅在HE培養基的生長指數G=1.5，其余培養基生長指數G≤1。對照菌株ATCC 25922在HE、XLD培養基的生長指數1

表3 半定量(選擇性)測試結果Table 3 Result of semi-quantitative(selective)test

2.2.3 定性(特異性)測試結果

特異性培養基是一類通過顯色反應區分目標菌和非目標菌的培養基，比如顯色培養基是根據目標菌的一種或多種特異性的酶水解顯色底物使菌落本身顯色從而快速篩選目標菌的方法，而非目標菌通常會呈現其他顏色或被抑制[14-15]。國標要求大腸埃希氏菌作為非目標菌，應呈現相應的菌落特征。因此，需要確認測試菌株的指示能力。

參照產品說明，阪崎克羅諾桿菌顯色培養基使用說明為阪崎腸桿菌顯藍綠色，其他腸桿菌無色或被抑制；改良Y和CIN-1培養基用于分離小腸結腸炎耶爾森氏菌；CT-SMAC用于大腸桿菌O157的分離培養；志賀氏菌顯色培養基用于志賀氏菌的顯色培養，應為白色，清晰的菌落，周圍培養基紫紅色，其他菌為黃色、藍綠色或被抑制。由表4和圖2可知，2株測試菌株在以上培養基上的特征反應均與ATCC 25922無差異。沙門氏菌在沙門氏菌顯色培養上顯紫色，其他菌為藍綠色、無色或不生長。2菌株顯色表現均為非沙門菌的特征，但CICC 24176菌落為白色，CICC 24652生長菌落為藍綠色，ATCC 25922菌落亦為藍綠色；O157顯色培養基用于O157菌的顯色培養，菌落顯(淡)紫紅色，其他菌為無色、藍綠色或不生長。CICC 24176在此培養基上被抑制未生長，CICC 24652菌落為淺灰色，而ATCC 25922同樣被抑制，僅在平皿一區生長了藍綠色單菌落。不同菌株引起的特異性酶反應不同是產生菌株顯色差異的主要原因。綜上可知，2株測試菌株在部分培養基上存在生長特性的差異，但均是非目標菌的特征，可用于該類培養基的定性質控。

表4 定性(特異性)測試結果Table 4 Result of qualitative(specificity)test

2.3 選擇性增菌培養基測試結果

選擇性增菌培養基是能夠允許特定微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生長的培養基。GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D中，大腸埃希氏菌作為非目標菌涉及對9種選擇性增菌培養基進行評價，要求菌株培養后菌落數應<100 CFU，即培養基合格。因此，需要考察測試菌株在該類培養基上的被抑制程度。

A1～G1、A2～G2、A3～G3分別代表菌株ATCC 25922，CICC 24176，CICC 24652的菌落特征;培養基A～G順序依次為阪崎克羅諾桿菌顯色、CIN-1、CT-SMAC、改良Y、志賀氏菌顯色、沙門氏菌顯色和O157顯色培養基圖2 特異性培養基上的菌落特征Fig.2 Characteristic reactions of strains on specific medium

由表5可知，菌株CICC 24652在9種培養基上生長均被有效抑制，與ATCC 25922表現一致，菌落數<100 CFU。CICC 24176在8種培養基上表現與ATCC 25922一致，僅在SC上培養后菌落數超過100 CFU。SC培養基可對傷寒及其他沙門菌做選擇性增菌，其中的亞硒酸鹽有劇毒，可抑制非沙門氏菌的大多數革蘭氏陰性腸道菌，而菌株CICC 24176未被抑制，說明該菌對亞硒酸鹽的毒性不敏感，這可能與該類菌具有某些特異性酶有關[13]。

表5 選擇性增菌培養基測試結果Table 5 Result of selective enrichment medium test

2.4 選擇性液體計數培養基測試結果

BGLB、LST肉湯均用于大腸菌群、大腸桿菌的測定；EC肉湯液體培養基用于糞大腸菌群、大腸桿菌的測定。 GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》規定用目測的濁度值評估結果，0表示無渾濁，1表示很輕微混濁，2表示嚴重混濁。要求大腸埃希氏菌作為目標菌，培養后濁度值應為2，產氣應為1/3或以上，培養基才合格。因此，需要考察測試菌株在此類培養基上的生長能力。

由表6可知，測試菌株在3種肉湯液體培養基生長濁度均為2，產氣情況為1/3，與ATCC 25922表現一致，可用于選擇性液體計數培養基的質量評價。

表6 選擇性液體計數培養基測試結果Table 6 Result of selective liquid counting medium test

2.5 懸浮培養基測試結果

PBS用于菌落總數，大腸菌群，金黃色葡萄球菌的樣品制備。GB 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D要求大腸埃希氏菌在PBS中放置45 min前后菌落數變化在±50%，即培養基合格。因此，需要確認測試菌株在PBS中的穩定情況。

由表7可知，測試菌株的菌落數變化程度均<10%，ATCC 25922菌落數變化為20%，說明測試菌株的穩定性更好，可用于懸浮培養基的質量評價。

表7 懸浮培養基測試結果Table 7 Result of suspension medium test

2.6 鑒定培養基及試劑測試結果

GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》附錄D中大腸埃希氏菌共質控18種鑒定培養基，因此，需要確認測試菌株在相應培養基上的典型特征。由表8可知，菌株CICC 24176在18種鑒定培養基上呈現典型特征且與ATCC 25922一致，菌株CICC 24652在16種鑒定培養基上呈現典型特征且與ATCC 25922一致。由圖3可知，菌株CICC 24652沒有動力，在SIM(hydrogen sulfide indole motility)動力及緩沖動力硝酸鹽培養基實驗中表現為陰性。

表8 鑒定培養基測試結果Table 8 Result of identification medium test

從左至右菌株順序為空白，ATCC 25922，CICC 24176，CICC 24652a-SIM動力；b-緩沖動力硝酸鹽圖3 SIM和緩沖動力硝酸鹽實驗結果Fig.3 Test on SIM and buffer power nitrate

3 結論與討論

通過研究測試菌株E.coliCICC 24176和CICC 24652在6類58種培養基上的生長特性，評估菌株質控食品檢驗培養基的適用性。2株測試菌分別在非選擇性分離和計數固體培養基、選擇性分離和計數固體培養基、選擇性增菌培養基、選擇性液體計數培養基、懸浮培養基和鑒定培養基上呈現各自特點。CICC 24176在57種培養基上呈現典型生長特性且與ATCC 25922表現一致，CICC 24652在56種培養基上呈現典型生長特性且與ATCC 25922表現一致，二者可分別用于評價相應培養基的微生物指標。本研究結果對補充新的大腸埃希氏菌質控菌株具有很好的借鑒意義。

研究發現，測試菌株雖然都是大腸埃希氏菌，但不同菌株間特性差異明顯，在驗證SC培養基時，大腸作為非目標菌生長應被抑制，但菌株CICC 24176未受影響。SC培養液中的亞硒酸鹽并不能抑制所有大腸，有文獻報道，某些菌株具有較高的超氧化物歧化酶活性可以抵抗亞硒酸鹽的毒害作用[16]。同時本研究發現菌株CICC 24652無動力特性，鞭毛是細菌的運動器官，約50%左右的大腸埃希氏菌有鞭毛[17]，而動力特性與菌株鞭毛的個數、長短及培養條件均有關[18-20]。后續將對這2株菌的相應特征進行深入研究，探究其中的機理。BARTL[21]在1985年曾提出用于培養基測試的質控菌株既要選擇具有典型生長特性的菌株，也要兼顧呈現差異性生長的非典型菌株。本研究結果也證實了菌株水平間的差異，建議質控實驗室使用多株菌對培養基質量進行驗收，從而提高實驗結果的可靠性。